A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

O objetivo geral deste procedimento é montar e usar uma plataforma semi-automatizada baseada em microfluídica para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados celulares para análises moleculares. Isso é feito primeiro estabelecendo culturas de células em microescala em microcapilares revestidos de fibronectina, chamados de câmaras de perfusão celular. O segundo passo é conectar as câmaras de perfusão a um módulo digital de microfluídica ou DMF, que fornece um meio flexível pelo qual os reagentes são encaminhados de e para as culturas de células em microescala.

Em seguida, o módulo DMF fornece o estímulo de interesse para as câmaras de perfusão e as células são incubadas com o estímulo por um tempo de exposição predeterminado. Finalmente, as células são lisadas por meios químicos e os lisados são recuperados no módulo DMF para análise molecular. Os lisados recuperados são então analisados usando RTPC quantitativo para caracterizar a resposta transcricional da população celular ao estímulo.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos convencionais de cultura celular, é possível com esta técnica que você possa fazer estudos de estimulação celular usando pequenas quantidades de células e também usar pequenas quantidades de reagentes. Nossa pesquisa demonstrou que o manuseio preciso de células e reagentes da plataforma em microescala minimiza a variabilidade de experimento para experimento. A plataforma também é muito versátil.

O módulo de microfluxo digital pode rotear células e reagentes de e para as câmaras de perfusão com grande flexibilidade, de modo que os experimentos possam ser personalizados e reconfigurados de forma rápida e fácil. Para começar, prepare uma solução estéril de 50 microgramas por mililitro de fibronectina e use uma bomba de seringa multivias para aspirar 30 microlitros da solução em cada microcapilar para acelerar o revestimento das superfícies internas do microcapilar. Incube a 37 graus Celsius por duas horas, depois retire e descarte a solução de fibronectina e deixe os microcapilares secarem em temperatura ambiente por seis horas.

Em seguida, conecte os microcapilares revestidos com fibra ou câmaras de perfusão à tubulação de policarbonato e a tubulação à bomba de seringa usando conexões capite. A configuração mostrada aqui usa uma bomba de seringa com porta de auxílio que suporta seis câmaras de perfusão. Usando fita adesiva, prenda o corpo de cada câmara de perfusão a um bloco de calor e ajuste a temperatura dos blocos de calor para 37 graus Celsius.

Em seguida, mergulhar as extremidades abertas das câmaras de perfusão num reservatório contendo células, suspensas em crescimento fresco, meio uniformemente disperso a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro. Instrua a bomba de seringa a puxar 10 microlitros da suspensão celular para cada câmara de perfusão. Em seguida, remova as extremidades abertas das câmaras de perfusão da suspensão da célula e instrua a bomba da seringa a puxar ar suficiente para mover os plugues de líquido para as seções presas ao bloco de calor.

Permita que as células adiram às superfícies internas revestidas de fibronectina das câmaras de perfusão, incubando-as a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Enquanto isso, transfira as extremidades abertas das câmaras de perfusão para um novo reservatório contendo meio de crescimento fresco. Após o período de adesão, instrua a bomba de seringa a enviar os tampões de líquido para o lixo e, em seguida, puxe 10 microlitros de meio fresco para cada câmara de profusão, seguido de ar suficiente para posicionar o meio fresco sobre as células aderidas.

Continue a incubar as células a 37 graus Celsius, trocando o meio a cada duas horas até que as culturas estejam suficientemente equilibradas e expandidas. Padrão. A placa inferior do módulo DMF com 46 eletrodos de óxido de índio e estanho. Usando técnicas fotolitográficas padrão, reveste a placa inferior do módulo DMF com cinco mícrons de Lene C por meio de deposição de vapor químico e, em seguida, gire a camada com 50 nanômetros de Teflon af.

Em seguida, spin coat e substrato de vidro de óxido de índio e estanho não padronizado com 50 nanômetros de Teflon AF para ser usado como placa superior. Use estruturas de compressão de metal para fixar as placas em um molde de polímero com reentrâncias que mantêm um espaçamento de 400 mícrons entre as placas. Esse espaçamento combinado com o tamanho do eletrodo de atuação de 2,5 milímetros quadrados define o volume da gota como 2,5 microlitros por eletrodo.

Em seguida, insira microcapilares de transferência revestidos com Teflon no espaço entre as placas DMF. Posicionando cada um de forma que se estenda até a borda de seu eletrodo de atuação cognato até a extremidade oposta de cada transferência. Micro capilar afixar um encaixe capite.

Em seguida, engate os conectores elétricos para fornecer tensão aos eletrodos de óxido de índio 10. As sequências de ativação do eletrodo são automatizadas por meio do uso de uma interface eletrônica controlada por computador executando scripts predeterminados. Em seguida, encha os módulos DMF a bordo dos reservatórios com os reagentes apropriados para estimulação, lavagem e lise celular.

Em alguns casos, é melhor carregar o próprio estímulo em uma etapa posterior, pouco antes de seu uso, extraindo dos reservatórios carregados a bordo, dispensar microgotículas no módulo DMF. Teste, acionamento das microgotículas, incluindo seu transporte entre o módulo DMF e os microcapilares de transferência. Blais. Primeiro, prepare o estímulo em meio fresco com 0,1% de F1 27 onic a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro.

Em seguida, carregue de 80 a 100 microlitros do estímulo em seu reservatório designado a bordo. Em seguida, remova as extremidades abertas das câmaras de perfusão do reservatório médio e insira-as nas conexões do capite afixadas nas extremidades dos microcapilares de transferência e, em seguida, instrua a bomba de seringa a enviar os tampões de líquido dentro das câmaras de perfusão para o recipiente de resíduos. Em seguida, instrua o módulo DMF a gerar gotículas de estímulo de 10 microlitros e entregá-las às câmaras de perfusão por meio dos microcapilares de transferência.

Incube as células com o estímulo a 37 graus Celsius por uma a quatro horas, se necessário. Troque por novos estímulos em intervalos regulares após o período de estimulação. Instrua a bomba de seringa a enviar o estímulo para o recipiente de resíduos e instrua o módulo DMF a fornecer uma gota de 10 microlitros de tampão de lavagem para cada câmara de perfusão.

Incube as células com o tampão de lavagem por cinco minutos. Em seguida, troque o tampão de lavagem por 10 microlitros de solução de lise e incube por mais cinco minutos. Em seguida, instrua a bomba de seringa a enviar cada lisado de célula para o módulo DMF.

Remova a placa superior do módulo DMF tomando cuidado para não inclinar a placa lateralmente, pois isso pode resultar em contaminação cruzada entre as gotículas. Finalmente, colete os lisados do módulo DMF aberto usando um pipeta man para análise fora da plataforma, como expressão gênica, perfil via RTPC quantitativo para preparar a plataforma para o próximo experimento. Primeiro, mergulhe os microcapilares de transferência, conexões CAPITE e placas do módulo DMF em alvejante a 10% por 10 minutos em temperatura ambiente, as placas do módulo DMF são enxaguadas com isopropanol seguido de água deionizada e secas com gás nitrogênio e, em seguida, assando a 160 graus Celsius por 10 minutos.

Os métodos de semeadura descritos neste protocolo resultaram na aderência de aproximadamente 500 macrófagos miren por câmara de perfusão. Depois de incubar as células com meio de crescimento a 37 graus Celsius por 16 horas, o tamanho da população dobrou para aproximadamente 1000 células por câmara de perfusão. Aqui são mostrados os resultados da análise quantitativa R-T-P-C-R de quatro genes conhecidos por desempenharem papéis importantes nas respostas imunes inatas às bactérias.

Os macrófagos foram cultivados em culturas convencionais ou em microescala e estimulados com biopartículas de e coli por uma ou quatro horas. As barras azuis indicam o aumento médio da expressão gênica após a estimulação de células cultivadas convencionalmente, enquanto as barras vermelhas indicam expressão induzida em células cultivadas e estimuladas. Em culturas em microescala, as barras de erro indicam desvios padrão entre réplicas biológicas de três experimentos independentes.

Os resultados do perfil de expressão gênica foram muito semelhantes, embora as culturas convencionais usassem placas de 96 poços com aproximadamente 50.000 células por poço, enquanto as culturas em microescala usavam microcapilares com aproximadamente 1000 células por experimento de câmara de perfusão para experimentar a variabilidade era pelo menos comparável e muitas vezes reduzida em culturas em microescala, conforme indicado pelas barras de erro mais curtas trabalhando em microescala. Reduziu o consumo de células em cinco vezes e reduziu o consumo de reagentes em três a 50 vezes. Em relação aos experimentos convencionais.

O método pode ser usado para cultura, praticamente qualquer tipo de célula de aderência, em alguns casos usando um componente de matriz extracelular diferente ou crescimento. Os tipos de células de não adesão média podem ser desafiadores, mas as estratégias de amarração celular têm se mostrado bem-sucedidas em contextos semelhantes. A abordagem descrita aqui dá suporte à cultura em microescala por até 24 horas.

A plataforma inclui todas as funções para fazer uma cultura de longo prazo também, mas um protocolo de passagem celular precisa ser desenvolvido. Módulos adicionais podem ser integrados ao cubo microfluídico digital através das interconexões microcapilares. Dessa forma, o DMF serve como um hub central para conectar os módulos periféricos para realizar fluxos de trabalho complexos.

Nós nos concentramos principalmente na caracterização das respostas transcricionais do hospedeiro a agentes infecciosos, mas a plataforma foi projetada para ser extremamente versátil e, portanto, deve suportar uma ampla variedade de aplicações de pesquisa.