Name: One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a síntese de porphysomes por extrusão de alta pressão para terapia fototérmica de tumores. Este método demonstrou 100% de sobrevivência em modelo animal de xenotransplante subcutâneo.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Princess Margaret Hospital, o Conselho Nacional de Ciência e do Canadá, o Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde, da Fundação Canadense de Inovação Tecnológica em Engenharia, eo Joey e Toby Tanenbaum / Cadeira Bola Brasileiro em Prostate Cancer Research, uma bolsa da Fundação de Pesquisa SUNY e suporte de inicialização da Universidade de Buffalo.

1. Síntese de Pyropheophorbide-lípido <ol><li> Combinar 200 mmol pyropheophorbide (preparado a partir de Spirulina Pacifica algas, tal como descrito anteriormente,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) 4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg de EDC, 48,7 mg de DMAP (4 - (dimetilamino) piridina) em 5 ml de amileno clorofórmio estabilizado por uma proporção de 1:1:2:2 Pyro: Lipid: EDC : DMPA. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente sob árgon durante 24 horas. Evapora-se o clorofórmio sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo com aquecimento a 40 ° C. A mistura de isómeros pyro-lípido (piro ligados na posição sn-1 ou sn-2) é produzido. </li><li> Ressuspender mistura isómero piro-lípido em 1 mM de CaCl2, 50 mM de Tris (pH 8), 0,5% de Triton X-100 e 10% de metanol numa concentração de 5 mg / ml. Adicionar fosfolipase A2 (PLA2) de mel de abelha veneno em0,1 mg / ml de concentração e incubar a solução a 37 ° C durante 24 h para digerir sn-1 piro-lípido e para produzir o sn-2 piro-lípido isómero puro. </li><li> Adicionar 2 volumes adicionais de clorofórmio e 1,25 volumes de metanol, extracto, e, em seguida, remover o solvente, utilizando evaporação rotativa a pressão reduzida a 40 ° C. Ressuspender o produto da clivagem em 1% de MeOH em DCM e purifica-se sobre uma pequena coluna de sílica diol para o isomericamente puro piro-lípido. </li></ol> 2. Preparação de Porphysomes <ol><li> Dissolver pyropheophorbide-lipídico, distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metoxi (polietileno glicol) (PEG-2000-PE) e colesterol em clorofórmio separadamente, e gravar as concentrações respectivamente. </li><li> Prepare porphysome filme lipídico em um tubo de ensaio de borosilicato mm de 12x75 com um peso total de lípido de 5 mg / tubo através da combinação de 65% molar de lípido-porfirina, 5% molar de PEG-2000-PE e 30% molar de colesterol. </li><li> Secam-se as películas de lípidos, sob uma corrente de nitrogás gen e deixá-los ainda mais seco sob vácuo por 1 hora. Armazenar as películas lipídicas, a -20 ° C sob atmosfera de árgon até a hidratação e extrusão futuro. </li><li> Adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, NaCl 150 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4) a cada tubo de filme lipídico. Congele o tubo de ensaio em azoto líquido até estar completamente congelada, e em seguida descongelar o tubo em 65 ° C num banho de água, até a amostra ter todos derretido. Vortex o tubo, para um total de 30 seg (3x com 10 seg cada, com 5 seg re-aquecimento a 65 ° C em banho de água entre cada vórtice). </li><li> Repetir o congelamento-descongelamento durante 5 ou mais ciclos de cima do necessário até que não há grandes agregados podem ser observados na solução hidratada. Deixe a suspensão porphysome no gelo quando terminar. </li><li> Montar o extrusor de alta pressão (10 ml) com dois filtros empilhados de 100 nm de policarbonato instalados dentro do extrusor Thermobarrel Ligação a um circulador termostatizado a 65 ° C num banho de circulação de água, e ligar o sistema de extrusão para um tanque de alta pressão por azotoCertifique-se de fornecimento. </li><li> Transferir a suspensão porphysome para a câmara de extrusão usando uma pipeta de transferência de 9 polegadas de vidro. Ajuste a pressão girando o botão no regulador tanque de nitrogênio até uma leitura entre 200 e 300 psig é observado como pressão inicial de extrusão. Abrir a válvula do regulador de pressão gradualmente até caudal porphysome suficiente é alcançado ou um máximo de 800 psig (5440 kPa) de pressão é alcançado. </li><li> Após o primeiro passo de extrusão está completa, fechar a válvula de controlo de pressão e libertar a pressão da extrusora com a abertura da válvula de alívio de pressão na parte superior da extrusora. Reencher a extrusora com a solução porphysome recém-extrudido, e repetir a extrusão de, pelo menos, 10 vezes, para assegurar que a solução final é extrudido homogéneo. </li><li> Determinar a concentração de solução final porphysome medindo a absorção de uma amostra diluída em metanol, por UV-Vis espectrómetro. Calcular a concentração usando a seguinte equação sagacidadeh o coeficiente de extinção de 97000 M -1 cm -1 a 410 nm para pyropheophorbide-lípido. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50536/50536eq1.jpg" /><ol start="10"><li> Meça o tamanho da distribuição final de porphysomes usando um Malvern Zetasizer ZS90 por espalhamento de luz dinâmico. Diluir solução porphysome em PBS e realizar três medições com 15 corridas cada, para a média dos resultados. </li><li> Determinar a extinção da fluorescência de porphysome por comparação da emissão de fluorescência de porphysome temperada (1 mM em PBS) e porphysome extinta (1 mM em 1% de Triton X-100) utilizando um espectrofluorímetro. Tomar os espectros de antes e depois do detergente (Tirton X-100) são adicionados, e a normalizar o sinal de leitura de fluorescência máxima. Defina a excitação de ser 410 nm, e faixa de comprimento de onda de emissão a ser 600-800 nm. </li><li> Manter solução porphysomes sob árgon a 4 ° C até uso futuro, e protegê-la da luz por alumínio fóleo. </li></ol> 3. Preparação de Animais Modelo de Xenoenxerto <ol><li> Cultura das células KB em meio RPMI-1640 (com 10% de FBS), e manter as células em 5% de CO 2 e atmosfera hidratada a 37 ° C. </li><li> Colheita de células KB, usando a técnica de cultura de células padrão. Manter a suspensão de células (20.000 células / ml) em tampão fosfato salino (PBS) em gelo durante o armazenamento a curto prazo até à altura da injecção. </li><li> Prepare um KB xenografts em camundongos nus. Os ratinhos nus são adquiridos em Charles River Laboratories, quando eles são de 20 g (Categoria # CRL: NU (NCr)-Foxn1 nu, 6-7 semanas de idade), dado dieta padrão e de cama (Harlan Laboratories; Dieta: irradiados LM-485, # 7912; cama: cama sabugo, ¼ &quot;, # 7097). Esterilizar todas as ferramentas de manipulação de animais (seringas, fórceps, e almofada animal) antes de experimentos. Anestesiar ratos com isoflurano a 2% v / v em 100% de gás portador de oxigénio. Todos os protocolos de animais são aprovados pela instituição (Universidade Saúde NeTwork neste caso) cuidados com os animais e uso comitê. </li><li> Injectar células tumorais suspensas em PBS subcutaneamente para o flanco direito dos ratinhos. Ratos está pronto para ser utilizado depois de 10 dias, quando tumor atinge diâmetro de 4-5 mm e espessura de 2-3 mm. </li></ol> 4. In vivo Fototérmica Terapia <ol><li> Injetar porphysomes (contendo 750 nmol pyro em volume de 200 mL) por via intravenosa, via veia da cauda. Conduzir a laser irradiação 24 horas pós-injeção de porphysomes. </li><li> Nesta seção, realizar todos os procedimentos em uma sala de segurança do laser fechado. Use óculos de segurança do laser durante a irradiação laser. </li><li> Configure o equipamento de irradiação laser. Segure a fibra de laser e um difusor por uma braçadeira em um carrinho. Defina a potência do laser em nível baixo e ligar o laser. Ajuste a altura da fibra de laser para conseguir uma área de irradiação de 9 mm de diâmetro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canadá), calibrar a potência do laser de 750 mW (1,18 W / cm 2) com apower metros e, em seguida, desligue o laser para preparar os animais. </li><li> Anestesiar os animais com isoflurano a 2% v / v em 100% gás de transporte de oxigênio pelo nariz cone nenhuma limpeza evidente de isoflurano um perigo risco para a saúde humana). Confirme se o animal é anestesiado profundo o suficiente através da realização de uma pitada do dedo do pé com uma pinça ou os dedos para as patas traseiras do animal. Os animais estão prontos para a irradiação do laser quando eles não respondem a este procedimento. </li><li> Monitorar a temperatura do tumor por uma câmera infravermelha térmica (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Coloque a câmera perto do tumor, focalizá-la bem e ter uma imagem de pré PTT, bem como uma imagem de luz branca normal antes do início da irradiação de PPF. </li><li> Ligue o laser novamente, e aumentar a potência de luz de 750 mW. Posicionar o tumor no centro do feixe de laser para se o tumor completamente coberta, e iniciar a temporização da irradiação. Pegue a imagem temperatura tumor a cada 5 segundos para um tratamento a laser de um minuto. Desligue a laser em 1 min. Stop o fornecimento de gás de 2% de isoflurano, espere até que o animal se recuperar da anestesia e colocá-lo de volta para a jaula. </li><li> Mantenha os ratos em normotermia biotério sob 0:12 hr ciclo claro e escuro de acordo com protocolos de animais aprovados pela University Health Network. Injetar buprenorfina (0,05 mg / kg, por via subcutânea, duas vezes por dia durante uma semana após a irradiação com laser para reduzir a dor causada pela cicatriz. Cada dois dias, a medir o diâmetro do tumor usando uma pinça e tirar uma foto. Calcule o volume do tumor usando o seguinte equação: V = π / 6 · a · b 2, onde a é o diâmetro de comprimento, e b é o curto. </li><li> Sacrificar os animais colocando-os na câmara de CO 2, quando o longo diâmetro do tumor atingir 10 mm, uma vez que é o ponto final definido em nosso laboratório. Realizar luxação cervical após o tratamento com CO2. Traçar a curva de sobrevivência. </li></ol>

<ol><li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+regioselection+for+the+synthesis+and+biodegradation+of+porphysome+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic regioselection for the synthesis and biodegradation of porphysome nanovesicles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51, 2429-2433 (2012).</li>
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<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).</li>
<li>Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+photosensitising+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of photosensitising agents.</a> Expert Opin Drug Deliv. 2, 477-487 (2005).</li>
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<li>Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., Blanchard, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+liposomes+formed+by+sonication+and+extrusion%3A+rotational+and+translational+diffusion+of+an+embedded+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore.</a> Langmuir. 23, 11677-11683 (2007).</li>
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</ol>

Não temos nada a divulgar.

No desenvolvimento de tecnologias de entrega de drogas, nanopartículas multifuncionais são actualmente sob investigação largas para controle preciso do veículo de distribuição de drogas enquanto mantém uma carga de droga elevada. Lipossomas carregados de porfirina têm sido desenvolvidos para obter melhores propriedades farmacocinéticas e de entrega mais eficaz do que a administração directa de porfirina, mas existem obstáculos, incluindo a quantidade de carga restringida de porfirina e redistribuição rápida de porfirina...

Porphysomes são novos nanovesículas multifuncionais que, recentemente desenvolvidos, que são capazes de imagem e terapia multimodal 1. Eles são formados por camadas duplas porfirina auto-montados e contêm uma altíssima densidade de porfirina (mais de 83, 000/porphysome partículas), o que gera grande coeficiente de extinção e resulta em única dependente de estrutura fluorescência auto-extinção. Porphysomes têm boas in vivo farmacocinéticas e de biodistribuição propriedades: eles exibem uma meia-vida no sangue de 12 horas após a administração sistemática, e passivamente acumulam em tumores de xenoenxerto com 7,5% ID / g às 24 h pós-injecção 2. Sua estrutura única e propriedades físico-químicas fazer porphysome um bom candidato para a imagem latente e terapia multimodal guiada por imagem. Primeiro de tudo, contendo porfirina, porphysomes são intrinsecamente adequado para imagens de fluorescência de tumores após a acumulação do tumor 1.Além disso, cada porfirina tem um local estável de radioisótopos quelantes, por conseguinte, porphysomes pode ser facilmente marcada com radioisótopos, tais como 64Cu para imagiologia PET 3. Além disso, a energia da luz absorvida é dissipada termicamente sob exposição a irradiação com laser quando porphysome estrutura está intacta, assim porphysomes também exibem imagens fotoacústica e capacidades únicas PTT. Demonstrou-se que 24 horas após a injecção intravenosa de porphysomes, irradiação com laser do tumor acumulou-porphysome induziu um rápido aumento de temperatura e de ablação do tumor fototérmica forte. Isto demonstrou que porphysomes são potenciadores fototérmicos eficientes com coeficiente tão alto como as nanopartículas de ouro (AuNPs) extinção 1. Por outro lado, em comparação com outros agentes fototérmicos inorgânicos, incluindo AuNPs, porphysomes mostrar uma vantagem notável em biossegurança, devido à sua natureza orgânica. Porphysomes são enzimaticamente biodegradável e induzir toxicit aguda mínimay em ratos com doses intravenosas tão elevadas como 1000 mg / kg 1. Além disso, semelhante a lipossomas, a grande núcleo aquoso de porphysomes pode ser passiva ou activamente carregados com agentes terapêuticos ou de imagiologia. As propriedades ópticas e de biocompatibilidade porphysomes demonstrar o potencial multimodal de nanopartículas orgânicas para imagiologia biofotônica e terapia. Neste artigo, apresentamos o método de síntese de conjugados pyropheophorbide-lipídico, a fabricação eo método de caracterização de porphysomes utilizando extrusão de alta pressão. In vivo PTT em ratos é realizado, bem como para demonstrar a eficiência da habilitados para porphysome PTT no tumor tratamento utilizando um modelo de tumor de xenoenxerto subcutâneo.

<table><tbody><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Thermo-Savant</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Votex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Número do modelo: G560</td></tr><tr><td>Extrusora de alta pressão</td><td>LIPEX, Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>Extrusora Thermobarrel de 10 ml</td></tr><tr><td>Termostatos termostatizados (termostatista)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>SC100-S5P</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de policarbonato </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>Tamanho dos poros 100 nm e diâmetro da membrana 19 mm</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZS90</td><td></td></tr><tr><td>UV/Visible Spectrophototmeter</td><td>Varian Austrália</td><td>Cary 50 Bio UV/Espectrofotômetro</td><td> </td>Visível</tr> <tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>HORIBA Scientific</td><td>FluoroMax-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)</td><td>Hitachi</td><td>H-7000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>com sensor S142C</td></tr><tr><td>671nm Laser</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>LRS-0671_PFN-02000-05</td><td>S/N:10097270</td></tr><tr><td>Termômetro infravermelho</td><td>Mikroshot, LUMASENSE Technologies</td><td>9102409</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de proteção a laser</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>AGF6602XX</td><td>Densidade óptica: 1,5+ a 630-700 nm</td></tr></tbody></table>

one minute, sub-one-watt photothermal ablação tumoral usando porphysomes, intrínseca multifuncional nanovesículas

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

Recentemente, desenvolveu porphysomes como nanovesículas intrinsecamente multifuncionais. Um fotossensibilizador, pyropheophorbide α, foi conjugado com um fosfolípido e depois auto-montados para vesículas esféricas de lipossomas semelhante. Devido à altíssima densidade de porfirina na bicamada lipídica porfirina, porphysomes gerado grandes coeficientes de extinção, dependente da estrutura de fluorescência auto-extinção, e excelente eficácia fototérmica. Na nossa formulação, porphysomes foram sintetizados utilizando a extrusão de alta pressão, e mostrou um tamanho médio de partícula de cerca de 120 nm. Injecção de vinte e quatro horas após a intravenosa de porphysomes, a temperatura local do tumor aumentou de 30 ° C a 62 ° C rapidamente após a exposição de 750 mW (1,18 W / cm 2), 671 nm, a irradiação com laser de um minuto. Após a ablação térmica completa do tumor, escaras formado e curado dentro de 2 semanas, enquanto que nos grupos de controlo, os tumores continuaram a crescer e todos atingiram o definido brponto d dentro de 3 semanas. Estes dados mostram como porphysomes pode ser utilizado como terapia fototérmica potente (PTT) agentes.

Pyropheophorbide é conjugado com o fosfolípido, como um monómero de lípidos estáveis ​​(Figura 1A) e a conjugados de auto-reunir-se para formar porphysomes pelo método de extrusão de membrana utilizando uma extrusora de alta pressão. Geralmente é difícil para expulsar suspensão porphysome-lipídico durante os 3 primeiros ciclos de extrusão, com taxa de fluxo relativamente lento. Quanto mais as extrusões são repetidos, a taxa de fluxo da solução extrudido aumenta gradualmente, e a pressão pode ser ligeira...

Nós desenvolvemos novas nanovesículas multifuncionais intrínsecas chamados porphysomes, que têm dependentes de estrutura fluorescência auto-têmpera e propriedades fototérmicos únicas, assim funcionando agentes terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes utilizando extrusão de alta pressão e investigou sua eficácia terapia fototérmica em um modelo de tumor xenoenxerto.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

Os objetivos gerais do experimento a seguir são demonstrar a síntese de porquatrosums utilizando um extrusor de alta pressão e a eficiência da terapia fototérmica mediada por porquatrosums no tratamento de tumores em um modelo de tumor xenógrafto subcutâneo. Isso é alcançado conjugando-se piroquatro por alfa a um fosfolípide, formando o piroquatro-lípide; na segunda etapa, os piroquatro-lípidos se auto-organizam em porquatrosums por extrusão de alta pressão e são caracterizados para controle de qualidade. Em seguida, os porcincosums são injetados em animais portadores de tumores subcutâneos para demonstrar sua eficácia na terapia fototérmica. Após irradiação com laser, os resultados mostram que os porcincosums são nanopartículas com alta homogeneidade e fluorescência fortemente suprimida, e que os porcincosums são um agente fototérmico potente, com base na taxa de 100% de sobrevivência no estudo in vivo com animais.Os porfiresomes são as primeiras nanopartículas orgânicas a atuar como potencializadores fototérmicos eficientes, mantendo ao mesmo tempo a capacidade de carregamento de fármacos e a biocompatibilidade dos lipossomos convencionais, além de serem adequados para imagem multmodal e terapia guiada por imagem. Assim, as implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico e tratamento de tumores. Antes deste procedimento, os porfiresomas de lipídio foram previamente sintetizados de acordo com o protocolo descrito no texto.Dissolva separadamente o piro quatro com o polietileno glicol lipídico e o colesterol em clorofórmio. Registre as concentrações de cada solução na capela à temperatura ambiente. Prepare a mistura lipídica de por quatro em um tubo de ensaio de borossilicato, com um peso total de lipídios de cinco miligramas por tubo.Combine o porfirina lipídica PEG 2000 PE e o colesterol para uma concentração molar fracional de 65 e 5% e 30%, respectivamente. Em seguida, evapore brevemente os filmes lipídicos sob um fluxo de gás nitrogênio e, depois, mantenha-os sob vácuo por uma hora. Os filmes lipídicos podem agora ser armazenados a menos 20 graus Celsius sob argônio para posterior hidratação e extrusão.Para iniciar a hidratação e extrusão, adicione um mililitro de PBS a cada tubo com filme lipídico, congele completamente cada tubo em nitrogênio líquido. Em seguida, descongele-os em banho-maria a 65 graus Celsius quando não estiverem mais congelados. Vortexe cada tubo três vezes por 10 segundos, com cinco segundos de reaquecimento no banho entre os usos do vortex.Repita os ciclos de congelamento, descongelamento e vortex cinco ou mais vezes até que nenhum agregado grande possa ser observado na solução hidratada. Por fim, mantenha a suspensão de lipossomos em gelo. Em seguida, monte um extrusor de alta pressão de 10 mililitros com dois filtros de policarbonato de 100 nanômetros empilhados.Conecte o extrusor a um banho de água circulante regulado a 65 graus Celsius. Em seguida, conecte o sistema de extrusão a um tanque de nitrogênio para fornecer pressão. Agora, use uma pipeta de vidro de nove polegadas para transferir a suspensão para a câmara do extrusor.Aumente a pressão inicial de extrusão para entre 200 e 300 PSIG. Em seguida, abra a válvula gradualmente até que haja fluxo suficiente de por quatro. Não aplique mais de 800 PSIG após a primeira passagem de extrusão.Feche a válvula de controle de pressão e abra a válvula de alívio de pressão. Reabra o extrusor com a solução fresca e repita o processo pelo menos 10 vezes para garantir que a solução extrudida final seja totalmente homogênea. Ous. Determine a concentração da solução final de por quatro membros medindo a absorção de uma amostra diluída em metanol usando um espectrômetro UV-vis.Em seguida, dilua a solução de por quadras em uma parte para 60 em PBS. Em seguida, realize três medições da distribuição de por quadras por espalhamento dinâmico de luz. Execute 15 corridas independentes e calcule a média dos resultados.Por fim, diagnostique o quenching da fluorescência do por quaterno comparando a emissão de fluorescência do PHY quenchado a um milimolar em PBS com a do por quinário não quenchado a um milimolar em 1% Triton X-100. Armazene a solução de por quaterno protegida da luz com papel alumínio e sob argônio a quatro graus Celsius. As células KB em RPMI 1640 com 10% de FBS devem ter as células KB colhidas a 20.000 células por mililitro em PBS e mantidas em gelo para um camundongo nu de 20 gramas anestesiado com isoflurano; injete 100 microlitros de células por via subcutânea na região dorsolateral direita.Dez dias depois, o tumor resultante terá de quatro a milímetros de diâmetro e estará pronto para o tratamento. Inicie o tratamento injetando 750 nanomoles das por quatroenas através da veia caudal. Vinte e quatro horas depois, irradie com laser as por quatroenas em uma sala fechada de segurança contra laser, utilizando óculos de proteção contra laser, e o fibra óptica e o difusor devem ser fixados por um suporte.Defina a potência do laser em nível baixo e ligue o laser. Ajuste a altura da fibra de laser para obter uma área de radiação com nove milímetros de diâmetro. Utilize um medidor de potência para calibrar a potência do laser em 750 miliwatts, correspondendo a 1,18 watt por centímetro quadrado.Em seguida, desligue o laser enquanto anestesia o animal com gás fluoreto de isoflurano. Quando o animal não responder a um aperto no dedo do pé, registre a temperatura do tumor utilizando uma câmera térmica infravermelha com foco preciso. Adquira uma imagem pré-tratamento fototérmico, bem como uma imagem regular em luz branca.Em seguida, ligue o laser em 750 miliwatts. Posicione o tumor no centro do feixe de laser por um minuto e meça a temperatura do tumor a cada cinco segundos. Após um minuto, desligue o laser, interrompa o fluxo de gás isoflurano e aguarde até que o animal se recupere da anestesia antes de devolvê-lo à sua gaiola.A cada dois dias, fotografe o tumor e meça seu diâmetro com paquímetro. Quando atingir 10 milímetros de diâmetro, sacrifique o animal de forma humanitária. Utilizando este protocolo, o piro quatro bide foi conjugado ao fosfolípido como um monômero lipídico estável e se autoorganizou para formar por quatro alguns por extrusão sob alta pressão.Os poros resultantes terão uma alta homogeneidade na distribuição de tamanho, com um pico em torno de 120 nanômetros. Eles também apresentam dois picos principais de absorbância em 410 nanômetros e 677 nanômetros. A fluorescência da porfirina foi quenchada em até 99,8% quando a nanoestrutura está intacta.Utilizando o protocolo descrito de PTT in vivo, por grupos de quatro com irradiação a laser causou um aumento na temperatura do tumor superior a 35 graus Celsius após um minuto de irradiação. Enquanto o laser isolado induziu um aumento de temperatura inferior a 10 graus Celsius. Após a irradiação de PTT, os tumores geralmente tornaram-se esbranquiçados devido ao potente efeito térmico.A ablação térmica resultou em escara marrom-escura nos tumores e uma redução de 100% do volume tumoral. As cicatrizes pós-ES eram evidentes 24 horas após o tratamento e foram gradativamente recuperadas nas duas semanas seguintes. Utilizando grupos de quatro, tumores subcutâneos foram completamente eliminados sem recorrência.Por comparação, tumores injetados apenas com ssom ou tratados apenas com laser continuaram a crescer. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar prismas por meio de extrusora de alta pressão e de como realizar a irradiação a laser após a administração de roone para terapia fototérmica.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Insonação de microbolhas é uma estratégia promissora para a ablação do tumor em reduzido tempo médio poderes acústica, bem como para a entrega prevista para terapêutica. O objetivo do presente estudo é desenvolver estratégias de ciclo de baixa dever de ultra-som pulsante e nanocarriers para maximizar a não-térmicos ablação microvascular e entrega de carga útil para subcutânea C6 gliomas.

O ultra-som contraste Targeted Tratamento de Gliomas em camundongos através de Drogas Levando-entrega de nanopartículas e Ablação Microvascular

Phase-Shift nanoemulsões (PSNE) pode ser vaporizado utilizando ultra-sons de alta intensidade focado para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores. Neste relatório, a preparação de PSNE estável, com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. Além disso, o impacto de PSNE vaporizada no ultra-som mediada por ablação é demonstrada no tecido mimetizam fantasmas.

Síntese de mudança de fase Nanoemulsões com distribuição de tamanho estreita para vaporização Droplet Acústico e Bubble avançada ablação por ultrassom mediada

Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor.

Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

Este protocolo demonstra a nucleação controlável de cavitação em gel de fantasmas, através da exposição simultânea a luz pulsada de laser infravermelho e ultrassom focada de alta intensidade (HIFU). A atividade de cavitação então pode ser usada para realçar o usos de imagens e/ou terapêuticos de HIFU.

Controlável nucleação de cavitação de nanopartículas de ouro plasmônico para reforçar a alta intensidade focada aplicações de ultra-som

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de microbolhas com nanopartículas de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação fototérmica.

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Imagem Domínio óptico Freqüência de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonares espécimes de ressecção: Obtenção de One to One Imagem para Histopatologia Correlação

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