Name: Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese In vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de coloração de imunofluorescência em montagem total da retina neonatal de camundongo para investigar a angiogênese in vivo. Este método permite visualizar o plexo vascular com microscopia confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust e da Fundação Britânica do Coração.

Todos os passos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. 1. Enucleação e Fixação de pós-parto Olhos <ol><li> Posicione o mouse sacrificados filhote de cachorro de lado, retire a pele que cobre o olho com uma tesoura. </li><li> Use uma tesoura e uma pinça para enuclear o olho. </li><li> Coloque tesoura abaixo do olho enucleado, cortar o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira para uma placa de 24 poços contendo 4% de paraformaldeído (PFA) confeccionados em 2x PBS à temperatura ambiente. </li><li> Permitir que cada olho para corrigir por 10 - 15 min, em seguida, transferir para o frio 2x PBS no gelo por 5 - 10 min. O melhor é escalonar enucleações e fixação posterior para garantir o grau de fixação é igual para cada olho. </li></ol> 2. Dissecção da Retinas Murino pós-parto <ol><li> Transferência de olhos em uma placa de Petri contendo 2x PBS usando uma pipeta Pasteur de plástico que foi cortada para alargar o furo e colocar sob um Dissecting microscópio. </li><li> Retire toda a gordura ao redor dos olhos usando uma pinça e tesouras. </li><li> Pierce a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte em torno da córnea e íris e descarte. </li><li> Insira fórceps entre retina ea esclera e remover a esclera tomando cuidado para não rasgar a retina. A camada coróide também pode ser removido, mas se houver um risco de danos na retina que ocorra durante este passo, a camada coróide, pode ser deixado em que não deve afectar significativamente a qualidade da imunocoloração. </li><li> Retire a lente eo humor vítreo usando uma pinça. </li><li> Remover os vasos hyaloids reunindo-os em conjunto no centro do olho com uma pinça fina e puxe rapidamente para longe do centro da retina (alternativamente recorte na base de vasos hialóide com uma tesoura fina). </li><li> Enxágüe a retina em forma de copo com PBS em uma placa de Petri limpa. </li><li> Adicione 4-5 incisões radiais que alcançam, aproximadamente, 2/3 do raio da retina utilizando mola Tesourasrs para criar uma forma de &quot;pétala&quot;. </li><li> Desenhe off PBS usando uma pipeta Pasteur para achatar a retina e, em seguida, retire o excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. </li><li> Lentamente pipeta frio (-20 ° C) queda de metanol por queda sobre superfície de retina até totalmente coberto e, em seguida, inundação com metanol adicional. Isso vai ajudar a consertar as retinas e irá facilitar a permeabilização. As retinas ficará branco. </li><li> Transferir para um tubo de 2 ml usando uma pipeta de Pasteur de plástico que foi cortado para alargar o furo. </li><li> Deixe retina em metanol frio por pelo menos 20 min antes de prosseguir com imunomarcação. Dos anticorpos utilizados aqui, apenas VE-caderina não pode ser utilizado com sucesso em metanol retinas fixos. Neste caso retinas precisa avançar direto para a imunocoloração após a etapa 9. </li><li> Se necessário, as retinas podem ser armazenadas em metanol a -20 ° C durante vários meses antes da coloração. </li></ol> 3. Immuno / coloração isolectin da retina Vasculature <ol><li> Cuidadosamente remover / deitar fora metanol e lavar cuidadosamente as retinas brevemente em PBS (nesta fase a retina ainda está no mesmo tubo de 2 ml a partir da etapa 11). </li><li> Remover PBS e tampa retinas com 100 ul de solução de Perm / Bloco (PBS + 0,3% Triton + BSA a 0,2%) + 5% de soro apropriado (ver Tabela 1) e agitar suavemente durante 1 hora. </li><li> Remover Perm / Bloco retinas e incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários seleccionados (ver Tabela 1) e / ou IsolectinB4, todas preparadas por diluição em Perm / bloco. </li><li> Remover anticorpo / isolectin retinas e lavar 4 x 10 min em PBS + 0,3% de Triton (PBSTX). </li><li> Em alguns casos, por exemplo, a seguir a coloração com IsolectinB4-Alexa488 ou a um anticorpo primário directamente conjugados com um anticorpo secundário não é necessária e as retinas podem ser montados directamente (passo 7). Quando um anticorpo primário não conjugado tenha sido utilizado no passo 3, em seguida 100 ul da adequado fluorescent anticorpo secundário (diluição 1/200 em PBSTX) é adicionado e deixado a incubar durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo secundário e lava-se as retinas de 4 x 15 min em 2 ml de PBSTX. </li><li> Transferir retinas em lâminas utilizando uma grande furo pipeta de Pasteur de plástico e remover o excesso de tecido absorvente com PBSTX. Mount retinas pela adição de 50 mL de prolongar montagem sobre uma lamela e posição suavemente sobre a retina. </li><li> Transferir lâminas para frigorífico durante a noite a 4 ° C, assegurando que são planas e protegida da luz, para permitir a montagem prolongar para definir. </li><li> Retina de imagem usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336(2012).</li>
<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui apresentado oferece uma maneira simples e eficaz para obter imagens das preparações de montagem de retinas inteiras coradas neonatais de rato, tornando-se um modelo facilmente quantificáveis ​​e fisiologicamente relevante da angiogénese. Inicialmente, o olho do rato pode ser bastante difícil para dissecar devido ao seu pequeno tamanho e forma do globo, então um pouco de prática e boas ferramentas de dissecação são necessários para obter resultados confiáveis. Dissecação de olhos preparado na concentração 2...

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula &quot;ponta&quot;, que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais &quot;stalk&quot;. Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos 1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular. Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência 2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto4 organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica. Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de 5 P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem 5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado 6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento. Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a 7) por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico 3 ml</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>PIP4210</td><td>Remova a ponta com uma tesoura para criar um furo largo</td></tr><tr><td>Placas BD Falcon de 24 poços</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri selecionadas TV 90 mm</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>lâminas Histobond</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinças #5</td><td>World precision instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola de 10,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 8 mm World</td><td>precision instruments</td><td>501235</td><td>Utilizada para enucleação</td></tr><tr><td>Tesoura Vannas de 8,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 7 mm e pontas superfinas de 0,025 x 0,015 mm</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>500086</td><td>Usado para dissecar retina</td></tr><tr><td>Tesouras vannas superfinas de 8 cm de comprimento com lâminas retas de 3 mm, e pontas superfinas de 0,015 x 0,015 mm Instrumentos de</td><td>precisão mundiais</td><td>501778</td><td>Usado para dissecar</td></tr><tr><td>retina cristalina&#8217; tubos</td><td>2 ml Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibásico</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Maquiagem em 2x PBS e armazene em -20 &#176; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold reagente anti-desbotamento</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Reagente de montagem</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Use em Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>Use na diluição 1:200</td></tr><td colspan="4">Anticorpos primáriosAnti-NG2 (policlonal de coelho)Millipore AB5320 Detecta pericitos Anti-GFAP (clone GA5, monoclonal de camundongo)Millipore MAB360 Detecta astrócitos Anti-Desmin (clone Y66,<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coelho monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Detecta pericitos</td></tr><tr><td>Anti-Colágeno IV (coelho policlonal)</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Detecta membrana basal vascular</td></tr><tr><td>Anti-alfa músculo liso actina-Cy3 (clone 1A4, monoclonal de camundongo)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Detecta células musculares lisas vasculares.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglina (clone MJ7/18, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Detecta células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Detecta células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-VE-Caderina (clone 11D4.1, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Detecta junções de células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (policlonal de cabra)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Detecta células</td></tr><tr> endoteliais<td colspan="4">Secondary Antibodies</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Anti-camundongo de cabra-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Asno anti-cabra-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Microscópios</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Câmera Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>para microscópio de dissecação</td></tr><tr><td>Microscópio Epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager com câmera Apotome</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Câmera Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td> para microscópio confocal <td>Axioimager</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount coloração de imunofluorescência do rato retina neonatal para investigar angiogênese<em&gt; in vivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

A angiogénese é o processo complexo da nova formação de vasos sanguíneos definido pelo surgimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes. A angiogénese desempenha um papel importante não só no desenvolvimento normal dos órgãos e tecidos, mas também de muitas doenças em que a formação de vasos sanguíneos é desregulada, tal como o cancro, cegueira e doenças isquémicas. Na vida adulta, os vasos sanguíneos são geralmente de repouso para a angiogênese é um alvo importante para a novela desenvolvimento de drogas para tentar regular a formação de novos vasos especificamente na doença. A fim de entender melhor a angiogênese e desenvolver estratégias adequadas para regulamentá-la, os modelos são necessários que refletem com precisão as diferentes etapas biológicos que estão envolvidos. A retina do rato neonatal fornece um excelente modelo da angiogénese porque as artérias, veias e capilares desenvolver para formar um plexo vascular durante a primeira semana após o nascimento. Este modelo também tem a vantagem de ter um dois-disional estrutura (2D) fazendo análise directa em comparação com o complexo anatomia 3D de outras redes vasculares. Ao analisar o plexo vascular retiniano em diferentes momentos após o nascimento, é possível observar os diferentes estádios da angiogénese sob o microscópio. Este artigo demonstra um procedimento simples para analisar a vascularização da retina de um rato utilizando a coloração fluorescente com anticorpos específicos isolectin e vascular.

Após a dissecção da retina deve ser semelhante a uma flor plana (Figura 1). Usando o protocolo descrito acima, as células endoteliais podem ser vistas por meio da coloração B4-Alexa488 isolectin e apoiando células musculares vasculares são visualizadas através de actina do músculo liso anti-alfa (Figura 2). O ponto de vista de baixa potência usando uma objetiva de 5X na Figura 2 permite uma visão geral da organização vascular da retina. Além disso, usando uma combinação...

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em<em&gt; In vivo</em&gt; Contexto. Coloração por imunofluorescência de visualizar com precisão o plexo vascular é essencial para o sucesso destes tipos de estudos.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a angiogênese na retina de camundongo neonatal. Isso é realizado primeiramente enucleando os olhos pós-natais, seguido pela aplicação de um fixador. O terceiro passo consiste em dissecar cuidadosamente a retina pós-natal em formato de pétala, e o passo final é a coloração da vasculatura retiniana. Em última análise, a visualização da vasculatura da retina de camundongo é obtida por meio de coloração fluorescente e microscopia confocal.Este procedimento será demonstrado pelo Dr. Simon Tlo, pós-doutorando em meu laboratório, e por Kathleen Allenson, ex-membro de meu laboratório. Ao longo deste procedimento, a temperatura padrão é a temperatura ambiente. Comece colocando um filhote de camundongo humanamente morto de lado com uma tesoura.Remova a pele que recobre o olho. Em seguida, com a tesoura posicionada abaixo do olho, corte o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira o olho enucleado para uma placa de 24 poços contendo fixador, que é PFA a 4% em duas vezes.Prossiga com a dissecação do próximo olho enquanto um está no fixador. O intervalo entre as dissecações dos dois olhos será de meio minuto. Com prática.De

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de...

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando...

Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Fonte: Bosco, A., et al.  In vivo Dinâmica da ativação microglial da retina durante a neurodegeneração: imagem oftalmoscópica confocal e morfometria celular no glaucoma de camundongo. J. Vis. Exp. (2015) Este vídeo demonstra imagens in vivo da microglia da retina em um modelo de glaucoma em camundongos. Um camundongo transgênico com microglia retiniana que expressa proteína fluorescente é posicionado sob um oftalmoscópio. A iluminação infravermelha é usada para localizar a cabeça do nervo...

Imagem in vivo da microglia retiniana em um modelo de camundongo com glaucoma

O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos...

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

A vasculatura da retina de camundongos é particularmente interessante na compreensão dos mecanismos de formação do padrão vascular. Este protocolo mede automaticamente o diâmetro dos vasos retinianos de camundongos a partir de imagens de fundo de angiografia fluorescente a uma distância fixa do disco óptico.

Medindo o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de angiografia fluorescente de camundongo

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Aprenda a técnica de coloração de imunofluorescência em montagem total da retina neonatal de camundongo para investigar a angiogênese in vivo. Este método permite visualizar o plexo vascular com microscopia confocal.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese

Explorar mais vídeos