Name: Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese In vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de coloração de imunofluorescência em montagem total da retina neonatal de camundongo para investigar a angiogênese in vivo. Este método permite visualizar o plexo vascular com microscopia confocal.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust e da Fundação Britânica do Coração.

Todos os passos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. 1. Enucleação e Fixação de pós-parto Olhos <ol><li> Posicione o mouse sacrificados filhote de cachorro de lado, retire a pele que cobre o olho com uma tesoura. </li><li> Use uma tesoura e uma pinça para enuclear o olho. </li><li> Coloque tesoura abaixo do olho enucleado, cortar o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira para uma placa de 24 poços contendo 4% de paraformaldeído (PFA) confeccionados em 2x PBS à temperatura ambiente. </li><li> Permitir que cada olho para corrigir por 10 - 15 min, em seguida, transferir para o frio 2x PBS no gelo por 5 - 10 min. O melhor é escalonar enucleações e fixação posterior para garantir o grau de fixação é igual para cada olho. </li></ol> 2. Dissecção da Retinas Murino pós-parto <ol><li> Transferência de olhos em uma placa de Petri contendo 2x PBS usando uma pipeta Pasteur de plástico que foi cortada para alargar o furo e colocar sob um Dissecting microscópio. </li><li> Retire toda a gordura ao redor dos olhos usando uma pinça e tesouras. </li><li> Pierce a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte em torno da córnea e íris e descarte. </li><li> Insira fórceps entre retina ea esclera e remover a esclera tomando cuidado para não rasgar a retina. A camada coróide também pode ser removido, mas se houver um risco de danos na retina que ocorra durante este passo, a camada coróide, pode ser deixado em que não deve afectar significativamente a qualidade da imunocoloração. </li><li> Retire a lente eo humor vítreo usando uma pinça. </li><li> Remover os vasos hyaloids reunindo-os em conjunto no centro do olho com uma pinça fina e puxe rapidamente para longe do centro da retina (alternativamente recorte na base de vasos hialóide com uma tesoura fina). </li><li> Enxágüe a retina em forma de copo com PBS em uma placa de Petri limpa. </li><li> Adicione 4-5 incisões radiais que alcançam, aproximadamente, 2/3 do raio da retina utilizando mola Tesourasrs para criar uma forma de &quot;pétala&quot;. </li><li> Desenhe off PBS usando uma pipeta Pasteur para achatar a retina e, em seguida, retire o excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. </li><li> Lentamente pipeta frio (-20 ° C) queda de metanol por queda sobre superfície de retina até totalmente coberto e, em seguida, inundação com metanol adicional. Isso vai ajudar a consertar as retinas e irá facilitar a permeabilização. As retinas ficará branco. </li><li> Transferir para um tubo de 2 ml usando uma pipeta de Pasteur de plástico que foi cortado para alargar o furo. </li><li> Deixe retina em metanol frio por pelo menos 20 min antes de prosseguir com imunomarcação. Dos anticorpos utilizados aqui, apenas VE-caderina não pode ser utilizado com sucesso em metanol retinas fixos. Neste caso retinas precisa avançar direto para a imunocoloração após a etapa 9. </li><li> Se necessário, as retinas podem ser armazenadas em metanol a -20 ° C durante vários meses antes da coloração. </li></ol> 3. Immuno / coloração isolectin da retina Vasculature <ol><li> Cuidadosamente remover / deitar fora metanol e lavar cuidadosamente as retinas brevemente em PBS (nesta fase a retina ainda está no mesmo tubo de 2 ml a partir da etapa 11). </li><li> Remover PBS e tampa retinas com 100 ul de solução de Perm / Bloco (PBS + 0,3% Triton + BSA a 0,2%) + 5% de soro apropriado (ver Tabela 1) e agitar suavemente durante 1 hora. </li><li> Remover Perm / Bloco retinas e incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários seleccionados (ver Tabela 1) e / ou IsolectinB4, todas preparadas por diluição em Perm / bloco. </li><li> Remover anticorpo / isolectin retinas e lavar 4 x 10 min em PBS + 0,3% de Triton (PBSTX). </li><li> Em alguns casos, por exemplo, a seguir a coloração com IsolectinB4-Alexa488 ou a um anticorpo primário directamente conjugados com um anticorpo secundário não é necessária e as retinas podem ser montados directamente (passo 7). Quando um anticorpo primário não conjugado tenha sido utilizado no passo 3, em seguida 100 ul da adequado fluorescent anticorpo secundário (diluição 1/200 em PBSTX) é adicionado e deixado a incubar durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo secundário e lava-se as retinas de 4 x 15 min em 2 ml de PBSTX. </li><li> Transferir retinas em lâminas utilizando uma grande furo pipeta de Pasteur de plástico e remover o excesso de tecido absorvente com PBSTX. Mount retinas pela adição de 50 mL de prolongar montagem sobre uma lamela e posição suavemente sobre a retina. </li><li> Transferir lâminas para frigorífico durante a noite a 4 ° C, assegurando que são planas e protegida da luz, para permitir a montagem prolongar para definir. </li><li> Retina de imagem usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência. </li></ol>

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<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui apresentado oferece uma maneira simples e eficaz para obter imagens das preparações de montagem de retinas inteiras coradas neonatais de rato, tornando-se um modelo facilmente quantificáveis ​​e fisiologicamente relevante da angiogénese. Inicialmente, o olho do rato pode ser bastante difícil para dissecar devido ao seu pequeno tamanho e forma do globo, então um pouco de prática e boas ferramentas de dissecação são necessários para obter resultados confiáveis. Dissecação de olhos preparado na concentração 2...

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula &quot;ponta&quot;, que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais &quot;stalk&quot;. Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos 1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular. Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência 2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto4 organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica. Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de 5 P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem 5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado 6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento. Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a 7) por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico 3 ml</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>PIP4210</td><td>Remova a ponta com uma tesoura para criar um furo largo</td></tr><tr><td>Placas BD Falcon de 24 poços</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri selecionadas TV 90 mm</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>lâminas Histobond</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinças #5</td><td>World precision instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola de 10,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 8 mm World</td><td>precision instruments</td><td>501235</td><td>Utilizada para enucleação</td></tr><tr><td>Tesoura Vannas de 8,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 7 mm e pontas superfinas de 0,025 x 0,015 mm</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>500086</td><td>Usado para dissecar retina</td></tr><tr><td>Tesouras vannas superfinas de 8 cm de comprimento com lâminas retas de 3 mm, e pontas superfinas de 0,015 x 0,015 mm Instrumentos de</td><td>precisão mundiais</td><td>501778</td><td>Usado para dissecar</td></tr><tr><td>retina cristalina&#8217; tubos</td><td>2 ml Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibásico</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>PBS reagente</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Maquiagem em 2x PBS e armazene em -20 &#176; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold reagente anti-desbotamento</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Reagente de montagem</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Use em Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>Use na diluição 1:200</td></tr><td colspan="4">Anticorpos primáriosAnti-NG2 (policlonal de coelho)Millipore AB5320 Detecta pericitos Anti-GFAP (clone GA5, monoclonal de camundongo)Millipore MAB360 Detecta astrócitos Anti-Desmin (clone Y66,<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coelho monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Detecta pericitos</td></tr><tr><td>Anti-Colágeno IV (coelho policlonal)</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Detecta membrana basal vascular</td></tr><tr><td>Anti-alfa músculo liso actina-Cy3 (clone 1A4, monoclonal de camundongo)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Detecta células musculares lisas vasculares.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglina (clone MJ7/18, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Detecta células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Detecta células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-VE-Caderina (clone 11D4.1, monoclonal de rato)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Detecta junções de células endoteliais</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (policlonal de cabra)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Detecta células</td></tr><tr> endoteliais<td colspan="4">Secondary Antibodies</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Anti-camundongo de cabra-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Asno anti-cabra-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Microscópios</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Câmera Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>para microscópio de dissecação</td></tr><tr><td>Microscópio Epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager com câmera Apotome</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Câmera Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td> para microscópio confocal <td>Axioimager</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount coloração de imunofluorescência do rato retina neonatal para investigar angiogênese<em&gt; in vivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

A angiogénese é o processo complexo da nova formação de vasos sanguíneos definido pelo surgimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes. A angiogénese desempenha um papel importante não só no desenvolvimento normal dos órgãos e tecidos, mas também de muitas doenças em que a formação de vasos sanguíneos é desregulada, tal como o cancro, cegueira e doenças isquémicas. Na vida adulta, os vasos sanguíneos são geralmente de repouso para a angiogênese é um alvo importante para a novela desenvolvimento de drogas para tentar regular a formação de novos vasos especificamente na doença. A fim de entender melhor a angiogênese e desenvolver estratégias adequadas para regulamentá-la, os modelos são necessários que refletem com precisão as diferentes etapas biológicos que estão envolvidos. A retina do rato neonatal fornece um excelente modelo da angiogénese porque as artérias, veias e capilares desenvolver para formar um plexo vascular durante a primeira semana após o nascimento. Este modelo também tem a vantagem de ter um dois-disional estrutura (2D) fazendo análise directa em comparação com o complexo anatomia 3D de outras redes vasculares. Ao analisar o plexo vascular retiniano em diferentes momentos após o nascimento, é possível observar os diferentes estádios da angiogénese sob o microscópio. Este artigo demonstra um procedimento simples para analisar a vascularização da retina de um rato utilizando a coloração fluorescente com anticorpos específicos isolectin e vascular.

Após a dissecção da retina deve ser semelhante a uma flor plana (Figura 1). Usando o protocolo descrito acima, as células endoteliais podem ser vistas por meio da coloração B4-Alexa488 isolectin e apoiando células musculares vasculares são visualizadas através de actina do músculo liso anti-alfa (Figura 2). O ponto de vista de baixa potência usando uma objetiva de 5X na Figura 2 permite uma visão geral da organização vascular da retina. Além disso, usando uma combinação...

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em<em&gt; In vivo</em&gt; Contexto. Coloração por imunofluorescência de visualizar com precisão o plexo vascular é essencial para o sucesso destes tipos de estudos.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a angiogênese na retina de camundongo neonatal. Isso é realizado primeiramente enucleando os olhos pós-natais, seguido pela aplicação de um fixador. O terceiro passo consiste em dissecar cuidadosamente a retina pós-natal em formato de pétala, e o passo final é a coloração da vasculatura retiniana. Em última análise, a visualização da vasculatura da retina de camundongo é obtida por meio de coloração fluorescente e microscopia confocal.Este procedimento será demonstrado pelo Dr. Simon Tlo, pós-doutorando em meu laboratório, e por Kathleen Allenson, ex-membro de meu laboratório. Ao longo deste procedimento, a temperatura padrão é a temperatura ambiente. Comece colocando um filhote de camundongo humanamente morto de lado com uma tesoura.Remova a pele que recobre o olho. Em seguida, com a tesoura posicionada abaixo do olho, corte o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira o olho enucleado para uma placa de 24 poços contendo fixador, que é PFA a 4% em duas vezes.Prossiga com a dissecação do próximo olho enquanto um está no fixador. O intervalo entre as dissecações dos dois olhos será de meio minuto. Com prática.Deixe cada olho fixar por 10 a 15 minutos. Em seguida, transfira-os para PBS frio duas vezes, sobre gelo, por pelo menos cinco a 10 minutos. Antes de isolar as retinas, colete quantos olhos desejar no PBS, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico que foi cortada para alargar a boca.Transfira os olhos para uma placa de Petri contendo duas vezes PBS sob um microscópio estereoscópico. Remova toda a gordura ao redor do olho utilizando pinça e tesoura. Fure a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte ao redor da córnea e da íris, descartando esses tecidos.Em seguida, insira a pin&ccedil;a entre a retina e a esclera. Remova a esclera tomando cuidado para n&atilde;o rasgar a retina. A camada de coroide pode tamb&eacute;m ser removida, desde que n&atilde;o haja risco de danificar a retina.Deixar a camada da coroide deve afetar significativamente a qualidade da imunomarcação. Agora, usando pinças, remova a lente e o humor vítreo. Em seguida, remova os vasos alóides.Use pin&ccedil;as finas para reunir os elementos no centro do olho. Em seguida, puxe-os rapidamente para fora do centro da retina. Tenha cuidado especial para remover todo o cardo amarelo, pois, se deixar algum para tr&aacute;s, ele pode obscurecer os seus resultados.A retina em formato de taça deve agora ser transferida para uma placa de Petri limpa e lavada com PBS. Agora, na retina, faça quatro a cinco incisões radiais que alcancem cerca de dois terços do caminho em direção ao centro.Use tesouras de mola para criar essa retina em forma de pedal. Esta etapa exige paciência e prática para ser aperfeiçoada. Agora, remova a maior parte do PBS usando uma pipeta de Pasteur.Isso irá achatar a retina. Em seguida, remova qualquer excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. A seguir, aplique metanol a menos 20 graus gota a gota sobre a superfície da retina até que ela esteja parcialmente submersa, e então adicione generosamente mais metanol.As retinas ficarão brancas. Este passo ajuda a fixar as retinas e facilitará a permeação. Transfira as retinas para o metanol frio em um tubo pequeno.Utilizando uma pipeta de plástico com orifício largo. Deixe-os incubar no metanol frio por pelo menos 20 minutos, se necessário; as retinas podem permanecer no metanol a menos 20 graus por vários meses. Uso exclusivo de anticorpos aqui.O cíneo não pode ser usado com sucesso em retina materna fixada. Nesse caso, a retina precisa seguir diretamente para imunomarcação após ser achatada em formato de pétala. Comece pipetando cuidadosamente o metanol das retinas.Em seguida, lave rapidamente e com cuidado as retinas em PBS 1×. Remova o PBS e cubra as retinas com 100 microlitros de solução bloqueadora de permeabilização contendo 5% do soro apropriado. Incube as retinas sob agitação suave por uma hora.Remova a solução de bloqueio de permeabilização com uma pipeta e substitua por 100 microlitros de solução de bloqueio de permeabilização contendo o anticorpo primário ou selectina conforme indicado anteriormente. Em seguida, deixe as retinas em incubação durante a noite a quatro graus Celsius com agitação, e no dia seguinte, lave as retinas quatro vezes em PBS-TX, sendo 10 minutos por lavagem.Realize movimentos suaves de agitação durante todas as etapas de lavagem. Se o anticorpo primário não estiver conjugado, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário fluorescente apropriado, diluído na proporção de um para 200 em PBS tx. Incube as retinas durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas à temperatura ambiente com agitação suave para remover o anticorpo secundário.Lave as retinas quatro vezes em PBS TX com agitação suave durante 15 minutos por lavagem. Prossiga agora com a montagem. Transfira as retinas para lâminas usando uma pipeta plástica de grande orifício e remova qualquer excesso de P-B-S-T-X com um papel absorvente.Em seguida, monte as retinas em 50 microlitros de prolonged gold e cubra cuidadosamente a solução com uma lamela. Para permitir que o prolonged gold solidifique, refrigere as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius, protegidas da luz; no dia seguinte, prossiga com a obtenção de imagens das retinas após a dissecação.A retina deve parecer uma flor plana usando a ISO selectina B quatro Alexa 4 88. As células endoteliais foram coradas e aparecem com coloração verde. As células musculares vasculares de suporte foram visualizadas usando Antifa actina muscular lisa, e a visão em baixa ampliação, utilizando uma objetiva de cinco vezes, permitiu uma visão geral da organização vascular da retina ao usar uma combinação diferente de anticorpos.As células endoteliais podem ser observadas por meio da imunomarcação com anti-CD31, enquanto os parasitas de suporte são visualizados utilizando um anticorpo contra NG2. Alternativamente, os parasitas de suporte foram corados com anti-desmina. A marcação com anti-desmina visualiza as projeções digitiformes dos parasitas e auxilia na determinação de se estão estreitamente associados às células endoteliais.Por outro lado, a coloração com anti-NG2 delimita os núcleos de cada parasita, o que é útil ao quantificar o número de células parasitárias na vasculatura. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar tocar e danificar a superfície da retina com os instrumentos de dissecação. Após este procedimento, outros métodos, como a coloração com BD, podem ser realizados para investigar a proliferação de células específicas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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