Modificação Multi-Escala de implantes metálicos com gradientes de poros, polieletrólitos e sua monitorização indirecta In vivo

O objetivo geral deste procedimento é modificar implantes metálicos em várias escalas de comprimento para controlar o comportamento celular in vitro e in vivo. Isso é feito primeiro produzindo um gradiente de tamanho de poro dentro de implantes tubulares tridimensionais, método de extração por biocongelamento. O segundo passo é desenvolver imitadores de membrana basal nanofibrilar com base na metodologia de colágeno e alginato camada por camada.

Em seguida, um método indireto para monitorar esses implantes após a implantação usando análise de plasma sanguíneo. A HPLC e o sequenciamento subsequente de peptídeos são demonstrados, em última análise, como um implante em que diferentes áreas podem acomodar diferentes tipos de células, conforme necessário. Para alguns tecidos multicelulares podem ser obtidos Embora este sistema possa fornecer uma maneira de modificar implantes metálicos.

Também pode ser aplicado a sistemas de modelo de cultura de células 3D, como tecidos artificiais ou modelos de doenças. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando estávamos tentando encontrar uma técnica para controlar o movimento celular em torno de implantes de titânio poroso in vivo. Para iniciar este procedimento, limpe os implantes e projete e fabrique moldes de Teflon conforme descrito no texto escrito para congelamento e extração.

Preparar a solução de polímero sintético PLLA numa mistura binária de dioxina e água, introduzindo o pó de polímero no solvente orgânico. Em um Starr magnético, aqueça a mistura a 60 graus Celsius para obter uma solução homogênea. Esta temperatura é selecionada porque é o limite superior da resistência à temperatura para as seringas de vidro de precisão a serem usadas para a introdução da solução nos implantes.

Enquanto isso, calcule o volume da solução polimérica necessária em relação à porosidade do implante, levando em consideração a mudança no volume da solução congelada. Em seguida, introduza a solução nos implantes usando seringas de vidro de precisão com precisão de 0,1 microlitro. O limite inferior para a concentração do polímero é de 3% para a formação de gradiente PO reprodutível ou, à medida que se torna difícil obter uma distribuição homogênea nas amostras espessas acima de 6%, congele as amostras diretamente a 80 graus Celsius negativos ou com um período de incubação prévio de 30 minutos à temperatura ambiente.

As condições de congelamento determinam parcialmente a formação dos poros. Assim, as condições de congelamento podem ser ajustadas de acordo com a porosidade pretendida. Mantenha as amostras durante a noite a menos 80 graus Celsius.

A separação do molde no estado congelado é uma etapa muito difícil. Deve-se tomar cuidado para diminuir o contato da solução de fundo congelada com o molde, com a ajuda de um couro cabeludo, Mergulhe os implantes em etanol pré-resfriado a 80% para obter gradientes de porosidade. Use um bisturi pré-resfriado para remover todas as peças do molde, exceto o mandril, para os implantes tubulares e todas as peças, exceto a parte inferior para implantes em forma de disco, faça a extração a menos 20 graus Celsius durante a noite.

Após a extração, remova as peças restantes do molde e seque os implantes ao ar. Para caracterização da porosidade geral da estrutura. A análise do oxímetro de mercúrio é necessária.

Neste exemplo, as medições do oxímetro de mercúrio mostram picos distintos que correspondem aos poros em ambos os lados do implante e aos poros menores interdispersos. No entanto, o dado mais crucial é a diferença entre as porosidades das superfícies intraluminais e extraluminais, que podem ser analisadas pela imagem J para distribuição do tamanho dos poros. Após a fratura por congelamento das amostras, observando a seção transversal com um microscópio eletrônico de varredura.

Devido à natureza porosa aberta dos implantes usados e à capacidade de reflexão da luz do titânio, é possível fazer pilhas Z de células marcadas dentro dos implantes porosos. As células marcadas com PKH 26 ou cálcio AM podem ser usadas para visualizar os implantes com microscopia confocal a laser para acúmulo de multicamadas. A maior reprodutibilidade é obtida com robôs de imersão.

No entanto, se um robô de imersão não estiver disponível, essas etapas podem ser feitas manualmente. Para preparar a solução de colágeno, use colágeno tipo um de grau médico e alginato de sódio. As concentrações otimizadas são de 0,5 grama por litro para cada um em 150 milimolares.

O tampão de citrato de cloreto de sódio em pH 3,8 dissolve a solução de colágeno durante a noite para garantir a homogeneidade. O pH ácido da solução de 3,8 é necessário para o acúmulo estável das camadas, pois a estrutura é instável. Antes da reticulação.

No projeto de pH neutro, um suporte específico para utilização dos implantes com robôs de imersão usados na produção multicamadas de polieletrólitos. Deposite as camadas na superfície de implantes apenas de titânio ou implantes modificados conforme descrito no texto. Usando um sistema de robô de imersão, primeiro imergindo os implantes em uma solução de alginato por 15 minutos e, em seguida, enxágue a estrutura com cloreto de sódio 150 milimolar a pH 3,8 por cinco minutos.

Siga com a imersão em uma solução de colágeno por 15 minutos. Para estabilizar a membrana basal primeiro, prepare a solução de reticulação a 100 milimolares de genina. No tampão citrato ADSO em uma proporção de volume de um a quatro volumes, dissolva a genina no componente DMSO e, em seguida, no componente água para evitar a reticulação grudada das amostras por imersão na solução de reticulação entre 12 e 24 horas depois.

Enxágüe com grandes quantidades de tampão citrato em pH 3,8 Após lavar as etapas, esterilize as amostras com tratamento UV por 30 minutos ou em um banho antifúngico antibiótico. Os principais parâmetros que determinam a qualidade da membrana basal são sua espessura e o diâmetro das fibras. Calcule os diâmetros das fibras usando microscopia de força atômica ou imagens FM obtidas no modo de contato.

Após a secagem das amostras com um fluxo de nitrogênio, antes da imagem, quantifique a espessura de pelo menos 10 fibras por imagem para determinar a espessura média da fibrila. Com o software Image J após a secagem dos filmes multicamadas de colágeno de alginato de colágeno 24 bicamadas, a espessura dos filmes pode ser determinada por testes de arranhões. Usando um FM primeiro, use uma agulha de seringa para arranhar o filme após a localização do arranhão com um microscópio de luz, obtenha imagens com um FM em superfícies de 10 por 10 mícrons quadrados no limite do arranhão.

Calcule as alturas dos perfis obtidos com o software A FM, que fornece a espessura da camada de filme. Depois de implantar o dispositivo na traqueia dos coelhos, conforme descrito no texto, obter amostras de sangue de suas veias auriculares, centrifugar as amostras a 5.000 RPM por 20 minutos a quatro graus Celsius. Utilizar o sobrenadante obtido para análise após a extracção do plasma de coelho com 0,1% de ácido trioracético.

Efectuar a purificação por HPLC em fase inversa do teor de proteínas plasmáticas purificando o extracto utilizando uma coluna de fase inversa 305 C 18 da célula do núcleo. Registre a absorbância em 214 e 280 nanômetros usando o sistema de solvente e a taxa de fluxo encontrados no protocolo de texto. Coletar as frações de pico antes de concentrá-las por evaporação.

Usando a aplicação de vácuo de velocidade, é importante parar o vácuo de velocidade antes da secagem completa. Correlacionar os picos obtidos em diferentes momentos ao longo do período de implantação. Use os peptídeos purificados que estão mostrando tendências consistentes durante o curso da implantação para identificação por sequenciamento automático de Edmond.

Carregue a amostra em filtros de fibra de vidro tratados com poli cérebro, determine a sequência terminal final dos peptídeos purificados por degradação automática de Edmond usando um micro sequenciador pro preciso. O próximo passo é a identificação de fenil th e um aminoácido por cromatografia em uma coluna C 18. Depois que a sequência é obtida, ela pode ser identificada pelo software de jateamento usando o banco de dados Swiss Prote.

Ao alterar a concentração da solução de PLLA, é possível controlar o tamanho dos poros no lado extra luminal dos implantes. O tamanho e a forma dos poros foram significativamente afetados pela presença de implantes de titânio. Os tamanhos dos poros variaram de 40 a 100 micrômetros com a utilização de concentrações mais baixas, resultando em poros menores, enquanto o tamanho dos poros laterais intraluminais foi governado pela extração restrita e ficou em torno de nove mícrons, o que é menor que o tamanho médio dos fibroblastos.

Ao adicionar uma etapa de incubação à temperatura ambiente, podem ser obtidas estruturas porosas duplas onde as paredes dos poros maiores têm sua própria porosidade. Esse recurso é importante para implantes espessos, pois facilitaria o movimento de gases e nutrientes. Após a formação do gradiente de poros, é possível adicionar a camada de filme de alginato de colágeno no topo da estrutura.

Esta camada de filme é estável sobre a espuma PLLA e também pode ser mantida na superfície na ausência da forma de fibras de colágeno em nanoescala de espuma. À medida que a camada de filme cresce, o crescimento do filme é exponencial. Assim, um filme espesso de várias centenas de nanômetros pode ser obtido.

Os implantes de titânio poroso integram-se ao tecido hospedeiro e são completamente preenchidos entre quatro e seis semanas in vivo, conforme mostrado nas seções transversais do implante explantado. O tecido dentro dos poros é um tecido conjuntivo maduro com um bom nível de vascularização. Durante este período, a análise de HPLC mostrou picos distintos que flutuam durante o curso do tempo de implantação.

As frações de pico de interesse foram sequenciadas e determinadas como meias cadeias de hemoglobina alfa e beta, que mostraram uma tendência semelhante com as leituras de proteína C reativa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir gradientes PO multiescala 3D para modificação de implantes metálicos e para experimentos de cultura de células.

A extração por congelamento e a camada pela formação do filme são metais simples para desenvolver seus próprios implantes modificados ou microambientes para células.