Síntese, Entrega Celular e In vivo Aplicação de sensores de pH à base de Dendrímero

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver novos sensores fluorescentes baseados em bateristas Dun com propriedades aprimoradas para imagens de pH in vitro em células vivas e in vivo. Isso é obtido conjugando primeiro corantes sensíveis ao pH a um andaime dendrítico junto com outras porções, como grupos-alvo ou pH em corantes sensíveis. E medições in vitro são feitas para gerar uma curva de calibração de pH ao lado do pH da imagem em células vivas.

O sensor é fornecido por eletroporação e os mapas de pH são gerados usando microscopia confocal para obter imagens do pH no espaço extracelular do cérebro. Durante a atividade neural fisiológica e patológica, o sensor é microinjetado no cérebro de camundongos anestesiados. Os dados de fluorescência são então adquiridos usando microscopia de dois fótons.

Os resultados obtidos mostram que sensores baseados em dlumin conseguem medir mudanças de pH com alta resolução espacial e temporal, tanto em células vivas quanto in vivo. Embora vários corantes de combustão com comportamento sensível ao pH já tenham sido empregados, eles sofrem de várias desvantagens, como pouca mobilidade e vazamento celular. Além disso, eles não permitem a medição absoluta da métrica de rash

Aqui demonstramos a conação de corantes sensíveis ao pH ao arcabouço genético D, e como os desempenhos permitem uma medição precisa com a resolução especial e temporal, este método pode ser uma ferramenta útil para estudar processos fisiológicos e patológicos regulados pelo pH em células vivas. A interrupção na regulação do pH no sistema neurológico está associada a várias condições, como acidente vascular cerebral e epilepsia, e o sensor de pH disponível provou ser pouco eficaz, levando ao design do sensor apresentado. Embora este met tenha sido aqui aplicado em imagens de pH h, é uma abordagem geral e pode ser aplicada a outras espécies biológicas relevantes.

Ao escolher o corante com sensor de lucro, a abordagem sintética fácil e versátil torna esses procedimentos simples. Demonstrando o procedimento hoje Será Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody e Sebastian Suli Para conjugar indicadores de pH para Piam Demers. Começar por dissolver o rimer em DMSO anidro a uma concentração final de 50 micromolares.

Prepare 10 soluções-mãe micromolares de fluoresceína NHS e tetraetil RUMINE NHS, também conhecido como TMR em anidro, DMSO em um tubo de microcentrífuga combinado, um mililitro de solução G quatro peram dederer com oito equivalentes, ou 40 microlitros de fluoresceína e oito equivalentes, ou 40 microlitros de TMR. A proporção molar na mistura refletirá a quantidade de corantes carregados no demer. Agite a solução em temperatura ambiente por 12 horas.

Em seguida, dilua a mistura de um a 10 com água deionizada e carregue a mistura de reação em uma bolsa de diálise com um corte de peso molecular de 10 kilodaltons dialisada contra água deionizada e substitua a água no reservatório três vezes em 24 horas. No dia seguinte, transfira a solução para um frasco de vidro e congele-o a menos 80 por algumas horas. Quando a solução estiver completamente congelada, transfira o frasco para um liofilizador e liofilize por 24 horas.

Um pó roxo deve ser obtido, ondulado obtido sólido, e dissolvê-lo em água mqe. A uma concentração final de 10 micromolares. Dispensar a solução em alíquotas de 50 microlitros em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros e armazená-los a menos 20 graus Celsius.

Para calibração in vitro, prepare uma solução 500 nanomolar de batedor D em dois PBS milimolares em um veterinário Q de quartzo. Um tampão PBS muito diluído é usado para evitar mudanças abruptas de pH durante a titulação. Meça os espectros de emissão de fluoresceína e TMR e otimize as configurações ópticas do fluorímetro para obter uma boa relação sinal-ruído.

Em seguida, execute uma titulação de pH adicionando pequenos volumes de hidróxido de sódio normal 0,1 e ácido clorídrico normal 0,1. Após cada adição, agite o veterinário Q para misturar. Aguarde um minuto para o equilíbrio e, em seguida, meça o pH por meio de um pH.

Os espectros de emissão de microeletrodos de fluoresceína e TMR devem ser registrados para cada etapa sem qualquer alteração. Nas configurações ópticas, plote a intensidade de fluorescência versus pH. Para a titulação, o sinal de domine da haste não deve ser afetado pelo pH.

O sinal de fluoresceína deve ser uma curva sigmoidal e deve ser equipado com um único modelo de ligação com um PK de 6,4 para eletroporação. Transfira seis vezes 10 para as quintas células hela em 72 microlitros para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para as células ressuspensas. Adicione dendri ou solução aquosa a uma concentração de dois micromolares, adicione três mililitros, tampão de eletroporação a um tubo de micropurificação.

Em seguida, usando uma ponta de eletroporação de 10 microlitros, aspire as misturas de células e rimers. Em seguida, insira a micropipeta na estação de pipetas e defina as condições do pulso de micropurificação aqui. A tensão de pulso é definida para 1005 volts.

A largura do pulso é ajustada a 35 milissegundos, e o número do pulso é ajustado a dois após a placa do pulso. 20 microlitros das pilhas eletroporadas em placas baixas de vidro com meio fresco sem antibióticos. 12 horas após a eletroporação datilografam as pilhas com um microscópio confocal usando um grupo padrão do filtro para a fluoresceína e a rdomine.

Concentre-se na amostra e ajuste a potência do laser e o ganho do detector para maximizar a relação sinal-ruído. Se a eletroporação for bem-sucedida, as células devem ser brilhantemente fluorescentes em ambos os canais. A localização depende do tamanho e da carga do D são usados. Amiúde.

A localização lisossômica do sol, que é vista como pequenas vesículas perinucleares, está presente devido à endocitose ou compartimentalização. Se a localização lisossômica for predominante, na qual a maior parte da fluorescência está localizada dentro das vesículas e o sinal dos poros é observado no citosol. Isso significa toxicidade e as medições devem ser descartadas.

Adquira os dois canais sequencialmente, adquira várias imagens e calcule a média das imagens para melhorar a qualidade da imagem. Para gerar uma curva de calibração de pH, use tampões com opfor em phs diferentes para agrupar o pH intracelular e extracelular no mesmo valor. Adquira pelo menos 20 imagens de células por pH e meça pelo menos cinco pontos de pH 5,5 a pH 7,5.

Isso lembra que o pH B seis é tóxico para as células, mas pode ser tolerado por um curto período de tempo, portanto, adquira imagens o mais curtas possível. Se você vir sinais de apoptose, descarte as células e reinicie. Após a aquisição.

Use a imagem J ou software análogo para análise de dados. Primeiro, determine a proporção verde para vermelho. Em seguida, plote a proporção versus pH para produzir uma tendência linear que fornecerá uma curva de calibração que pode ser usada para converter a proporção em pH em experimentos futuros.

Para a preparação de amostras in vivo, comece com C 57 camundongos pretos seis J e fêmeas entre os dias pós-natais 28 e 70. Depois de anestesiar os camundongos com uretano, beliscar o dedo do pé para garantir que o animal esteja totalmente anestesiado e aplique pomada para os olhos para reduzir a resposta ao estresse cortical e o edema cerebral. Durante a cirurgia, injete dois miligramas por quilograma de peso corporal de dexametasona, fosfato de sódio por via intramuscular.

Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, raspe a cabeça do animal, coloque uma cortina cirúrgica e aplique gel de lidocaína a 2,5% no couro cabeludo. Use uma tesoura para cortar a aba de pele que cobre o crânio de ambos os hemisférios. Lave o osso exposto com soro fisiológico e com pinça, remova suavemente o periósteo.

Isso proporcionará uma melhor superfície de aderência. Para cola e cimento dentário, aplique um poste de cabeça de aço feito sob medida com uma câmara de imagem central e, usando cianoacrilato, cole-o em uma planície aproximadamente paralela ao crânio sobre a região cortical de interesse. Fixe o poste no lugar com cimento dental branco.

Fixe a cabeça do mouse e faça uma craniotomia de dois a três milímetros de diâmetro, perfurando a região de interesse. Freqüentemente, durante todo o procedimento de perfuração, usa-se seringa para aplicar LCR A estéril fresco no crânio para minimizar o aquecimento do córtex durante a cirurgia. Após a craniotomia, transfira o animal para o estágio de imagem para manter a cabeça imóvel sob a objetiva.

Aparafuse a câmara de imagem ao poste ajustável. Aplique um focinho de plástico personalizado conectado ao oxigênio. Isso fornecerá ar enriquecido com oxigênio durante o experimento para ajudar na respiração animal.

Para injetar o sensor no córtex cerebral, carregue uma pipeta de vidro com um diâmetro de ponta de quatro milímetros e um eletrodo de cloreto de prata. Com a solução de ER de um dreno micromolar, o eletrodo facilitará o registro de potenciais de campo extracelular com uma configuração de microinjeção. Insira a pipeta no córtex a uma profundidade de aproximadamente 150 mícrons.

Injete por um a dois minutos a uma pressão de 0,5 libras por polegada quadrada para otimizar a configuração óptica para imagens. Ajuste a potência do laser para minimizar o branqueamento e os danos à foto. Normalmente, a potência do laser empregada é de cerca de 20 miliwatts e o ganho do PMT é mantido constante em 667 volts.

Defina o comprimento de onda do laser para excitar o sensor em 820 nanômetros e direcione o software para detectar fluoresceína e fluorescência de domina de bastonete simultaneamente por meio de filtros FTSE e trit padrão. Defina também a frequência de aquisição para uma taxa de quadros de dois hertz para correção de fundo. Adquira uma moldura escura com o obturador do laser fechado para medir o ruído térmico médio que surge nos PMTs e no pedestal.

Finalmente, adquira imagens de fluorescência dependentes do pH e armazene-as para análise subsequente. Analise os dados como antes para avaliar o comportamento in vitro da fluoresceína e da rumina. Carregado no rimer, uma titulação de pH foi realizada usando um fluorímetro.

Esta figura mostra uma titulação típica de um sensor de pH. A fluoresceína e a rumina podem ser excitadas separadamente a 488 nanômetros e 550 nanômetros, respectivamente, permitindo uma diafonia mínima entre os dois canais, como pode ser visto claramente. A fluoresceína mostra um comportamento dependente do pH, enquanto o sinal de R domina não muda significativamente na faixa de pH fisiológico.

Portanto, a proporção desses dois sinais não depende da concentração do sensor, mas apenas do pH. Em seguida, para entregar o indicador intracelularmente, as células hela foram eletroporadas com os sensores dederer e a imagem confocal foi realizada conforme descrito neste vídeo. Essas imagens confocais mostram as células no canal de fluoresceína à esquerda, o canal de R domina no meio e exibidas como um mapa métrico da razão de pH à direita.

Fortes sinais de fluoresceína e r domina são observados, que co-localizam demonstrando a integridade da estrutura do sensor. Um mapa métrico de proporção é reconstruído dividindo as duas imagens pixel por pixel e é representado com uma pseudo escala de cores. Para calibrar a resposta do sensor dentro das células, o clampeamento do pH com ionóforos foi realizado conforme mostrado aqui.

Os indicadores respondem prontamente ao pH com uma mudança na proporção de verde para vermelho. Os dados resultantes foram usados para gerar uma curva de calibração para medições precisas de pH. A tendência linear na calibração demonstra a capacidade do sensor de responder ao pH sem qualquer perturbação do ambiente celular.

Para demonstrar como os sensores baseados em dendros podem ser empregados para imagens in vivo, a imagem de pH foi realizada no cérebro de um dendri ou camundongo anestesiado injetado. Os sinais de fluoresceína e r domina foram obtidos simultaneamente com excitação de 820 nanômetros, e o mapa de proporção foi construído pixel a pixel, semelhante às medições de células vivas. Notavelmente, os indicadores localizam-se no espaço extracelular, as áreas não fluorescentes na imagem identificam corpos celulares ou pequenos vasos sanguíneos para verificar a resposta do sensor ao pH.

Empregamos o uso de hipercapneia. De fato, sabe-se que o dióxido de carbono altera o equilíbrio dos tampões de carbonato no sangue e nos tecidos, resultando em uma acidificação do tecido. Como visto neste gráfico, a inalação de 30% de dióxido de carbono é suficiente para induzir uma forte resposta do sensor que é completamente reversível após a ventilação do mouse.

Esses resultados demonstram o potencial de sensores baseados em outras pessoas para destacar mudanças fisiológicas e patológicas de pH em células vivas e in vivo. R, nosso procedimento é compatível com outras medições, como registros eletrofisiológicos. Isso permitiu obter simultaneamente informações complementares sobre o processo biológico em andamento.

Este método, após seu desenvolvimento, abriu caminho para pesquisadores em biologia celular e neurobiologia explorarem processos regulados por pH em células de cultura e in vivo.