Manipulação genética em

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma substituição gênica eficiente e confiável utilizando cepas tipo um e tipo dois delta dois 80 de Toxoplasmic ndii. Isso é alcançado primeiramente pela construção de uma molécula de DNA direcionadora que funde o marcador seletivo HX GPRT em orientação direta entre regiões distintas de sequências de DNA-flanco cinco linha e três linha para direcionamento gênico. O segundo passo do procedimento consiste em transfectar a molécula de DNA direcionadora em uma cepa de toxoplasma DYI tipo um ou tipo dois.

O terceiro passo é selecionar pacientemente eventos de recombinação homóloga por dupla troca e isolar clones individuais. O passo final é validar a presença do evento de direcionamento gênico nos clones mutantes isolados. Em última análise, os resultados deste procedimento podem revelar a função de genes de parasitas mediante a análise de interrupções gênicas direcionadas, substituições gênicas e genes marcadores por meio de diversas aplicações posteriores.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes que utilizam cepas selvagens deste parasita é que os backgrounds parasitários tipo um e tipo dois delta dois 80 agora permitem uma seleção extremamente confiável de eventos de recombinação homóloga por dupla troca cruzada direcionada, produzindo cepas geneticamente bem definidas com precisão. Esta técnica acelerará significativamente a descoberta de novos alvos para terapias medicamentosas com antitoxinas plasmáticas e o desenvolvimento de cepas vacinais atenuadas seguras e eficazes, especialmente quando combinada com os recursos genômicos bem estruturados disponíveis on-line em @toxodb.org. Geralmente, indivíduos novos nesta metodologia podem ter dificuldades em projetar moléculas de DNA direcionadas ou realizar manipulações genéticas com Toxoplasma gondii.

No entanto, a prática clínica e o design de moléculas de direcionamento confiáveis garantirão o sucesso. Inicie o protocolo amplificando por PCR as extremidades genômicas alvo nos extremos cinco primos e três primos do gene de interesse a partir de DNA genômico. Em seguida, amplifique por PCR o marcador selecionável HX GPRT com suas extremidades DHFR nos extremos cinco primos e três primos a partir do cassete do gene mini HX GPRT CD NA.

Utilize a recombinação em levedura ou um método semelhante para fundir as moléculas de NA 3D em sua orientação correta de cinco linha para três linha com o plasmídeo PRS quatro 16, gerando assim o plasmídeo p delta GOI que direcionará a deleção no gene de interesse. Em seguida, prepare uma amostra de 100 microlitros contendo de 15 a 30 microgramas do plasmídeo direcionador linearizado para transfeção em T gia 68 a 72 horas após inocular um frasco de 25 centímetros quadrados contendo células HFF confluentes. Verifique a presença de parasitas recém-lisados confirmando visualmente que de 90 a 95% das células HFF foram lisadas; parasitas viáveis são essenciais para o direcionamento gênico.

Agite os parasitas viáveis em solução agitando vigorosamente o frasco fechado, sem salpicar o líquido no interior da tampa ou no gargalo do frasco. Recolha os parasitas do frasco e prepare-os para transfeção conforme descrito no protocolo textual. Eletropore o plasmídeo direcionador na linhagem de toxoplasma delta CO 80.

Transfira a mistura eletroporada para um frasco de 150 centímetros contendo células HFF confluentes e 30 mililitros de meio de infecção. Incube a cultura infectada durante a noite a 37 graus Celsius, cerca de 20 horas após a transfeção. Substitua o meio por meio de seleção MPA mais X.

Agora, deixe os parasitas incubarem a 37 graus Celsius por cerca de oito dias, sem perturbação. Quando as placas forem visíveis, agite o frasco para desprender os parasitas extracelulares da monocamada, gerando uma solução de parasitas. Transfira cerca de meio mililitro da solução de parasitas para um novo frasco de 25 centímetros com células HFF confluente contendo cinco mililitros de meio de seleção MPA mais X.

Designe esta cultura como PAs um A cerca de três dias depois. Repita a transferência de meio mililitro da solução de parasitas do frasco original para outro frasco contendo células HFF com o mesmo meio de seleção. Designe esta cultura como PAs um B ao longo dos próximos cinco dias.

O passe A e o passe B apresentam um pfu. Selecione o passe A ou o passe B para subclonagem com base em um número adequado de mais de 25 zonas de infecção. Sempre que os parasitas lisarem as células HFF, transfira a cultura para um novo frasco de 25 centímetros contendo células HFF confluente com meio de seleção. Três semanas após a transfeção, subclone os parasitas recém-infectados diluindo-os para a concentração apropriada no meio MPA mais X e distribuindo uniformemente a solução de parasitas em uma placa de 96 poços contendo células HFF confluente.

Prepare uma placa com uma concentração de um parasita por poço e prepare uma segunda placa com uma concentração de dois parasitas por poço. Incube ambas as placas a 37 graus Celsius após a data original da transfeção. Não subclone os parasitas antes do dia 20 para parasitas do tipo um ou antes do dia 25 para parasitas do tipo dois.

Continue repassando o frasco de 25 centímetros segundo um cronograma semanal, conforme descrito no texto online, até que a linhagem com deleção gênica tenha sido validada. Após cerca de uma semana, analise as placas de 96 poços com aumento de 40 a 60 vezes. Selecione apenas os poços que contenham uma única UFP, identificada como uma única zona de infecção, utilizando uma pipeta ajustada em 50 microlitros.

Misture o conteúdo desses poços direcionando o fluxo de fluido sobre a UPF para dispersar os parasitas ao redor do poço. Quatro a cinco dias após a mistura dos poços selecionados, escolha uma dúzia de clones com células lisadas. Transfira 12 clones da placa de 96 poços para 12 poços de uma placa de 24 poços. Faça isso raspando com a ponteira de uma pipeta ao longo do fundo do poço e aspirando seis microlitros.

Transfira a solução para um poço de uma placa de 24 poços com células HFF confluentes em um mililitro de MPA mais seleção X. Incube a placa de 24 poços a 37 graus Celsius e monitore a lise das células HFF. Passe os parasitas de um poço lisado da placa de 24 poços em um intervalo semanal.

Utilize a técnica de riscar e desenhar para transferir dois microlitros da solução de parasitas para uma nova placa com MPA e seleção X. Após a passagem, colete os parasitas da placa original de 24 poços e transfira-os para tubos pequenos para a coleta de DNA.

Para finalizar, utilize PCR para testar a deleção do gene de interesse a fim de verificar a integração das regiões alvo flanqueadoras cinco prime e três prime. E para verificar a presença do marcador seletivo HX GPRT. Este protocolo é para a remoção do marcador HX GPRT da linhagem delta Q 80 manipulada e está descrito no texto online.

O P delta GOYC visa à remoção da HX GPRT do parasita por seleção negativa utilizando meio TX seis. Em seguida, a PCR é usada para confirmar a perda da HX GPRT, demonstrada por uma banda de 1,2 par de quilobases onde a HX GPRT não foi removida do locus. Há uma banda de 3,4 pares de quilobases.

A parte final deste protocolo, a marcação na extremidade C de proteínas, também é descrita em detalhes no texto online. Após seguir o protocolo descrito para realizar uma deleção gênica direcionada, a PCR foi utilizada para validar a deleção de um knockout do tipo um R 18, um alvo geralmente difícil de ser atingido. A PCR um mostra a ausência do produto da PCR do gene R 18.

A PCR dois mostra a presença do flanco genômico de direcionamento no extremo três primos; a PCR três e a PCR quatro mostram a presença do marcador selecionável corretamente integrado entre os flancos genômicos de direcionamento no extremo cinco primos e no extremo três primos, o que define a deleção R 18. Para reutilizar o marcador selecionável e realizar deleções subsequentes em uma linhagem, o HX GPRT original deve primeiro ser removido do locus. Após seguir o protocolo descrito.

A HX GPRT foi removida do locus GRA dois deletado na linhagem delta dois 80 delta GRA dois HX.G-P-R-T-P-C-R foi utilizada para confirmar a perda da HX GPRT, demonstrada por uma banda de 1,2 KILOBASE. Quando a H-X-G-P-R-T não foi removida, houve uma banda de 3,4 kilobase após a etapa inicial de direcionamento gênico. Podem-se aplicar métodos adicionais de direcionamento gênico para construir múltiplos knockouts na mesma linhagem tipo um ou tipo dois, ou para marcar ou complementar uma linhagem mutante a fim de responder perguntas adicionais, como, por exemplo, onde esta proteína se localiza na célula?

Ou qual é o domínio ou atividade-chave dessa proteína ou via que explica sua função biológica? Esta técnica abre caminho para que pesquisadores da área aumentem a exploração da função gênica de parasitas no complexo AP modelo e no parasita Toxoplasma. Gandhi eye.

Não se esqueça de que trabalhar com toxoplasma pode ser perigoso e precauções, como seguir todas as diretrizes BSL dois, devem ser mantidas durante todo o procedimento.