A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

O objetivo geral deste procedimento é montar e utilizar uma plataforma baseada em microfluídica semi-automatizada para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados celulares para análises moleculares. Isso é realizado primeiramente estabelecendo culturas celulares em microescala em microcapilares revestidos com fibronectina, denominados câmaras de perfusão celular. O segundo passo consiste em conectar as câmaras de perfusão a um módulo de microfluídica digital ou DMF, que fornece um meio flexível pelo qual reagentes são direcionados para as culturas celulares em microescala e delas retirados.

Em seguida, o módulo DMF entrega o estímulo de interesse às câmaras de perfusão e as células são incubadas com o estímulo por um tempo predeterminado de exposição. Por fim, as células são lisadas por meios químicos e os lisados são recuperados no módulo DMF para análise molecular. Os lisados recuperados são então analisados por meio de R-T-P-C-R quantitativa para caracterizar a resposta transcricional da população celular ao estímulo.

A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos convencionais de cultivo celular é que, com ela, é possível realizar estudos de estimulação celular utilizando pequenas quantidades de células e também pequenas quantidades de reagentes. Nossa pesquisa demonstrou que o manuseio preciso de células e reagentes pela plataforma em escala microscópica minimiza a variabilidade entre experimentos. A plataforma também é muito versátil.

O módulo microfluídico digital pode direcionar células e reagentes para dentro e para fora das câmaras de perfusão com grande flexibilidade, permitindo que os experimentos sejam personalizados e reconfigurados rapidamente e com facilidade. Para começar, prepare uma solução estéril de 50 microgramas por mililitro de fibronectina e use uma bomba de seringa com múltiplas portas para aspirar 30 microlitros da solução em cada microcapilar, acelerando o revestimento das superfícies internas do microcapilar. Incube a 37 graus Celsius por duas horas, depois retire e descarte a solução de fibronectina e deixe os microcapilares secarem à temperatura ambiente por seis horas.

Em seguida, conecte as microcapilares revestidas com ninho de fibra ou câmaras de perfusão a tubos de policarbonato e os tubos à bomba de seringa utilizando conexões capite. A montagem mostrada aqui utiliza uma bomba de seringa com porta auxiliar que suporta seis câmaras de perfusão. Usando fita adesiva, fixe o corpo de cada câmara de perfusão a um bloco aquecedor e ajuste a temperatura do bloco aquecedor para 37 graus Celsius.

Em seguida, imergir as extremidades abertas das câmaras de perfusão em um reservatório contendo células, suspensas em meio de crescimento fresco, uniformemente dispersas numa concentração de 1 milhão de células por mililitro. Instruir a bomba de seringa a puxar 10 microlitros da suspensão celular para dentro de cada câmara de perfusão. Em seguida, remover as extremidades abertas das câmaras de perfusão da suspensão celular e instruir a bomba de seringa a puxar ar suficiente para mover as tampas líquidas para as seções fixadas ao bloco de aquecimento.

Deixe as células aderirem às superfícies internas revestidas com fibronectina das câmaras de perfusão, incubando-as a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Enquanto isso, transfira as extremidades abertas das câmaras de perfusão para um novo reservatório contendo meio de crescimento fresco. Após o período de adesão, instrua a bomba de seringa a enviar os tampões líquidos para o descarte e, em seguida, puxar 10 microlitros de meio fresco para cada câmara de perfusão, seguido por quantidade suficiente de ar para posicionar o meio fresco sobre as células aderidas.

Continue a incubação das células a 37 graus Celsius, trocando o meio a cada duas horas até que os cultivos estejam suficientemente equilibrados e expandidos. Padrão. A placa inferior do módulo DMF com 46 eletrodos de óxido de estanho e índio. Utilizando técnicas fotolitográficas padrão, recubra a placa inferior do módulo DMF com cinco mícrons de Lene C por meio de deposição química de vapor e, em seguida, aplique um recobrimento por centrifugação com 50 nanômetros de Teflon af.

Em seguida, faça um revestimento por centrifugação com uma camada não padronizada de óxido de índio e estanho em um substrato de vidro com 50 nanômetros de Teflon AF para ser usado como placa superior. Utilize estruturas metálicas de compressão para fixar as placas em um molde polimérico com reentrâncias que mantenham um espaçamento de 400 mícrons entre as placas. Esse espaçamento, combinado ao tamanho do eletrodo de atuação de 2,5 milímetros quadrados, define o volume da gota como 2,5 microlitros por eletrodo.

Em seguida, insira microcapilares de transferência revestidos com teflon no espaço entre as placas de DMF. Posicione cada um de modo que se estenda até a borda do respectivo eletrodo de atuação até a extremidade oposta de cada transferência. Fixe um conector na extremidade do microcapilar.

Em seguida, conecte os conectores elétricos para fornecer tensão aos eletrodos de óxido de índio 10. As sequências de ativação dos eletrodos são automatizadas por meio de uma interface eletrônica controlada por computador que executa scripts predeterminados. Depois, preencha os reservatórios a bordo dos módulos de DMF com os reagentes apropriados para estimulação celular, lavagem e lise.

Em alguns casos, é melhor carregar o próprio estímulo em uma etapa posterior, logo antes de seu uso, retirando dos reservatórios embarcados carregados, e dispensar microgotas no módulo DMF. Teste, atuação das microgotas, incluindo seu transporte entre o módulo DMF e as microcapilares de transferência. Blais. Primeiro, prepare o estímulo em meio fresco com 0,1% F127 a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro.

Em seguida, carregue de 80 a 100 microlitros do estímulo no reservatório embutido designado. Depois, remova as extremidades abertas das câmaras de perfusão do reservatório de meio e insira-as nos conectores capilares fixados nas extremidades dos microcapilares de transferência; então, instrua a bomba de seringa a enviar os tampões líquidos dentro das câmaras de perfusão para o recipiente de resíduos. Em seguida, instrua o módulo DMF a gerar gotas de 10 microlitros do estímulo e a entregá-las às câmaras de perfusão por meio dos microcapilares de transferência.

Incube as células com o estímulo a 37 graus Celsius por uma a quatro horas, se necessário. Substitua pelo estímulo fresco em intervalos regulares após o período de estimulação. Instrua a bomba de seringa a enviar o estímulo para o recipiente de resíduos e instrua o módulo DMF a entregar uma gota de 10 microlitros de tampão de lavagem para cada câmara de perfusão.

Incube as células com o tampão de lavagem por cinco minutos. Em seguida, substitua o tampão de lavagem por 10 microlitros de solução de lise e incube por mais cinco minutos. A seguir, instrua a bomba de seringa a enviar cada lisado celular ao módulo DMF.

Remova a placa superior do módulo DMF tomando cuidado para não inclinar a placa lateralmente, pois isso pode resultar em contaminação cruzada entre as gotas. Por fim, colete os lisados do módulo DMF aberto usando uma pipeta manual para análise fora da plataforma, como expressão gênica, perfilagem por R-T-P-C-R quantitativo para preparar a plataforma para o próximo experimento. Primeiro, imerja as microcapilares de transferência, os conectores CAPITE e as placas do módulo DMF em água sanitária a 10% por 10 minutos à temperatura ambiente, as placas do módulo DMF são enxaguadas com isopropanol, seguido por água desionizada e secas com gás nitrogênio, e depois submetidas a estufa a 160 graus Celsius por 10 minutos.

Os métodos de semeadura descritos neste protocolo resultaram na adesão de aproximadamente 500 macrófagos miren por câmara de perfusão. Após incubação das células com meio de crescimento a 37 graus Celsius por 16 horas, o tamanho da população dobrou, atingindo aproximadamente 1000 células por câmara de perfusão. São apresentados aqui os resultados da análise quantitativa por R-T-P-C-R de quatro genes conhecidos por desempenharem papéis importantes nas respostas imunes inatas a bactérias.

Os macrófagos foram cultivados em culturas convencionais ou em escala microscópica e estimulados com partículas bio de e coli por uma ou quatro horas. As barras azuis indicam o aumento médio na expressão gênica após a estimulação de células cultivadas convencionalmente, enquanto as barras vermelhas indicam a expressão induzida em células cultivadas e estimuladas. Em culturas em escala microscópica, as barras de erro indicam os desvios-padrão entre réplicas biológicas de três experimentos independentes.

Os resultados do perfil de expressão gênica foram muito semelhantes, embora os cultivos convencionais tenham utilizado placas de 96 poços com aproximadamente 50.000 células por poço, enquanto os cultivos em microescala utilizaram microcapilares com cerca de 1.000 células por câmara de perfusão. A variabilidade entre experimentos foi pelo menos comparável e, muitas vezes, reduzida nos cultivos em microescala, conforme indicado pelas barras de erro menores ao se trabalhar em microescala. Redução no consumo de células em cinco vezes e redução no consumo de reagentes de três a 50 vezes em relação aos experimentos convencionais.

O método pode ser utilizado para cultivar praticamente qualquer tipo de célula aderente, em alguns casos usando um componente diferente da matriz extracelular ou meio de crescimento. Os tipos de células não aderentes podem ser desafiadores, mas estratégias de fixação celular mostraram-se bem-sucedidas em contextos semelhantes. A abordagem descrita aqui suporta cultivo em microescala por até 24 horas.

A plataforma inclui todas as funções necessárias para realizar um cultivo de longo prazo também, mas é necessário desenvolver um protocolo de repicagem de células. Módulos adicionais podem ser integrados ao cubo microfluídico digital por meio dos interconectores microcapilares. Dessa forma, o DMF atua como um hub central para conectar os módulos periféricos e executar fluxos de trabalho complexos.

Nos concentramos principalmente em caracterizar as respostas transcritômicas do hospedeiro a agentes infecciosos, mas a plataforma foi projetada para ser extremamente versátil e, portanto, deve suportar uma grande variedade de aplicações de pesquisa.