Name: Funcionamento de um biorreator de bancada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-12T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a configurar e operar um biorreator de bancada para cultivo em grande escala de células bioengenheiradas. Este método demonstra montagem, calibração de sondas e monitoramento de parâmetros essenciais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projeto foi o apoio em parte pela Johns Hopkins University, Gabinete do Reitor através da Iniciativa Ciência Gateway.

<ol><li> Comece a operação com a configuração do navio. Um fermentador convencional tem os seguintes componentes que necessitam de ser instaladas (Figura 1): <ol><li> sonda de pH - para a medição do pH na cultura viva. Calibrar sonda antes da instalação e esterilizar com o navio. Instalar sonda no headplate. </li><li> pO 2 sonda - para a medição do teor de oxigênio dissolvido no interior do navio durante a fermentação. Instalar na headplate. </li><li> Tubo de colheita para a amostragem da cultura. Instale este componente altura ajustável na headplate. </li><li> Aspersor de gás - reside na parte inferior do recipiente e fornece infusão de gás para a cultura. Gancho sparger até a fonte de gás no fermentador e montar no headplate. </li><li> Veio do rotor e do rotor - do impulsor agita a cultura e é crítica para a manutenção da uniformidade da cultura no vaso. </li><li> Dos gases de escape do condensador - para reduzir a perda por evaporação no reservatório de arrefecimento o caminho dos gases de escape. </li><li> As linhas de bomba de reagentes para controle de pH ou adição na ração. </li></ol></li><li> Limpar o vaso e headplate com sabão e água. A escova macia é recomendada para esfregar o vaso e headplate. Lixívia ou produtos de limpeza com cloro não pode ser usado para limpar o vaso. </li><li> Se a mídia não é o calor lábil, adicioná-lo ao recipiente limpo. Só adicionar até que o volume de trabalho máxima é atingida. Neste caso, o volume de trabalho máxima é de 3,3 L para uma embarcação volume total de 5 L. </li><li> Monte o headplate navio, garantindo que o anel de vedação está bem encaixado. </li><li> Instale o condensador de gases de escape. </li><li> Instale a sonda antiespumante em sua porta de 10 mm. </li><li> Instale o tubo de colheita em sua porta de 10 mm. Coloque um pedaço de tubo na parte de cima e prenda-o. </li><li> Instale a tubulação e um filtro de 0,20 mM na entrada sparge e, em seguida, apertar esta off. </li><li> Calibrar a sonda pH: <ol><li> Reúna dois buffers de referência em pequenos copos, uma garrafa de lavagem, e um wa reposiçãoproveta sh. </li><li> Prenda o pH sonda até o fermentador e virar o fermentador diante. </li><li> Vá até o parâmetro pH e usando o botão de menu, vá até a opção &#39;Cal&#39;, e pressione &#39;Enter&#39;. </li><li> Selecione &#39;2 &#39;para a calibração de 2 pontos. </li><li> Lavar a ponta da sonda e submergir no buffer de referência baixo. O valor no fermentador irá estabilizar. Usando a teclas + e -, ajustar o valor exibido para coincidir com o valor do buffer de referência de pH. Uma vez que ele pára de piscar, pressione &#39;Enter&#39;. </li><li> Lave a sonda fora e inseri-lo no segundo tampão de referência. Permitir que o valor para estabilizar e, em seguida, utilize o teclado para fazer o valor apresentado corresponde ao valor do buffer de alta referência. Pressione &quot;Enter&quot; para confirmar. </li><li> Lave a ponta da sonda e desconecte-o do fermentador. Coloque a tampa de proteção na conexão e instalá-lo no headplate. </li></ol></li><li> Abra a ponta da sonda pO 2 e verifique se háeletrólito é suficiente para cobrir a ponta. Se não, adicione um pouco para o reservatório e fechá-lo de volta. </li><li> Instale a sonda pO 2 no headplate e certifique-se de que a tampa é colocada em autoclave para proteger suas conexões elétricas. Vai ser calibrado depois de esterilização. </li><li> Obter uma garrafa para alimentação do reagente com um tubo de imersão e filtro de ar. Adicionar tubulação de bomba à porta de tubo de imersão e conecte a outra extremidade à porta de entrada no fermentador. </li><li> Local tubulação em todas as portas não utilizadas, em seguida, apertar a tubulação fora. </li><li> Instalar um filtro de 0,45 um no condensador os gases de escape. Este filtro assegura que o recipiente não é pressurizar na autoclave. </li><li> Verifique se todos os tubos que vão abaixo do nível dos meios de comunicação são presas off para evitar que materiais de sair. </li><li> Colocar o recipiente em autoclave durante 25 - 30 min a 121 ° C, ciclo de líquidos. Cuidado: Quando ele sai ele vai estar muito quente. </li><li> Instale o navio na base fermentador. </li><li> Ligue o pHsondar a cabo. </li><li> Conecte o cabo da sonda pO 2. </li><li> Prenda o pulverizador até o rotâmetro adição de gás. </li><li> Esterilmente adicionar um reagente NaOH M para a garrafa com o tubo de imersão e instalar a cabeça da bomba sobre a cabeça do eixo da bomba de base. </li><li> Coloque o sensor de temperatura no poço no headplate. Certifique-se de que ele vai todo o caminho até o fundo do poço. </li><li> Abaixe o braço de agitação para o acoplamento vasos impulsor. </li><li> Certifique-se de que o fermentador está ligado. </li><li> Entrada de água que está disponível para o fermentador. </li><li> Ligue o suprimento de ar para o fermentador. </li><li> Vá até o parâmetro de temperatura e ajustar a temperatura para 37 ° C. Pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar o controle de temperatura. O navio vai esquentar em 15 min ou menos. </li><li> Vire o fluxo de gás para um volume do reservatório de mídia por minuto ou menos. Para esta configuração, o fluxo de gás é de 3 L / min. Bubbles deve aparecer na parte inferior. </li><li> Vá até a agitação parameter e ajustado para 300 rpm. Pressione &quot;Enter&quot; para ligar a agitação. </li><li> Quando a temperatura atingiu 37 ° C, vá até o parâmetro pH e configurá-lo para 6,8. Gire o controle de pH, pressionando o botão &quot;Enter&quot;. </li><li> Definir agitação à velocidade máxima de 1.000 rpm para a corrida. </li><li> Certifique-se de que a sonda pO 2 é polarizado corretamente para exibir valores adequados. Depois de 2 horas, vá até o parâmetro pO 2 e use o botão &quot;Menu&quot; para selecionar o &#39;Função Calibrar &quot;e selecione a calibração de 1 ponto. </li><li> Após 15 min, use os cursores para definir o valor a 100 e pressione &#39;Enter&#39;. Isto irá calibrar pO 2. </li><li> Vá até a agitação e definido para 300 rpm. </li><li> Usando o botão &quot;Menu&quot;, rode o &#39;Cascata&#39; para &#39;on&#39; no menu agitação. Isto irá aumentar a velocidade de agitação, em um esforço para cortar-se bolhas de ar e forçar mais oxigênio em solução enquanto a demanda de crescimento aumenta. </li&gt; <li> Vá até o parâmetro pO 2 e defina o valor para 30. Pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar a pO 2. </li><li> Inicie o pacote de software de controle no PC. </li><li> Uma vez que as sondas são calibradas, a agitação é estável a 300 rpm, a temperatura é de 37 ° C e o pH é próximo de 6,8, isto é o tempo para inocular. A utilização do álcool, esterilizar a porta que vai ser utilizado para a inoculação. </li><li> Desenhar o inoculo para uma seringa e adiciona-o à porta esterilizado. Feche a porta. </li><li> Marque o tempo de inoculação em um livro de registro. </li><li> Também é importante ter uma amostra em vez de esterilização. Esterilizar a extremidade do tubo do tubo de colheita com álcool. </li><li> Abra o grampo que cobre a porta colheita e usar uma seringa para tirar uma amostra. Esta primeira amostra é geralmente descartado porque se tem sentado no tubo. </li><li> Use outra seringa para puxar outra amostra. </li><li> Com uma terceira seringa, empurrar o ar para trás através do tubo para remover o máximo volume mortoa partir da linha e prender a linha off. </li><li> Determinar a densidade de células e pH e registrar os valores. Com culturas microbianas, é útil para registrar valores de cada hora. Intervalo é a cultura dependente. </li><li> Metodologia de colheita depende da intenção para a cultura após o término do crescimento. Neste caso, experimentar a cultura uma última vez para receber valores de ponto final para a densidade celular e possível pH ou medição do peso celular molhado. Abra o headplate eliminados os conteúdos em um designado &quot;tanque matar&quot; com lixívia ou outros agentes antimicrobianos. </li></ol>

<ol><li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShuler%2C+M+%22Bioprocess+Engineering+Basic+Concepts%22">Bioprocess Engineering Basic Concepts</a>. , 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).</li>
<li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Wave [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave">http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave</a> (2012).</li>
<li>Xcellerex [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm">http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm</a> (2012).</li>
<li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor%2C+Monitoring%2C+Modeling+and+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li>
<li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1%3A+Identifying+a+Formulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li>
<li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan%2C+a+bioengineered+heparin+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).</li>
<li>Bioreactors [Internet]. , Applied Technical Resources. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf">http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf</a> (2012).</li>
<li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInfors%2C+HT+%22Minifors+operating+Manual+and+user+guide%22">Minifors operating Manual and user guide</a>. , Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.</li>
</ol>

Autor A. Magno é um funcionário da ATR Biotech que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Biorreatores de tanque agitado são o padrão da indústria de biotecnologia e têm sido utilizados por mais de 40 anos 1. O pequeno tanque agitado tem sido importante para o aumento de escala, escala-down, otimização de tensão, caracterização e desenvolvimento de processos. Também pode ter um papel importante no desenvolvimento da medicina individualizada 2. O biorreator de pequena escala é mais parecida com condições in situ para o crescimento celular, porque ele pode ser monitorado e otimizado ao longo de um prazo. Na maioria das vezes, as experiências iniciais são realizadas usando balões de agitação, mas as condições no biorreactor de pequena escala difere significativamente do balão de agitação. Em um experimento verificou-se que as condições para o crescimento ideal do E. coli e a produção de Proteína Fluorescente Verde (GFP) no frasco de agitação não se traduziu para o tanque agitado (dados não publicados). Outros métodos de células cultivadas em larga escala incluem garrafas de rolo, único use balançando biorreatores plataforma 3 e maiores biorreatores de uso único com volumes de trabalho de 50 para 5.000 L. Cada método oferece desafios para scale-up, mas encontrou um lugar em produção. O uso único de balanço plataforma bioreactor é semelhante ao tanque agitado, e proporciona um ambiente regulado. Difere do tanque agitado em que a mistura ocorre devido um movimento de balanço para gerar ondas para impedir a sedimentação das células e fornecer oxigenação. A hidrodinâmica para este método são diferentes do tanque agitado e volume máximo é limitado a 1,000 L. As diferenças podem afectar o crescimento celular e produção de produto. Outros sistemas de uso único combinar o tanque agitado com o reator descartável para, fornecer uma plataforma com um mínimo de infra-estrutura e sobrecarga associada, ea capacidade de high-throughput Bioprocessing 4. Novos usuários de biorreatores de bancada pode ter problemas para determinar valores nominais iniciais para pH, pO 2 e temperaturatura, no entanto, a pesquisa publicada pode ser referenciado por esta informação 5, 6, 7, 8, 9. Com culturas de bactérias, em particular, recomenda-se iniciar a agitação à mesma velocidade que o balão agitador e a temperatura ao mesmo ponto de ajuste. Cultura de pH a partir de frascos de agitação é executado anteriores também podem ser utilizadas como um ponto de partida. Ajuste do valor pO 2 é mais difícil e normalmente é determinado empiricamente. No entanto, começando com 50% pO 2 é um ponto de partida recomendado.

A tecnologia básica de fermentação é uma extensão da técnica frasco agitado simples para o cultivo de culturas. Ele cresceu a partir do desejo de controlar os ambientes de crescimento para culturas vivas de uma forma mais completa e quantitativa. Lote frascos agitados cultura são geralmente limitados pelo controle impreciso da temperatura. Uniformidade de temperatura em um shaker incubadas ou sala quente é altamente variável, às vezes desviando 5 ° C ou mais, do ponto de ajuste pretendido. Uma vez que o balão de agitação é normalmente agitada a uma velocidade fixa, a troca de oxigénio e absorção de gás é limitado. Uma vez que o oxigênio ambiente disponível se esgota, a maioria das culturas não conseguem prosperar. Não há nenhum controlo do pH em frascos de agitação. Em muitos casos, se a cultura não é limitada pela carga de alimentação, torna-se ácida até ao ponto de prejudicar a cultura e respiração diminui drasticamente. A maioria das culturas em balão de agitação também são executados como um &quot;lote&quot;, o que significa que eles são alimentados apenas uma vez em ou perto do início das culturas inoculation. Após esta fonte de carbono inicial é consumida, a cultura pára de crescer. Em alguns casos, o seu metabolismo pode deslocar e começar a consumir outros metabolitos no caldo de cultura, por vezes, alterando as características da biomassa resultante ou proteína. Shaker também são geralmente sujeitos a mídia a perda por evaporação em ambientes de cultura mais quentes, geralmente 10% do volume por 24 horas a 37 ° C. Esta perda altera a densidade da cultura e proíbe o funcionamento a longo prazo do sistema. Por fim, o usuário pode encontrar a formação de espuma da mídia após agitação. A ocorrência de espuma no espaço de cabeça acima da cultura vai limitar as trocas gasosas e um maior crescimento do joelho. O sistema básico de fermentação é projetado para lidar com todas essas limitações. Controle cuidadoso da temperatura é conseguido em recipientes de fermentação pela utilização de agitação do impulsor e uma camisa de aquecimento. Um sensor inserido no navio e feedback de controle de aquecimento e arrefecimento de uma jaqueta normalmenteresulta em controle de temperatura ± 0,1 ° C em torno do valor nominal. Fermentadores de bancada geralmente fornecem o controle de pH através de adição de reagentes líquidos através de uma bomba. O valor de pH é monitorado continuamente, em um esforço para manter o ambiente ideal para o crescimento celular. Arejamento adequado é mantido pelo impulsor de mistura acima mencionada ou pela infusão de ar ou oxigénio gasoso suplementado directamente na cultura. Com culturas sensíveis ao cisalhamento, o gás oxigênio complementada é o principal mecanismo para a manutenção do nível de oxigênio na cultura. A medição do oxigénio em solução é geralmente conseguido por uma sonda polarográfica que não está normalmente disponível para utilização em frascos de agitação. Também é possível adicionar de forma contínua ou periodicamente de alimentação para o recipiente para manter o crescimento de uma forma linear ou exponencial. O gás de saída do condensador fornece uma superfície fria de vapor no fluxo dos gases de escape para condensar, preservando assim o volume da cultura e densidade. Adição periódica de anti-espuma tensioactivo é actuadapor uma sonda de condutividade na cultura, a redução de espuma na superfície e permitindo a troca de gás. O navio, com todas as sondas, acessórios, impulsores, tubos de colheita, e tubos, é montado e esterilizado num autoclave padrão. Após as calibrações de sonda final de estabilização e ao ambiente de operação, a cultura é adicionada ao recipiente. O sistema pode, então, ser utilizado para caracterizar a cultura de uma forma que é mais quantitativo e preciso do que com um método em frasco de agitação. O controlo rigoroso da temperatura, pH, teor de oxigénio, consumo de alimento, o líquido de evaporação, e níveis de espuma contribuem para uma biomassa muito mais elevada e melhor rendimento de proteína.

<table><tbody><tr><td>LB caldo</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A1593-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>antiespumante 204</td><td>Sigma</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma</td><td>38215-1EA-R</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de referência, pH 4,00</td><td>Sigma</td><td>B5020</td><td></td></tr><tr><td>Referência Tampão, pH 7,00</td><td>Sigma</td><td>B4770</td><td></td></tr><tr><td>sonda pO2 eletrólito</td><td>Broadley James</td><td>AS-3140-C30-0025</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,45 mícron</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-02915-22</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,22 mícron</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-29950-40</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer Lock, 10 mL</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07940-12</td><td></td></tr><tr><td>Minifors Bioreactor</td><td>Infors HT</td><td>Bomba de ar B-Pack 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Air Admiral</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-79202-00</td><td></td></tr><tr><td>1175 PD Circulador de refrigeração</td><td>VWR</td><td>13721-204</td><td></td></tr></tbody></table>

funcionamento de um biorreator de bancada

Operation of a Benchtop Bioreactor

Sistemas de fermentação são usados ​​para proporcionar um ambiente de crescimento ideal para muitos tipos diferentes de culturas de células. A capacidade proporcionada pela fermentadores para controlar cuidadosamente a temperatura, o pH e as concentrações de oxigénio dissolvido, em particular, torna essencial para o crescimento em larga escala eficiente e da expressão de produtos de fermentação. Este vídeo vai descrever brevemente as vantagens do fermentador durante o balão de agitação. Ele também irá identificar os principais componentes de um sistema de fermentação típico de bancada e dar instruções básicas sobre a configuração do navio e calibração de suas sondas. O telespectador vai se familiarizar com o processo de esterilização e mostrado como inocular o meio de crescimento no vaso com a cultura. Conceitos básicos de operação, a amostragem, e colheita também será demonstrado. Também será discutida a análise de dados simples e limpeza do sistema.

O biorreactor pode ser executada com ou sem o software IRIS. No entanto, para capturar dados, é melhor usar o software. Antes de adição de bactérias, os sensores de pH e oxigênio deve ser calibrado, o conjunto de velocidade do rotor eo conjunto de temperatura. Na Figura 2, a saída de dados para um biorreactor de execução é apresentado. A temperatura foi ajustada para 30 ° C, a velocidade do impulsor de 200 rpm. Os parâmetros podem ser diferentes para cada experiência, mas antes da adição de bactérias, o sistema deve estar no estado estacionário. Na Figura 3, a variação da concentração de oxigénio, com a adição da cultura bacteriana é mostrado. Os pontos de ajuste para esta experiência são 37 ° C, agitação a 200 rpm, O 2 a 70%. No momento 19:20, a bomba de alimentação fornece a cultura semente bacteriana em um OD de 0,1 causando uma queda de imediato no nível de O 2. O biorreactor responde ao O 2 nível mudando com o aumento do fluxo de ar e velocidade do impulsor. Tele set-points para os aumentos são definidos em cascata (passo 35). O pH do reactor foi monitorizada em tempo real, com a diminuição do pH, em seguida, aumentando, como demonstrado pela linha de flutuação do pH ao longo do tempo (Figura 4). Toda a execução pode ser analisada e os parâmetros ajustados para os experimentos posteriores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Figura 1. Biorreator de bancada com todas as partes marcadas e ligadas. Esta figura mostra o reactor de tanque agitado, no início de uma corrida. As partes do reator são rotulados e incluem os sensores, rotor, medidor de temperatura, garrafas de alimentação e de amostragem, porta de escape, medidor de pressão de ar, câmara de aquecimento, torre de condensador, e painel de controle. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem da tela do biorreator software no início da corrida. No início de uma corrida de tanque com agitação, a temperatura foi fixada em 30 ° C (linha verde), a velocidade do rotor para 200 rpm (linha vermelha), pH 6,5 (linha verde), e pO 2 em 57,2% (linha azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem da tela do software biorreator durante a corrida como o oxigênio diminui. Quando a cultura está em fase de crescimento ativo, consome oxigênio ea quantidade de oxigênio no reator é reduzida (linha azul). Através do aumento da velocidade do rotor, mais oxigénio pode ser adicionado à cultura (linha a vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar figura</a> . Figura 4. A imagem do ecrã de software bioreactor que mostra a mudança do pH ao longo do tempo. Se o pH da cultura é monitorizado continuamente ao longo do tempo e diminui à medida que o ácido láctico é produzida e, em seguida, aumenta como base é adicionada ao bioreactor (linha azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar figura</a> .

Os fermentadores são usadas para aumentar o rendimento da cultura e da produtividade de células de bioengenharia. Após triagem vários microbianos ou animais de cultura de células candidatos em shaker, o próximo passo lógico é aumentar a biomassa da cultura selecionada com o fermentador. Este vídeo demonstra a instalação e operação de um sistema de bancada biorreator típico.

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

O objetivo geral deste procedimento é montar um biorreator que forneça um ambiente controlado para o crescimento em larga escala de células bioengenharadas. Isso é realizado primeiramente montando o vaso, calibrando a sonda de pH e autoclavando o vaso montado. O segundo passo é conectar o vaso autoclavado à base do fermentador e definir os parâmetros de velocidade do agitador, temperatura, pH e saturação de oxigênio.Em seguida, inicia-se a operação do biorreator para que a velocidade desejada do agitador, o ponto de ajuste de temperatura e a saturação de oxigênio sejam alcançados após a calibração manual da sonda de oxigênio. O passo final consiste em inocular o biorreator com o cultivo bacteriano e monitorar as condições do biorreator por meio do software do computador. Por fim, as características de crescimento do cultivo podem ser analisadas e o cultivo pode ser processado para extração e purificação do produto desejado.Neste vídeo, demonstramos a montagem e operação de um biorreator para fermentação bacteriana. A demonstração visual deste método pode ser útil, pois a montagem, calibração e monitoramento do biorreator podem ser tarefas desafiadoras para indivíduos não familiarizados com esta tecnologia. Pronto, vamos começar.Para começar, adicione o meio bacteriano que não seja termolábil ao recipiente limpo. Adicione apenas até atingir o volume máximo de trabalho, que é de 3,3 litros para um recipiente com volume total de cinco litros. Fixe a placa superior do recipiente, garantindo que a junta de vedação O-ring esteja corretamente posicionada. Instale o condensador de gás de exaustão.Instale o tubo de coleta em sua porta de 10 milímetros. Coloque um pedaço de tubo sobre ele. Conecte ao frasco de amostragem e prenda o tubo com uma braçadeira.Instale um tubo e um filtro de 0,2 mícron na entrada de borbulhamento e, em seguida, feche-o com uma braçadeira. Para calibrar a sonda de pH, prepare dois tampões de referência em béqueres pequenos, uma garrafa lavadora e um béquer para lavagem. Conecte a sonda de pH ao biorreator e ligue-a.Role até o parâmetro de pH e, em seguida, usando o botão de menu, role até a opção de vaca e pressione enter. Selecione dois para calibração de dois pontos. Lave a ponta do eletrodo de pH e mergulhe-a no tampão de referência baixo.O valor no fermentador se estabilizará utilizando as teclas de mais e menos. Ajuste o valor exibido para corresponder ao valor do tampão de referência de pH. Uma vez que pare de piscar, pressione enter a seguir.Lave o tampão de referência baixa do eletrodo e insira o eletrodo no segundo tampão de referência. Aguarde a estabilização do valor e, em seguida, use o teclado para ajustar o valor exibido ao valor do tampão de referência alta. Pressione enter para confirmar.Lave a ponta da sonda e desconecte-a do fermentador. Coloque a tampa protetora na conexão e instale-a na placa superior. Abra a ponta da sonda de oxigênio e verifique se há eletrólito suficiente para cobrir a ponta.Instale a sonda de oxigênio na placa de cabeça. Certifique-se de colocar a tampa de autoclave para proteger suas conexões elétricas, pois ela será esterilizada antes da calibração. Em seguida, obtenha um frasco para alimentação de reagentes com tubo de imersão e filtro de ar.Adicione a tubulação da bomba ao bocal do tubo de imersão e prenda a outra extremidade ao bocal de entrada do fermentador. Coloque tubulações em todos os bocais não utilizados e, em seguida, feche as tubulações com braçadeiras. Instale um filtro de 0,45 mícron no condensador de gás de exaustão. Esse filtro garante que o vaso não pressurize na autoclave.Verifique se todos os tubos que ficam abaixo do nível do meio estão presos com braçadeiras para evitar vazamentos do meio. Coloque o vaso no autoclave e submeta-o à autoclavação por 25 a 30 minutos a 121 graus Celsius, utilizando um ciclo para líquidos. Após o resfriamento do vaso do autoclave, o próximo passo é instalá-lo na base do biorreator.Em seguida, conecte o cabo do eletrodo de pH. Prenda o cabo do eletrodo de oxigênio e ligue o dispersor ao acréscimo de gás. Depois, ligue o biorreator mantendo a esterilidade.Adicione o reagente de hidróxido de sódio molar ao frasco com o tubo de imersão e instale a cabeça da bomba no eixo da base da bomba. Coloque o sensor de temperatura no poço térmico na placa da cabeça. Certifique-se de que ele atinja completamente o fundo do poço térmico.Abaixe cuidadosamente o braço de agitação até acoplar-se à hélice dos vasos. Certifique-se de que o fermentador está ligado. Verifique se há água disponível para o fermentador.Ligue o suprimento de ar no biorreator. Role até o parâmetro de temperatura e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Pressione o botão enter para iniciar o controle de temperatura.O recipiente aquecerá em 15 minutos ou menos. Regule o fluxo de gás para um volume de meio por minuto ou menos. Para esta configuração, o fluxo de gás é de três litros por minuto.Devem aparecer bolhas na parte inferior. Role até o parâmetro de agitação e ajuste para 300 rpm. Pressione enter para ligar a agitação.Uma vez que a temperatura tenha atingido 37 graus Celsius, role até o parâmetro de pH e ajuste-o para 6,8. Ligue o controle de pH pressionando o botão enter.Defina a agitação na velocidade máxima de 1000 RPM para o ensaio. Certifique-se de que a sonda de oxigênio esteja polarizada corretamente para exibir os valores adequados após duas horas. Role até o parâmetro de oxigênio.Use o botão de menu para selecionar a função de calibração e escolha a calibração de um ponto. Após 15 minutos, use os cursores para ajustar o valor para 100 e pressione enter. Isso calibrará a saturação de oxigênio.Deslize até a agitação e defina para 300 RPM. Usando o botão do menu, ligue a cascata no menu de agitação. Isso aumentará a velocidade de agitação na tentativa de fragmentar bolhas de ar e forçar mais oxigênio para a solução conforme a demanda aumenta devido ao crescimento.Role até o parâmetro de oxigênio e defina o valor para 30. Pressione o botão Enter. Inicie o pacote de software de controle no computador.Uma vez que as sondas são calibradas, a agitação é estável em 300 RPM. A temperatura está em 37 graus Celsius e o pH é próximo de 6,8. É hora de inocular utilizando álcool.Esterilize a porta que será usada para inoculação. Aspire o inóculo em uma seringa e adicione-o na porta esterilizada. Feche a porta, marque o tempo de inoculação no registro do computador.Também é importante coletar uma amostra no momento da inoculação. Após abrir o grampo e tampar o portão de colheita, pressione o êmbolo da seringa para limpar a linha. Em seguida, puxe o êmbolo da seringa para trás.Para coletar uma amostra, desparafuse o frasco e descarte a primeira amostra, pois ela permaneceu no tubo. Recoloque o frasco e use o mesmo êmbolo da seringa para puxar outra amostra. Remova o frasco e despeje o conteúdo em um vete.Para testar, empurre o ar de volta através do tubo usando a seringa e feche o grampo na tubulação da porta de amostragem. Determine a densidade celular e o pH e registre os valores. Com culturas microbianas, é útil registrar os valores a cada hora, mas o intervalo de amostragem depende da cultura.O método de colheita dependerá do objetivo para o cultivo após a conclusão do crescimento. Neste caso, colete uma amostra final do cultivo para obter os valores finais de densidade celular e possíveis valores de pH ou medida do peso úmido das células. Por fim, abra a placa superior, recolha o cultivo e descarte o conteúdo do recipiente em um tanque designado de inativação com água sanitária ou outros agentes antimicrobianos.Neste vídeo, foi demonstrada a configuração e operação de um sistema típico de biorreator de bancada. Esta figura mostra o biorreator no início de um experimento, com todas as partes identificadas e conectadas. Os dados obtidos em um exemplo representativo de operação de biorreator são apresentados nesta figura.No início de um ensaio em reator agitado, a temperatura foi ajustada em 30 graus Celsius, a velocidade do agitador em 200 RPM, o pH em 6,5 e a concentração de oxigênio em 57,2%. Os parâmetros podem variar para cada experimento, mas antes da adição das bactérias, o sistema deve estar em estado estacionário. Na próxima figura, a variação na concentração de oxigênio com a adição do cultivo bacteriano é mostrada pela linha azul.A bomba de alimentação fornece o cultivo semente bacteriano com uma OD de 0,1, causando uma queda imediata. No nível de O₂, o biorreator responde à variação do nível de O₂ com um aumento na velocidade do agitador. Esta última tela do software do biorreator mostra a variação do pH ao longo do tempo, representada pela linha azul-escura.O pH do cultivo foi monitorado continuamente e, com o tempo, diminuiu. À medida que o ácido lático era produzido e depois aumentava. Toda a corrida pode ser analisada e os parâmetros podem ser ajustados para experimentos subsequentes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar e monitorar um biorreator para a expressão de uma proteína recombinante. Sistemas de fermentação são utilizados para fornecer um ambiente de crescimento ideal para muitos tipos diferentes de cultivos em escala ampliada. A capacidade oferecida pelos fermentadores de controlar cuidadosamente parâmetros como temperatura, pH e concentrações de oxigênio dissolvido, em especial, torna-os essenciais para o crescimento eficiente e para a produção de produtos de fermentação em larga escala.Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Usando um biorreator pneumático, demonstramos a montagem, operação e desempenho deste sistema de biorreator de uso único para o crescimento de células de mamíferos.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Um novo projeto de reator, denominado biorreator de alta densidade (HDBR), é apresentado para o cultivo e estudo de comunidades microbianas de alta densidade. Aqui, o HDBR é aplicado com sucesso em uma configuração de fotobiorreator (PBR) para o estudo do metabolismo do nitrogênio por uma comunidade mista de algas de alta densidade.

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

Este artigo descreve o processo de montagem e operação de um biorreator fotossintético de bench-scale que pode ser usado, em conjunto com outros métodos, para estimar os parâmetros de crescimento cinético pertinentes. Este sistema monitora continuamente o pH, a luz e a temperatura usando sensores, uma unidade de aquisição e controle de dados e software de aquisição de dados de código aberto.

Construção e configuração de um Bioreactor Fotossintético Algal com Escala de Banco com Monitoramento de Temperatura, Luz e pH para testes de crescimento cinético

A entrada do poder em biorreatores mexidas pode ser medida através do torque que age no eixo do rotor durante a rotação. Este manuscrito descreve como um rolamento de ar pode ser usado para efetivamente reduzir as perdas de atrito observadas em selos mecânicos e melhorar a precisão das medições entrada de energia em pequenos vasos.

Entrada de poder de medições em biorreatores mexidas em escala de laboratório

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Este protocolo detalha a montagem de matrizes de mini-biorreatores a serem utilizados para cultura de fluxo contínuo de comunidades fecais complexas sob condições anaeróbicas. Também discutimos os métodos de montagem, inoculação e amostragem dos reatores para análise posterior.

Montagem de biorreatores para cultura contínua de comunidades fecais complexas

O Minibioreactor Array (MBRA) é um sistema de cultura de fluxo contínuo, personalizável e de alto rendimento que permite o cultivo de comunidades microbianas complexas, apoiando experimentos paralelos para estudar a dinâmica do microbioma, interações terapêuticas e respostas microbianas a fatores ambientais.

Protocolo atualizado para montagem e uso do arranjo de minibiorreatores (MBRA)

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

Aprenda a configurar e operar um biorreator de bancada para cultivo em grande escala de células bioengenheiradas. Este método demonstra montagem, calibração de sondas e monitoramento de parâmetros essenciais.

Funcionamento de um biorreator de bancada

Explorar mais vídeos