Name: Parabiose em Ratos: Um protocolo detalhado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a realizar parabiose em camundongos para estudar sistemas circulatórios compartilhados usando técnicas cirúrgicas. Este método permite analisar quimerismo sanguíneo sem imunossupressão.

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Os autores gostariam de agradecer a Adriane Mosley e Libuse Jerabek (Stanford) para obter assistência com a técnica cirúrgica.

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais e uso comitê da UCLA e os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A duração do procedimento descrito abaixo é cerca de 45-60 minutos do começo ao fim. 1. Preparação de campo cirúrgico <ol><li> Realize o procedimento em uma sala de cirurgia animal limpo. </li><li> Equipamento: isoflurano vaporizador, Gaymer T Bomba com almofada de aquecimento. </li><li> Ferramentas estéreis: duas pinças, tesouras curvas finas, porta-agulha. </li><li> Luvas estéreis deve ser usado durante todo o procedimento. </li></ol> 2. Preparação de Animais <ol><li> Colocar dois ratos machos ou fêmeas, do mesmo fundo genético, de peso e de tamanho semelhante na mesma gaiola e para monitorizar, pelo menos, duas semanas, para assegurar convivência harmoniosa. Ratinhos fêmeas são preferidos devido ao seu comportamento menos agressivo. </li><li> Anestesiar animais porutilizando um vaporizador de isoflurano. Ratinhos lugar em uma indução Secção Posi-Seal ligado ao vaporizador de isoflurano (4-5% v / v). Uma vez que a anestesia é induzida, transferir o animal para a área de raspar a pele e manter a anestesia ao longo do processo por meio de um cone de nariz ligada ao isoflurano (1,5-2% v / v). Aplicar pomada oftálmica com um Q-ponta para evitar os olhos secos. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal. Absolutamente raspar o lado esquerdo do rato colocado no lado esquerdo e do lado direito do rato colocado no lado direito a partir de cerca de 1 cm acima do cotovelo de 1 cm abaixo do joelho. </li><li> Assepticamente preparar as áreas raspadas através de uma profunda limpeza (2-3x) com panos encharcados de Betadine seguidos de algodão embebido em álcool. Colocar os ratos numa almofada aquecida coberto por uma compressa estéril. </li><li> Para analgesia, administrar carprofeno e buprenorfina por via intraperitoneal ou por via subcutânea na dose de 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, respectivamente. </li><li> Coloque os animais do seu lado, de costas, com umdjacent áreas raspadas viradas para cima. Para evitar a contaminação da zona cirúrgica, cobrir os ratos com um campo estéril expondo somente a área de operação. Criar uma pequena abertura cortina de ficar estéril ao realizar a cirurgia. Fizemos janela a cortina grande para ter uma visão melhor durante a filmagem. </li></ol> 3. Parabiose <ol><li> Usando uma tesoura afiada, faça incisões cutâneas longitudinais nas laterais raspadas de cada partida animais a 0,5 cm acima do cotovelo todo o caminho até 0,5 cm abaixo da articulação do joelho (Figura 1). Após a incisão, retirar suavemente a pele da fáscia subcutânea, mantendo a pele com um par de fórceps curvos e separar a fáscia com um segundo par para criar 0,5 centímetro de pele livre. Realize esta separação ao longo de toda a incisão. </li><li> Comece a juntar, anexando o olécrano esquerda um animal para o olécrano direito do outro. Ambos olecranons e articulações do joelho são claramente distinguíveis seguinte ªe incisão na pele. Para facilitar a adesão, dobrar o cotovelo do primeiro mouse e passar a agulha da não-absorvível 3-0 sutura sob o olécrano. Do mesmo modo, dobrar o cotovelo do segundo rato e passar o mesmo por baixo da sutura. Fixe firmemente juntas por um nó cirúrgico casal. </li><li> Ligar as articulações do joelho, seguindo o mesmo procedimento. </li><li> Após a fixação das articulações, ligar a pele dos dois animais com um absorvível 5-0 Vicryl contínuo iniciando ventral do cotovelo para o joelho. Para evitar a ruptura da pele e de separação realizar uma sutura de encerramento hermético da pele, na área em torno dos cotovelos e joelhos. Uma vez que a fixação da pele ventral foi concluída, execute um nó cirúrgico casal. Coloque os ratos na posição prona e continuar a sutura dorsal terminando com um nó cirúrgico casal. Verificar a continuidade do fio de sutura e confirmar a falta de aberturas. </li><li> Administrar 0,5 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea a cada rato para evitar desidrataçãodration. </li></ol> 4. Recuperação pós-operatória <ol><li> Manter os animais em pad aquecido até a recuperação. </li><li> Após a recuperação, fornecer analgésicos carprofen e buprenorfina. Repetir intraperitoneal ou por via subcutânea em 24 e 12 horas, respectivamente, durante 48 horas nas mesmas doses descritas acima (passo 2.5). Monitorar os animais para os sinais de dor e angústia, como tremores, letargia, mastigação de cauda, ​​costas arqueadas, a falta de higiene, etc diariamente durante duas semanas. </li><li> Profilaticamente, tratar ratos com sulfametoxazol / trimetoprima suspensão oral em sua garrafa de água 2 mg sulfa / ml 0,4 mg / ml aparar por 10 dias para evitar infecções bacterianas. </li><li> Casa cada par parabiótica em uma gaiola limpa de material de cama monolítico (por exemplo, papel toalha ou almofada absorvente estéril) para evitar a aspiração de material de cama. Retornar os animais para uma gaiola cheia de cama quando eles são capazes de manter decúbito esternal com a cabeça erguida. Para minimizar a tensãode pegar comida enquanto ajusta a existência parabiótica, coloque os grãos de ração umedecida no chão da gaiola. Fornecer material de nidificação. Em 1-2 semanas camundongos parabiótico têm a capacidade de deambular normalmente em pares cirurgicamente frente-e membros pélvicos. </li><li> Quimerismo sanguíneo ocorre 10-14 dias após a cirurgia. </li></ol> 5. Confirmação e procedimento inverso <ol><li> Depois de duas semanas extrair o sangue das veias da cauda de cada rato para análise por citometria de fluxo para confirmar quimerismo sanguíneo (Figura 3). </li><li> Processamento de sangue para análise de citometria de fluxo: diluir 2-3 gotas de sangue de 500 ul de EDTA 10 mM. Adicionar 500 ul de 2% de dextrano (diluído em PBS), homogeneizar e incubar a 37 ° C durante 30 min. Transferir o sobrenadante num novo tubo, centrifugação a 1.200 rpm durante 5 minutos e voltar a suspender as células peletizadas em PBS (ou outro tampão) para a análise de citometria de fluxo. </li><li> Dependendo delineamento experimental, o par parabiótico podem ser separados umt pontos de tempo posteriores. Em nossa experiência, temos mantido pares parabiosed para até 9 meses, sem quaisquer complicações. </li><li> Realizar procedimento inverso sobre uma superfície cirúrgico estéril. Anestesiar os ratos colocando-os em uma câmara de indução ligada a um vaporizador de isoflurano (4-5%) e manter a anestesia com 1,5-2% de isoflurano, conforme descrito acima (passo 2.2). </li><li> Remover os pêlos da área em torno da sutura inicial e assepticamente preparar as áreas raspadas, como descrito acima (passos 2.3, 2.4). </li><li> Para analgesia, administrar carprofeno e buprenorfina por via intraperitoneal ou por via subcutânea na dose de 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, respectivamente. </li><li> Cobrir a área cirúrgica com um campo estéril, tal como descrito acima (passo 2.6). </li><li> Utilizando uma tesoura afiada, separar os ratos por meio de uma incisão longitudinal ao longo da sutura lateral e separar cuidadosamente a fáscia recém formado entre os dois ratinhos com um par de pinças curvas. Para separar as articulações, cortar os nós de suturaconectá-los. Apare a pele ao longo da incisão para alcançar as bordas lisas e recolocar a pele com um contínuo 5-0 revestido sutura Vicryl absorvível. </li><li> Para prevenir a desidratação, administrar 0,5 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea, a cada murganho. Manter os animais em pad aquecido até a recuperação. </li><li> Após a recuperação, repetir administração de analgésicos, carprofeno (10 mg / kg) a cada 24 horas e buprenorfina (0,1 mg / kg) a cada 12 horas por 48 horas. </li><li> Para evitar infecções bacterianas tratar ratos com sulfametoxazol / trimetoprima suspensão oral (2 mg sulfa / ml 0,4 mg aparar / ml) em sua garrafa de água durante 10 dias. </li></ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

O método parabiose discutido aqui apresenta dificuldades e resultados técnicos mínimos em baixas taxas de mortalidade. A fixação do joelho e cotovelo é uma melhoria significativa da Bunster e técnica Meyer. No entanto, o procedimento invasivo permanece, assim, a manutenção de condições estéreis durante toda a cirurgia é imperativo. Para prevenir novas infecções do sítio cirúrgico, é importante que os animais parabiosed receber uma combinação de antibióticos e ser monitorizados regularmente. Para assegurar um suporte fir...

Parabiose, juntando-se a cirurgia de dois organismos, foi descrita pela primeira vez em 1864 por Paul Bert, como forma de desenvolver um modelo para o estudo de sistemas circulatórios compartilhados e consistiu na junção da pele e paredes musculares de dois ratos 1. Parabiose promove a formação de microvasos no local de inflamação 3 e tem tido várias aplicações em estudos fisiológicos, tais como a comunicação hormonal entre a glândula pituitária e gónadas, bem como o papel da hipertensão renal em 4. Foi ainda utilizado para investigar o recrutamento ea integração de células progenitoras na neovascularização 5, migração de células-tronco hematopoéticas 6 e tráfico de linfócitos 7, bem como o papel ea cinética de circular células inflamatórias ou resultam em metástase do tumor 8,9, e doenças neurodegenerativas 10. Uma vantagem significativa de mentiras Parabioseem que os animais parceria compartilham antígenos circulantes comuns, permitindo a migração de células e neovascularização, sem desencadear uma reação imunológica. Importante, Weissman et al. Demonstraram que parabiose entre ratinhos macho e fêmea não conduz à formação de anticorpos anti HY 11. No protocolo original descrito por Paul Bert os dois animais foram unidos por meio de ligação da pele e do músculo paredes 1. Este método, contudo, provocou pressão significativa para os animais e resultou na elevada taxa de mortalidade devido à infecção da ferida. Desde então, a técnica parabiose foi revisto por vários grupos, sendo os mais predominante o protocolo proposto por Bunster e Meyer em 1933 2. Seu método incluído união das articulações escápula, cavidades do corpo e da pele, permitindo um melhor apoio e menos dor para os animais. Ao mesmo tempo, o novo método resultou em cuidados pós-operatórios mínimos e signifisignificativamente diminuído as taxas de mortalidade. O protocolo aqui descrito é uma modificação da técnica de Bunster e Meyer, que é menos invasivo e permite juntar mais firme. Nomeadamente, os ratinhos são ligados através do cotovelo e do joelho, assim como a pele. Esta união impede a extensão da pele e, por conseguinte, provoca menos dor e as complicações. Aqui nós descrevemos a união de um tipo selvagem (WT) rato adulto com uma GFP constitutivo expressar mouse. Nós mostramos que duas semanas após a cirurgia que podemos alcançar 50% de quimerismo sangue que demonstra a eficácia deste procedimento cirúrgico para criar um sistema circulatório compartilhado.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano-Phoenix</td><td>Clipper</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Seal Câmara de Indução</td> Produtos de <td>Imagem Molecular</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia Portátil</td><td>Produtos de Imagem Molecular</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Gaymer T</td><td>Gaymar Industries, Inc</td><td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>Manta de Aquecimento (Almofada de Aquecimento)</td> <td>Kent Scientific Corp</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Curva</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>FST</td><td>FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

parabiose em ratos: um protocolo detalhado

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiose é uma união cirúrgica de dois organismos, permitindo a partilha da circulação sanguínea. Colocar a pele de dois animais promove a formação de microvasos no local da inflamação. Parceiros parabiótico compartilhar seus antígenos circulantes e, portanto, estão livres de reação imune adversa. Descrita pela primeira vez por Paul Bert, em 1864 1, a cirurgia parabiose foi refinado por Bunster e Meyer em 1933 para melhorar a sobrevivência de animais 2. No protocolo de corrente, dois ratinhos são unidas cirurgicamente na sequência de uma alteração da técnica de Bunster e Meyer. Os animais são conectadas através das articulações do cotovelo e joelho seguido por uma ligação da pele permitindo um apoio firme que impede pressão sobre a pele suturada. Relata-se em detalhe a parabiótico união de um GFP onipresente expressar mouse para um tipo selvagem (WT) mouse. Duas semanas após o procedimento, o par é separada e as células positivas para GFP pode ser detectada por meio de análise de citometria de fluxo no sangue circulanteíon do camundongo WT. O quimerismo sanguíneo permite examinar a contribuição das células circulantes de um animal no outro.

O resultado esperado de parabiose de dois organismos é a contribuição igual de sistema circulatório do animal para cada uma circulação de sangue comum (Figura 2). Pode-se facilmente verificar o equilíbrio bem sucedido do sangue dos ratinhos WT positivo e GFP parabiosed por análise de citometria de fluxo. Aqui, o sangue venoso foi obtida a partir das caudas de ambos parabionts às 2 semanas após a cirurgia e foi fraccionado por células sanguíneas periféricas (para excluir eritrócitos). A fracção de célula...

Parabiótico junção dos dois organismos conduz ao desenvolvimento de um sistema circulatório compartilhado. Neste protocolo, descrevemos os passos cirúrgicos para formar uma conexão parabiótico entre um rato do tipo selvagem e um rato expressando GFP constitutiva.

Parabiose em Ratos: Um protocolo detalhado

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a união parabiótica de dois camundongos para estudar um sistema circulatório compartilhado. Isso é realizado inicialmente fazendo uma incisão nos lados adjacentes dos animais. Após a separação da fáscia, os dois camundongos são firmemente conectados nas articulações do cotovelo e do joelho.O passo final é conectar a pele dos dois animais por meio de uma sutura contínua. Em última análise, a análise por citometria de fluxo pode mostrar quimerismo sanguíneo dentro de 10 a 14 dias após o procedimento. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como transplante de medula óssea ou injeção de células, é que ela não requer imunossupressão e também permite a manutenção da circulação CX por um longo período de tempo.Quem demonstrará o procedimento será Punctu Jaw. O cirurgião veterinário do meu laboratório, com pelo menos duas semanas de antecedência, prepare várias gaiolas com pares de camundongos do mesmo sexo, preferencialmente fêmeas, com mesma genética e tamanho e peso semelhantes. Uma vez que um par harmonioso tenha sido selecionado, realize a parabiose em uma sala limpa de cirurgia animal.Certifique-se de que t

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