Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

O objetivo geral deste procedimento é medir a geração de força durante uma contração máxima do peixe-zebra, larva e músculo do tronco. Isso é feito primeiro fazendo alças de sutura que serão usadas para manter as larvas no lugar durante as medições de força. Em seguida, as larvas anestesiadas são posicionadas dentro da câmara experimental.

Uma vez no lugar, a força é registrada durante uma contração máxima de contração. A etapa final é medir as dimensões da musculatura do tronco para que o pico de força possa ser normalizado para a área da seção transversal do músculo. Em última análise, medir a geração de força durante a contração é usado para mostrar mudanças na função muscular e na saúde muscular geral.

Embora demonstremos esse método usando larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, ele também pode ser usado com larvas geneticamente modificadas ou com larvas tratadas com drogas ou tóxicos. O método pode então ser usado para caracterizar modelos de doenças musculares e avaliar tratamentos ou para estudar o desenvolvimento muscular, lesões ou toxicidade química. O primeiro passo é preparar as alças de sutura que serão usadas para manter as larvas no lugar.

Durante o teste de força, use uma pinça para separar a sutura não estéril em três fios. Depois de separados, comece a dar um nó duplo em um dos fios, mas pare antes de apertar o nó completamente para fazer um pequeno laço. Em vez disso, para terminar o laço, use uma tesoura para cortar o excesso de sutura das caudas.

Coloque o laço no lado adesivo de uma nota adesiva para uso posterior. Faça duas alças de sutura para cada larva que será testada. Primeiro, coloque o aparelho de teste no palco de um microscópio estéreo.

Em seguida, conecte os cabos do transdutor de força e do controlador de comprimento ao aparelho de teste. Ligue o transdutor de força e o controlador de comprimento e gire a chave na frente do controlador de comprimento. Isso faz com que o tubo controlador de comprimento seja conectado a uma transferência descartável. Pipeta.

Encher a câmara experimental com a solução de ensaio. Use uma pinça para pegar um laço de sutura por uma das caudas como preensão. O laço na parte curva pode dobrar a sutura e fazer com que ela se quebre durante as etapas subsequentes.

Pendure um laço no tubo do transdutor de força e outro no controlador de comprimento Com uma pipeta de transferência descartável, transfira uma larva de peixe-zebra para uma pequena placa de Petri cheia de solução de teste. Assim que o anestésico fizer efeito, cutuque suavemente a cauda para verificar se há falta de natação evocada pelo toque. Em seguida, use uma pipeta de vidro para transferir as larvas para a câmara experimental com fórceps.

Guie suavemente a porção anterior da larva através da alça de sutura no tubo do transdutor de força, segurando ambas as caudas da alça de sutura. Puxe-os simultaneamente para apertar o laço posterior ao saco de carvalho ou à bexiga natatória com uma pinça. Segure uma cauda de sutura e puxe, fazendo com que as larvas girem 90 graus ao redor do tubo até que o lado lateral da larva fique voltado para cima.

Usando o dispositivo de posicionamento X, Y, Z conectado ao controlador de comprimento, mova o tubo do controlador de comprimento ao longo do eixo x e sob o tronco e a cauda das larvas. Deixe espaço entre as extremidades do tubo controlador de comprimento e o tubo do transdutor de força. Em seguida, guie a alça de sutura sobre a cauda das larvas e aperte a alça de sutura.

Como demonstrado anteriormente, pode ser necessário girar a parte posterior das larvas para que o lado lateral fique voltado para cima. Uma vez no lugar, apare as caudas do laço de sutura. Use os dispositivos de posicionamento XY, Z para abaixar lentamente os tubos até que eles toquem o fundo da câmara.

Em seguida, elevar as larvas a uma distância adequada do fundo da câmara. Isso deve estar dentro da distância de trabalho de uma objetiva de microscópio invertida usada posteriormente. Finalmente, ajuste o tubo controlador de comprimento para alinhar o eixo longo da larva com o eixo longo do tubo do transdutor de força.

Para começar, mova o aparelho de teste para o estágio de um microscópio invertido. Em seguida, conecte o termômetro circulador de banho-maria e o controlador de temperatura ao aparelho de teste. Ligue os componentes necessários e ajuste a configuração no controlador de temperatura para o valor desejado.

Conecte os cabos do estimulador ao aparelho de teste. Ligue a energia do estimulador, mas não estimule as larvas neste momento. Para verificar se as larvas estão paralelas ao fundo da câmara, veja a porção das larvas entre as extremidades dos tubos.

Se paralelo, ambas as extremidades das larvas estarão em foco, se necessário. Ajuste o tubo do transdutor de força até que ambas as extremidades estejam focadas e a larva esteja paralela. Ligue o sistema de duração do sarcômero de vídeo e gire a câmera de vídeo de forma que as estrias fiquem paralelas às laterais do quadro de vídeo.

O espaçamento estriado é usado como um indicador do comprimento do sarcômero. Ajuste o microscópio para focar nas fibras periféricas e observe o comprimento indicado do sarcômero. Se necessário, ajuste o controlador de comprimento para encurtar as larvas até que o comprimento do sarcômero seja menor que o ideal Para otimizar a força de contração.

Primeiro, defina a corrente de saída no estimulador para baixa magnitude e, em seguida, programe um software especializado para fornecer pulsos de corrente. 0,2 milissegundos de duração. Forneça o primeiro pulso e use o osciloscópio para medir o pico de força de contração.

Aumente a corrente em incrementos de 50 miliamperes e meça o pico de força de contração em cada novo nível de corrente. Aguarde 30 segundos entre as contrações para evitar a fadiga à medida que a corrente de estimulação aumenta. A força de contração máxima normalmente aumenta ao máximo e, em seguida, diminui gradualmente a corrente na qual a larva é gerada.

A maior força é a corrente de estimulação ideal, uma vez identificada, defina a amplitude da corrente para a corrente de estimulação ideal e ajuste o comprimento das larvas para obter a força máxima de contração. Finalmente, provoque uma contração dos músculos da larva. Use o osciloscópio para registrar a resposta de força e salve o registro para análise subsequente.

Para medir as dimensões da musculatura, mova o aparelho de teste de volta para o microscópio estéreo. Usando a escala IP, meça a altura da musculatura vista de lado. Faça as medições em um ponto de referência anatômico.

Por exemplo, a abertura urogenital marcada aqui em vermelho. Em seguida, tomando cuidado para não alterar o comprimento das larvas. Gire as larvas em 90 graus usando as caudas da alça de sutura para visualizar as larvas por baixo.

Meça a largura da musculatura vista de baixo. Por fim, corte as alças de sutura com uma microlâmina para liberar as larvas do equipamento de teste em larvas saudáveis de peixe-zebra do tipo selvagem, as fibras musculares devem estar paralelas entre si, sem grandes lacunas entre elas e ter estrias de evidências, larvas de peixe-zebra do tipo selvagem que não exibem essas características ou com danos evidentes, como fibras destacadas, como visto aqui, devem ser descartadas aqui. O pico de força de contração versus corrente de estimulação é plotado para uma única larva de peixe-zebra.

A corrente de estimulação ideal é normalmente entre 400 a 600 miliamperes. Uma resposta de força representativa coletada durante uma contração máxima de contração de uma única larva é mostrada aqui. Aqui. Os valores de força de pico de larvas do tipo selvagem de diferentes idades variam de 0,9 a 1,7.

Mili newtons com larvas mais velhas gerando mais força do que larvas mais jovens. As larvas mais velhas geram mais força do que as larvas mais jovens, mesmo depois que as forças de pico são normalizadas para a área muscular da seção transversal. Ao tentar este procedimento, é importante apertar as alças de sutura o suficiente para que as larvas não possam girar facilmente em torno do transdutor de força e dos tubos controladores de comprimento.

Se as alças de sutura estiverem muito soltas, a força gerada pela larva não será totalmente transmitida ao transdutor de força e a força máxima de contração será subestimada.