Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

O objetivo geral deste procedimento é visualizar estruturas subcelulares em glândulas salivares murinas. Isso é feito expondo primeiro cirurgicamente as glândulas salivares sem danificá-las. Na segunda etapa, o animal anestesiado é imobilizado no estágio do microscópio.

Em seguida, as glândulas salivares são cuidadosamente posicionadas para não comprometer sua função na etapa final. O mouse é estabilizado com um suporte personalizado para minimizar quaisquer artefatos de movimento devido aos batimentos cardíacos ou respiração do animal. Em última análise, a dinâmica das estruturas subcelulares pode ser visualizada por microscopia intravital.

Antes da anestesia, pese os camundongos para determinar a dose adequada de anestésico. Em seguida, induza a pré-anestesia por inalação de flúor. Quando os animais estiverem inconscientes, confirme a sedação a cada 15 minutos com uma pitada e mantenha os camundongos sob lâmpada de calor durante a cirurgia.

Monitore a temperatura corporal dos animais com um termômetro de sonda retal. Agora raspe o pescoço do rato com um par de tesouras elétricas e, em seguida, use uma esponja de gaze embebida em etanol para limpar o lado ventral do pescoço, secando o excesso de álcool com o lenço umedecido. Em seguida, use uma pinça curva e opaca para levantar um pequeno pedaço de pele na extremidade inferior dos músculos massiter e faça uma pequena incisão.

Insira a tesoura na incisão, apontando as pontas para cima em direção à parte inferior da pele e abrindo as lâminas várias vezes até que a pele se separe do tecido subjacente. Em seguida, começando perto da base das glândulas salivares, onde o ducto nervoso e os vasos sanguíneos conectam a glândula ao resto do corpo. Use a tesoura para cortar uma tira de três milímetros de largura e 10 milímetros de comprimento de pele solta.

Depois de limpar a área da ferida, a abertura resultante será oval e medirá cerca de oito por 12 milímetros. Ambas as glândulas salivares serão visíveis. Use uma seringa para aplicar gel de acoplamento óptico no meio do corte e, em seguida, use pedaços novos de gaze estéril para limpar o gel em direção à parte externa da abertura até que todo o sangue e cabelos soltos sejam removidos.

Agora, use uma pinça número sete para encontrar a ponta da glândula salivar direita, agarrando o tecido conjuntivo alguns milímetros acima do topo da glândula. Em seguida, rasgue o tecido conjuntivo ao redor da glândula sem ferir o parênquima. Uma vez que a glândula esteja exposta, separe suavemente o tecido conjuntivo da glândula, lavando qualquer sangramento com solução salina.

Certifique-se de que todos os tecidos conjuntivos estejam separados e a glândula esteja totalmente exposta. Antes de levar o animal ao microscópio, coloque um pedaço grosso de gaze e uma bolsa de calor no estágio do microscópio, cobrindo a parte superior da bolsa de calor com um pedaço fino de gaze também. Coloque uma lamínula sobre o centro do palco.

Em seguida, posicione o mouse do lado direito em cima da gaze, prendendo o animal com um pedaço de fita adesiva no lado ventral da pata direita dianteira e uma sutura de seda presa ao redor dos incisivos. Crie alguma tensão entre o fio e a pata e prenda-os no palco. Com mais fita adesiva, a glândula salivar deve descansar naturalmente.

No meio da lamínula. Use cunhas de plástico acopladas ao estágio do microscópio para estabilizar ainda mais a cabeça e o tórax do mouse. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de lenço de limpeza de lentes sobre a glândula.

Estenda ligeiramente a glândula e coloque um suporte personalizado sobre a glândula. Em seguida, acople firmemente o estabilizador ao palco com uma braçadeira de metal e fita adesiva. Cubra o animal com gaze e uma almofada térmica e monitore a temperatura das glândulas expostas com um termômetro equipado com sonda térmica flexível Imediatamente após estabilizar o animal, use a iluminação de epifluorescência para focar na superfície da glândula.

Avalie o fluxo sanguíneo nos capilares e a morfologia geral do tecido. Para excitar o gene GFP, use um laser de 488 nanômetros. Defina a potência de pico para 0,5 miliwatts para evitar o fotobranqueamento da proteína do tomate tandem.

Use um laser de 561 nanômetros, definindo a potência de pico para um miliwatt. Agora avalie a estabilidade do tecido pré-escaneando a área selecionada. Se a preparação não for estável, ajuste o animal de acordo para encontrar o plano focal adequado.

No modo pré. Mova gradualmente a objetiva em direção à lamínula até que as estruturas do aser, os grânulos secretores e a membrana plasmática se tornem claramente visíveis. Em seguida, para obter imagens da dinâmica dos grânulos secretores, use uma velocidade de varredura de 0,5 a dois segundos por quadro e 256 por 256 pixels com uma escala espacial de 0,2 micrômetro por pixel.

Para visualizar de forma ideal os grânulos e a membrana plasmática, defina a espessura óptica entre 0,9 a 1,2 micrômetros. Em seguida, registre uma imagem do campo de visão a ser usada como ponto de referência. Finalmente, estimule a exocitose injetando subcutaneamente 0,1 miligrama por quilograma de isoproterenol e solução salina recém-preparados.

Um minuto após a injeção. A fusão dos grânulos secretores com a membrana plasmática será detectada por um aumento na fluorescência GFP ao redor dos grânulos e pela difusão do peptídeo de tomate em tandem em suas membranas limitantes. No camundongo de tomate GFPM, a asinina aparece como estruturas claramente distintas que expressam GFP citosólica e peptídeo de tomate em tandem direcionado à membrana, conforme indicado pelas linhas quebradas.

Em células asininas individuais são delineadas pelo peptídeo de tomate em tandem, conforme indicado pelas setas. A GFP também é detectada nos núcleos que são claramente visíveis dentro das células aser. A GFP citosólica indicada pela ponta da seta é excluída dos grânulos secretores que aparecem como vesículas circulares escuras de aproximadamente um a 1,5 micrômetros de diâmetro.

Para visualizar eventos exofíticos, uma área representativa da membrana plasmática que é enriquecida em grânulos secretores, conforme indicado pelo asterisco, é mostrada após a injeção do isoproterenol. Um aumento nos níveis de fluorescência GFP denotado pelas setas verdes ao redor de alguns dos grânulos secretores que estão próximos à membrana plasmática pode ser observado. Além disso, após a fusão com a membrana plasmática, o peptídeo de tomate em tandem se difunde nas membranas limitantes dos grânulos secretores, conforme destacado pelas setas vermelhas.

Após 30 a 40 segundos, os grânulos secretos colapsam gradualmente e suas membranas limitantes são integradas à membrana plasmática apical. A abordagem apresentada aqui representa um grande avanço na biologia celular, pois permite a aquisição de imagens da dinâmica de um processo específico de tráfego de membrana em camundongos vivos.