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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Transformação Bacteriana: Eletroporação

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Bacterial Transformation: Electroporation

2.6: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

2.8: The ELISA Method

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12:19 min

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April 30, 2023

Overview

O termo “transformação” refere-se à ingestão celular de DNA estranho. Na natureza, a transformação pode ocorrer em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, no entanto, a transformação é artificialmente induzida através da criação de poros nas paredes celulares bacterianas. Células bacterianas capazes de tirar DNA do ambiente são chamadas de células competentes. Células eletrocompetntes podem ser produzidas em laboratório e a transformação dessas células pode ser alcançada através da aplicação de um campo elétrico que cria poros na parede celular através do qual o DNA pode passar.

O vídeo explica o equipamento utilizado na eletroporação, como um eletroporador e cuvette eletroporação. O vídeo também passa por um procedimento passo a passo sobre como criar células eletrocompetntes e células eletroporas de interesse. Também são mencionadas a previsão do sucesso de uma transformação de um experimento, observando a constante do tempo, bem como a importância de retirar o sal das soluções ao eletroporar.

Procedure

A transformação bacteriana é um processo natural, no qual as bactérias ingerem DNA estranho e depois amplificam ou clonam. Em laboratório, esse processo pode ser induzido artificialmente, usando pulsos de campo elétricos de alta tensão para criar poros na membrana celular bacteriana, através da qual o DNA plasmídeo pode passar. A eletroporação refere-se a este método e o vídeo a seguir demonstrará seus princípios, procedimento passo a passo e aplicações.

Antes de falarmos sobre eletroporação de bactérias, é importante entender o tipo de DNA usado nesses experimentos: o plasmídeo. Um plasmídeo é um pequeno, circular, extracromosomal pedaço de DNA que age como um vetor, um portador de sua sequência de DNA específica.

Se essa sequência é um gene para uma proteína de fluorescência em águas-vivas ou uma enzima de plantas, ela é inserida no plasmídeo através de uma região chamada local de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas que são cortadas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. As mesmas enzimas de restrição podem ser usadas para cortar sua sequência de interesse para que as extremidades sejam complementares às extremidades recém-cortadas do plasmídeo.

Os plasmídeos também contêm uma origem de replicação, ORI abreviada, que indica o ponto em que será replicado. Quando se trata de transformação, o gene de resistência a antibióticos é de vital importância. Como seu nome implica, este gene permite que as bactérias produzam uma enzima que neutraliza antibióticos permitindo que eles sobrevivam em antibióticos que contêm mídia.

A eletroporação faz uso de um dispositivo especializado chamado eletroporador. Normalmente, as células são colocadas em uma cuvette de eletroporação, que tem eletrodos de cada lado que fazem contato elétrico com a máquina uma vez inseridos.

Células bacterianas misturadas com DNA são carregadas na cuvette de eletroporação e um campo elétrico na ordem de 1000 a 10.000 volts por centímetro é aplicado por alguns milissegundos. Isso faz com que a tensão através da membrana atinja 0,5-1 volts, o que acredita-se que leve a um rearranjo da bicamada fospolipid que compreende a membrana celular de tal forma que os poros se formarão. Neste estado, o DNA plasmídeo passará pela membrana e quando o pulsamento estiver completo, a bicamada se reparará.

Tendo tomado o plasmídeo, as bactérias podem então crescer em placas de ágar contendo antibiótico.

Agora que aprendemos sobre plasmídeos e o mecanismo de eletroporação. Vamos dar uma olhada em como o procedimento é conduzido.

Células que podem facilmente tomar DNA são referidas como células competentes. O tipo mais comum de bactérias competentes que é transformada em pesquisas de biologia molecular é o E. coli, que são as bactérias procarióticas que fazem sua casa em seu intestino inferior. E. coli que são preparados para eletroporação são referidos como células eletrocompetntes.

Sempre que manusear bactérias, certifique-se de que a área de trabalho esteja o mais limpa possível.

O manuseio de bactérias também requer que uma técnica asséptica pratique. Normalmente, isso envolve o uso de um queimador Bunsen para esterilizar instrumentos e criar uma corrente de convecção – que mantém os contaminantes aéreos longe do espaço de trabalho.

Imediatamente antes da eletroporação, mídia pré-quente à temperatura ambiente, leve placas de ágar contendo antibiótico a 37°C, e cuvetas de eletroporação fria no gelo.

Em seguida, descongelar células eletrocompetente lavadas no gelo.

Adicione 1-5uL de plasmídeo frio de 1ng/μL que seja livre de sal para células bacterianas, misture suavemente e adicione a mistura ao cuvette frio. Certifique-se de que não há bolhas.

Ajuste a tensão e a força de campo do eletroporador nas configurações corretas para suas células. Aqui você vê um eletroporador sendo definido para 1700 volts e produzindo uma força de campo de 17kV/cm.

Limpe a parte externa da cuvette seca e coloque-a no eletroporador. Pulso as células até ouvir um bip.

Pulsação mal sucedida causa uma descarga elétrica, que é observável como uma faísca visível e pop audível. Esta descarga, chamada de arco, pode ser o resultado de ter muito sal em suas células competentes ou DNA.

O sucesso de sua transformação pode ser previsto observando a constante de tempo, que é a duração que leva para a tensão se deteriorar depois de aplicar o pulso. Quando o sal está presente e a solução de eletroporação é muito condutora, a decadência acontece rapidamente, causando a descarga, e assim matando muitas de suas células. Para bactérias, as constantes de tempo variam de 5 a 10 milissegundos.

Imediatamente após pulsar, remova a cuvette e adicione 1 ml de mídia diretamente às células. Esta célula contendo mídia é colocada em um tubo e incubada a 37°C por 1 hora, com agitação, para que as células se recuperem.

Em seguida, usando técnica asséptica adicione 20-200uL da célula a um antibiótico contendo placa de ágar. Inverta as placas para que o ágar esteja em cima e assim a condensação não caia em suas células e incubar durante a noite a 37°C.

Bactérias transformadas com o plasmídeo devem formar colônias. Conte as colônias e calcule a eficiência da transformação, que é o número de transformadores bem sucedidos divididos pela quantidade total de DNA banhado.

O ágar e a mídia, que fornecem a nutrição para suas bactérias, devem ser pré-preparados e esterilizados via autoclaving. Deixe a mídia líquida esfriar até a temperatura ambiente antes de usar e deixe o ágar esfriar a 50-55°C – a temperatura em que o antibiótico pode ser adicionado e as placas derramadas. Em seguida, deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente para solidificar.

Uma vez que as bactérias usadas na transformação são armazenadas no congelador, elas devem primeiro ser descongeladas no gelo, espalhadas em uma placa de ágar sem antibióticos e depois cultivadas durante a noite a 37°C.

Usando técnica asséptica selecione uma colônia bacteriana da placa de ágar e cresça-a em uma cultura maior de 500mL durante a noite a 37°C em uma incubadora de agitação.

Enquanto as células estão crescendo, prepare-se cerca de um litro de água deionizada e compor um glicerol e água de 10%, solução de volume para volume. Autoclave as soluções e deixe esfriar a 4°C.

As medidas de absorção são usadas para determinar se as bactérias estão ou não em sua fase de crescimento de tronco médio, o que significa que elas prontamente absorverão o DNA. Uma vez que as células tenham chegado a esta fase, coloque-as no gelo e mantenha-as lá durante todo o procedimento.

Em seguida, lave as células separando-as em dois tubos de centrífugas grandes e gire a 4°C, despeje sobrenaspeuta e resuspenda em água estéril estéril de 100mL fria. Repita este passo pelo menos mais uma vez. O objetivo desta etapa em particular é remover o sal, que afetará fortemente a técnica de eletroporação.

Realize duas lavagens adicionais em 50 ml de 10% de glicerol na água e, finalmente, resuspenja as bactérias nesta mesma solução.

Adicione 50μL de células em múltiplos tubos Eppendorf. Estas células estão agora prontas para uso em eletroporação e devem ser mantidas a 4°C. Ou podem ser congelados e armazenados a -80°C.

Como você está prestes a ver, a eletroporação tem muitas aplicações.

Uma alternativa à eletroporação é a transformação do choque térmico, que conta com a exposição das bactérias tanto ao cloreto de cálcio quanto ao calor, a fim de introduzir DNA em suas células.

Em geral, o choque térmico é mais suave em suas bactérias do que eletroporação e não requer pouco sal. Reações de ligadura, aquelas que envolvem inserir seu gene alvo no plasmídeo, podem ser usadas diretamente na transformação do choque térmico. A transformação do choque térmico é mais barata que a eletroporação e não depende de equipamentos caros ou cuvetas. Por outro lado, o choque térmico leva a menores eficiências de transformação do que a eletroporação e leva mais tempo. Também se limita a protoplastos bacterianos, leveduras e plantas, enquanto a eletroporação pode ser aplicada a células de mamíferos.

Aqui você vê fibroblastos embrionários de rato sendo carregados em uma cuvette de eletroporação. Uma vez que a eletroporação esteja completa, a eficiência de transformação pode ser determinada observando até que ponto as células produzem uma proteína de fluorescência verde codificada pelo plasmídeo. Transfecção é o termo dado à transformação de células mamíferas, que normalmente requer forças de campo mais baixas do que células bacterianas e maiores constantes de tempo.

A eletroporação também pode ser realizada em animais inteiros como o embrião de frango em desenvolvimento que você viu aqui. Dna plasmídeo é injetado no cérebro do filhote e, em seguida, uma sonda de eletroporação é usada para aplicar um campo elétrico ao tecido cerebral. Após um dia ou dois, proteínas fluorescentes verdes e vermelhas – codificadas pelo plasmídeo – são feitas por neurônios, e os cientistas podem observar mudanças estruturais no cérebro de filhotes em desenvolvimento.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à transformação bacteriana por eletroporação. Este vídeo introduziu o plasmídeo como o tipo mais comumente transformado de DNA, discutiu o mecanismo biofísico pensado para subjacente à eletroporação, mostrou um procedimento generalizado para a condução da eletroporação, e descreveu como a eletroporação pode ser usada no sistema mamífero. Obrigado por assistir!

Transcript

Bacterial transformation is a naturally occurring process, in which bacteria ingest foreign DNA and then amplify or clone it. In the lab, this process can be induced artificially, by using high voltage electric field pulses to create pores in the bacterial cell membrane, through which plasmid DNA can pass. Electroporation refers to this method and the following video will demonstrate its principles, step-by-step procedure, and applications.

Before we talk about electroporation of bacteria, it’s important to understand the type of DNA used in these experiments: the plasmid. A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector, a carrier of your specific DNA sequence.

Whether this sequence is a gene for a fluorescence protein in jellyfish or an enzyme from plants, it is inserted into the plasmid via a region called the multiple cloning site or MCS. This region contains specific sequences that are cleaved by restriction endonucleases or restriction enzymes. The same restriction enzymes can be used to cut out your sequence of interest so that the ends are complementary to the newly cut ends of the plasmid.

Plasmids also contain an origin of replication, abbreviated ORI, that indicates the point at which it will be replicated. When it comes to transformation the antibiotic resistance gene is of vital importance. As its name implies this gene allows the bacteria to produce an enzyme that neutralizes antibiotic allowing them to survive in antibiotic containing media.

Electroporation makes use of a specialized device called an electroporator. Typically cells are placed into an electroporation cuvette, which has electrodes on each side that make electrical contact with the machine once inserted.

Bacterial cells mixed with DNA are loaded into the electroporation cuvette and an electric field on the order a 1000 to 10,000 volts per centimeter is applied for a few milliseconds. This causes the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts, which is believed to lead to a rearrangement of the phospolipid bilayer that comprises the cell membrane such that pores will form. In this state plasmid DNA will pass through the membrane and when pulsing is complete the bilayer will repair itself.

Having taken up the plasmid, bacteria can then grow on agar plates containing antibiotic.

Now that we’ve learned about plasmids and the electroporation mechanism. Let’s have a look at how the procedure is conducted.

Cells that can readily take up DNA are referred to as competent cells. The most common type of competent bacteria that is transformed in molecular biology research is E. coli, which are the prokaryotic bacteria that make their home in your lower intestine. E. coli that are prepared for electroporation are referred to as electrocompetent cells.

Whenever handling bacteria, make sure the work area is as clean as possible.

Handling bacteria also requires that one practice aseptic technique. Typically this involves the use of a Bunsen burner to sterilize instruments and to create a convection current – which keeps airborne contaminants away from the workspace.

Immediately before electroporation, pre-warm media to room temperature, bring agar plates containing antibiotic to 37°C, and cool electroporation cuvettes on ice.

Next, thaw washed electrocompetent cells on ice.

Add 1-5uL of 1ng/μL cold plasmid that is salt free to bacterial cells, mix gently, and add the mixture to the cold cuvette. Make sure there are no bubbles.

Set the voltage and field strength of the electroporator to the correct settings for your cells. Here you see an electroporator being set to 1700 volts and yielding a field strength of 17kV/cm.

Wipe the outside of the cuvette dry and place it into the electroporator. Pulse the cells until you hear a beep.

Unsuccessful pulsing causes an electrical discharge, which is observable as a visible spark and audible pop. This discharge, referred to as arcing, can be the result of having too much salt in your competent cells or DNA.

The success of your transformation can be predicted by noting the time constant, which is the duration it takes for the voltage to decay after applying the pulse. When salt is present and the electroporation solution is very conductive, the decay happens rapidly, causing the discharge, and thereby killing many of your cells. For bacteria, good time constants range from 5-10 milliseconds.

Immediately after pulsing, remove the cuvette and add 1 ml of media directly to the cells. This cell containing media is placed in a tube and incubated at 37°C for 1 hour, with shaking, in order for the cells to recover.

Then, using aseptic technique add 20-200uL of the cell to an antibiotic containing agar plate. Invert the plates so that the agar is on top and so condensation does not fall into your cells and incubate overnight at 37°C.

Bacteria transformed with the plasmid should form colonies. Count the colonies and calculate the transformation efficiency, which is the number of successful transformants divided by the total amount of DNA plated.

The agar and media, which provide the nutrition for your bacteria, should be pre-prepared and sterilized via autoclaving. Allow liquid media to cool to room temperature before using and let the agar cool to 50-55˚C – the temperature at which antibiotic can be added and plates poured. Then, allow plates to cool to room temperature to solidify.

Since bacteria used in transformation are stored in the freezer, they must first be thawed on ice, spread on an agar plate without antibiotics and then grown overnight at 37˚C.

Using aseptic technique select a bacterial colony from the agar plate and grow it up in a larger 500mL culture overnight at 37°C in a shaking incubator.

While the cells are growing, prepare about a liter of deionized water and make up a 10% glycerol and water, volume to volume solution. Autoclave the solutions and let them cool at 4˚C.

Absorbance measurements are used to determine whether or not the bacteria are in their mid log phase of growth, which means they will readily take up DNA. Once cells have reached this phase, place them on ice and keep them there throughout the procedure.

Next, wash cells by separating them in two large centrifuge tubes and spin at 4°C, pour off supernatant and resuspend in cold 100mL sterile deionized water. Repeat this step at least one more time. The purpose of this step particular step is to remove salt, which will strongly affect the electroporation technique.

Perform two additional washes in 50 ml of 10% glycerol in water and finally resuspend the bacteria in this same solution.

Add 50μL of cells into multiple Eppendorf tubes. These cells are now ready for use in electroporation and should be kept at 4˚C. Or they can be flash frozen and stored at -80˚C.

As you are about to see, electroporation has many applications.

An alternative to electroporation is heat shock transformation, which relies on the exposure of the bacteria to both calcium chloride and heat in order to introduce DNA into your cells.

In general, heat shock is gentler on your bacteria than electroporation and doesn’t require low salt. Ligation reactions, those that involve inserting your target gene into the plasmid, can be used directly in heat shock transformation. Heat shock transformation is cheaper than electroporation and doesn’t rely on expensive equipment or cuvettes. On the other hand, heat shock leads to lower transformation efficiencies than electroporation and takes longer. Also it is limited to bacterial, yeast and plant protoplasts while electroporation can be applied to mammalian cells.

Here you see mouse embryonic fibroblasts being loaded into an electroporation cuvette. Once electroporation is complete, transformation efficiencies can be determined by observing the extent to which cells produce a green fluorescence protein encoded by the plasmid. Transfection is the term given to the transformation of mammalian cells, which typically requires lower field strengths than bacterial cells and higher time constants.

Electroporation can also be performed in whole animals like the developing chicken embryo you seen here. Plasmid DNA is injected into the brain of the chick and then an electroporation probe is used to apply an electric field to the brain tissue. After a day or two, green and red fluorescent proteins – encoded by the plasmid – are made by neurons, and scientists can observe structural changes in the developing chick brain.

You’ve just watched JoVE introduction to bacterial transformation by electroporation. This video introduced the plasmid as the most commonly transformed type of DNA, discussed the biophysical mechanism thought to underlie electroporation, showed a generalized procedure for conducting electroporation, and described how electroporation can be used in mammalisn system. Thanks for watching!

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Bacterial Transformation Electroporation Plasmid DNA High Voltage Electric Field Pulses Bacterial Cell Membrane Vector Multiple Cloning Site Restriction Endonucleases Restriction Enzymes Origin Of Replication Antibiotic Resistance Gene