Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese In vivo
July 9th, 2013
A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em In vivo Contexto. Coloração por imunofluorescência de visualizar com precisão o plexo vascular é essencial para o sucesso destes tipos de estudos.
O objetivo geral deste procedimento é investigar a angiogênese na retina neonatal de camundongos. Isso é feito primeiro nucleando os olhos pós-natais e, em seguida, aplicando um fixador da terceira etapa é dissecar cuidadosamente a retina murnal pós-natal em forma de pétala, e a etapa final é manchar a vasculatura da retina. Em última análise, a visualização da vasculatura da retina do camundongo é obtida por meio de coloração fluorescente e microscopia confocal.
Demonstrando este procedimento estarão o Dr. Simon Tlo, um pós-doutorado em meu laboratório, e Kathleen Allenson, um membro anterior do meu laboratório. Ao longo deste procedimento, a temperatura padrão é a temperatura ambiente. Comece colocando um filhote de rato morto humanamente de lado com uma tesoura.
Remova a pele que cobre o olho. Em seguida, com a tesoura posicionada abaixo do olho, corte o nervo óptico e os tecidos circundantes e levante o olho. Transfira o olho enucleado para uma placa de 24 poços contendo fixador, que é 4% PFA em duas vezes.
A PBS prossegue com a dissecação do próximo olho enquanto um está no fixador. O escalonamento entre as duas dissecções oculares será de meio minuto. Com prática.
Deixe cada olho fixar por 10 a 15 minutos. Em seguida, transfira-os para o frio duas vezes PBS no gelo por pelo menos cinco a 10 minutos. Antes de isolar as retinas, colete quantos olhos desejar no PBS, usando uma pipeta de pastagem de plástico que foi cortada para alargar o javali.
Transferir os olhos para uma placa de Petri contendo duas vezes PBS sob um microscópio de dissecação. Remova qualquer gordura ao redor do olho usando uma pinça e uma tesoura. Perfure a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte ao redor da córnea e da íris, descarte esses tecidos.
Em seguida, insira a pinça entre a retina e a esclera. Remova a esclera, tomando cuidado para não rasgar a retina. A camada coróide também pode ser removida, desde que não haja risco de danificar a retina.
Deixar a camada coróide ligada não deve afetar significativamente a qualidade da imunocoloração. Agora usando uma pinça, remova a lente e o humor vítreo. Em seguida, remova os vasos alóides.
Use uma pinça fina para juntá-los no centro do olho. Em seguida, puxe-os rapidamente para longe do centro da retina. Tome cuidado extra para remover todo o cardo amarelo, porque se você deixar um pouco para trás, eles podem obscurecer seus resultados em pé.
A retina em forma de copo deve agora ser transferida para uma placa de Petri limpa e enxaguada com PBS. Agora na retina. Faça quatro a cinco incisões radiais que atinjam cerca de dois terços do caminho em direção ao centro.
Use uma tesoura de mola para criar esta retina em forma de pedal. Esta etapa requer paciência e prática para aperfeiçoar. Agora retire a maior parte do PBS usando uma pipeta de pastagem.
Isso achatará a retina. Em seguida, remova o excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. Em seguida, aplique menos 20 graus de metanol gota a gota na superfície da retina até que esteja quase submersa e, em seguida, adicione metanol generosamente.
As retinas ficarão brancas. Esta etapa ajuda a fixar as retinas e facilitará a permeação. Transfira as retinas do metanol frio para um pequeno tubo.
Usando uma pipeta de plástico de diâmetro largo. Deixe-os incubar no metanol frio por pelo menos 20 minutos, se necessário, as retinas podem permanecer no metanol a menos 20 graus por vários meses. O uso de anticorpos apenas aqui.
O cine não pode ser usado com sucesso na retina fixa materna. Nesse caso, a retina precisa prosseguir direto para a imunocoloração depois de achatá-la em forma de pétala. Comece pipetando cuidadosamente o metanol das retinas.
Em seguida, dê às retinas um enxágue rápido e suave em uma vez PBS. Remova o PBS e cubra as retinas com 100 microlitros de solução de bloco permanente com 5% do soro apropriado. Defina as retinas para tremer suavemente por uma hora depois.
Remova a solução de bloco permanente com uma pipeta e substitua-a por 100 microlitros de solução de bloco permanente contendo o anticorpo primário ou é selectina antes. Em seguida, defina as retinas para incubar durante a noite a quatro graus Celsius com balanço na manhã seguinte. Lave as retinas quatro vezes em PBS TX por 10 minutos por lavagem.
Aplique um balanço suave durante todas as etapas de lavagem. Se o anticorpo primário não for conjugado, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário fluorescente apropriado, diluído um a 200 em PBS tx. Incube as retinas durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente com agitação suave para remover o anticorpo secundário.
Lave as retinas quatro vezes em PBS TX com um balanço suave por 15 minutos por lavagem. Agora prossiga com a montagem. Transfira as retinas para as lâminas usando uma pipeta de plástico de diâmetro largo e remova qualquer excesso de P-B-S-T-X com um lenço de papel.
Em seguida, monte as retinas em 50 microlitros de ouro prolongado e cubra suavemente a solução com uma lamínula. Para permitir o prolongado ouro de conjunto refrigerar as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius, protegido da luz no dia seguinte. Prossiga com a imagem das retinas após a dissecção.
A retina deve se parecer com uma flor plana usando ISO selectin B quatro Alexa 4 88. As células endoteliais foram coradas e aparecem na cor verde. As células musculares vasculares de suporte foram visualizadas usando o músculo liso Antifa, actina a visão de baixa potência usando uma objetiva de cinco vezes, permitiu uma visão geral da organização vascular da retina usando uma combinação diferente de anticorpos.
As células endoteliais podem ser vistas usando imunocoloração anti CD 31, suportando parasitas onde visualizados usando um anticorpo contra NG dois. Alternativamente, os parasitas de suporte foram corados com anti desmina. A coloração anti-desmina visualiza os processos semelhantes a dedos dos parasitas e ajuda a determinar se eles estão intimamente associados às células endoteliais.
Em contraste, a coloração anti NG dois delineia os núcleos de cada parasita, o que é útil para quantificar o número de células do parasita na vasculatura. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar tocar e danificar a superfície da retina com suas ferramentas de dissecção. Após este procedimento, outro método como a coloração BD pode ser realizado para investigar a proliferação de células específicas.
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Visão Geral
Este procedimento investiga a angiogênese na retina neonatal de camundongos, um modelo bem caracterizado para o estudo do desenvolvimento vascular. Envolve dissecação cuidadosa e coloração da vascularização da retina para visualizar a angiogênese in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Angiogênese
- Desenvolvimento Retinal
Contexto
- A retina neonatal de camundongos é um modelo estabelecido para estudos de angiogênese.
- Compreender os papéis de genes e medicamentos na angiogênese é crucial para o desenvolvimento terapêutico.
- A coloração imunofluorescente é essencial para visualizar o plexo vascular.
- Este modelo permite investigações in vivo da modulação vascular.
Propósito do Estudo
- Investigar os mecanismos da angiogênese na retina neonatal de camundongos.
- Visualizar a vascularização da retina usando técnicas de coloração fluorescente.
- Demonstrar o procedimento para futuras aplicações de pesquisa.
Métodos Utilizados
- Nucléo de olhos pós-natais de camundongos.
- Aplicação de um fixador para preservar a estrutura do tecido.
- Dissecação da retina em forma de pétala para coloração ideal.
- Utilização de microscopia confocal para visualização da vascularização colorida.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida do plexo vascular da retina.
- Demonstração do processo angiogênico em um ambiente controlado.
- Insights sobre a modulação da angiogênese por vários fatores.
- Estabelecimento de um método confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A retina neonatal de camundongos serve como um modelo eficaz para pesquisas em angiogênese.
- A coloração fluorescente e a microscopia confocal são vitais para visualizar estruturas vasculares.
- Este procedimento pode auxiliar na compreensão das influências genéticas e farmacológicas na angiogênese.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
