2.7: Transformação Bacteriana: Eletroporação

A transformação bacteriana é um processo que ocorre naturalmente, no qual as bactérias ingerem DNA estranho e depois o amplificam ou clonam. No laboratório, esse processo pode ser induzido artificialmente, usando pulsos de campo elétrico de alta voltagem para criar poros na membrana celular bacteriana, através dos quais o DNA do plasmídeo pode passar. A eletroporação refere-se a este método e o vídeo a seguir demonstrará seus princípios, procedimento passo a passo e aplicações.

Antes de falarmos sobre eletroporação de bactérias, é importante entender o tipo de DNA usado nesses experimentos: o plasmídeo. Um plasmídeo é um pequeno pedaço de DNA extracromossômico circular que atua como um vetor, um portador de sua sequência específica de DNA.

Se essa sequência é um gene para uma proteína de fluorescência em águas-vivas ou uma enzima de plantas, ela é inserida no plasmídeo por meio de uma região chamada local de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas que são clivadas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. As mesmas enzimas de restrição podem ser usadas para cortar sua sequência de interesse, de modo que as extremidades sejam complementares às extremidades recém-cortadas do plasmídeo.

Os plasmídeos também contêm uma origem de replicação, abreviada como ORI, que indica o ponto em que será replicada. Quando se trata de transformação, o gene de resistência a antibióticos é de vital importância. Como o próprio nome indica, esse gene permite que as bactérias produzam uma enzima que neutraliza o antibiótico, permitindo que elas sobrevivam em meios contendo antibióticos.

A eletroporação faz uso de um dispositivo especializado chamado eletroporador. Normalmente, as células são colocadas em uma cubeta de eletroporação, que possui eletrodos em cada lado que fazem contato elétrico com a máquina uma vez inseridas.

Células bacterianas misturadas com DNA são carregadas na cubeta de eletroporação e um campo elétrico da ordem de 1000 a 10.000 volts por centímetro é aplicado por alguns milissegundos. Isso faz com que a voltagem através da membrana atinja 0,5-1 volts, o que se acredita levar a um rearranjo da bicamada fospolipídica que compreende a membrana celular de tal forma que os poros se formarão. Nesse estado, o DNA do plasmídeo passará pela membrana e, quando a pulsação estiver completa, a bicamada se reparará.

Tendo absorvido o plasmídeo, as bactérias podem crescer em placas de ágar contendo antibiótico.

Agora que aprendemos sobre plasmídeos e o mecanismo de eletroporação. Vamos dar uma olhada em como o procedimento é conduzido.

As células que podem absorver prontamente o DNA são chamadas de células competentes. O tipo mais comum de bactéria competente que é transformada na pesquisa de biologia molecular é a E. coli, que são as bactérias procarióticas que vivem no intestino grosso. E. coli que são preparadas para eletroporação são chamadas de células eletrocompetentes.

Sempre que manusear bactérias, certifique-se de que a área de trabalho esteja o mais limpa possível.

O manuseio de bactérias também requer que se pratique uma técnica asséptica. Normalmente, isso envolve o uso de um bico de Bunsen para esterilizar instrumentos e criar uma corrente de convecção ? que mantém os contaminantes transportados pelo ar longe do espaço de trabalho.

Imediatamente antes da eletroporação, pré-aqueça o meio à temperatura ambiente, leve as placas de ágar contendo antibiótico a 37? C e cubetas de eletroporação frias no gelo.

Em seguida, descongele as células eletrocompetentes lavadas no gelo.

Adicione 1-5uL de 1ng/? L plasmídeo frio que é livre de sal para as células bacterianas, misture delicadamente e adicione a mistura à cubeta fria. Certifique-se de que não haja bolhas.

Defina a tensão e a intensidade do campo do eletroporador para as configurações corretas para suas células. Aqui você vê um eletroporador sendo ajustado para 1700 volts e produzindo uma intensidade de campo de 17kV/cm.

Limpe a parte externa da cubeta e coloque-a no eletroporador. Pulse as células até ouvir um bipe.

A pulsação malsucedida causa uma descarga elétrica, que é observável como uma faísca visível e um estalo audível. Essa secreção, conhecida como arco, pode ser o resultado de ter muito sal em suas células ou DNA competentes.

O sucesso de sua transformação pode ser previsto observando a constante de tempo, que é a duração que leva para a tensão decair após a aplicação do pulso. Quando o sal está presente e a solução de eletroporação é muito condutora, a decomposição ocorre rapidamente, causando a descarga e, assim, matando muitas de suas células. Para bactérias, as boas constantes de tempo variam de 5 a 10 milissegundos.

Imediatamente após a pulsação, remova a cubeta e adicione 1 ml de meio diretamente às células. Esta célula contendo mídia é colocada em um tubo e incubada a 37? C por 1 hora, com agitação, para que as células se recuperem.

Em seguida, usando técnica asséptica, adicione 20-200uL da célula a um antibiótico contendo placa de ágar. Inverta as placas para que o ágar fique no topo e para que a condensação não caia em suas células e incube durante a noite a 37?C.

As bactérias transformadas com o plasmídeo devem formar colônias. Conte as colônias e calcule a eficiência da transformação, que é o número de transformantes bem-sucedidos dividido pela quantidade total de DNA plaqueado.

O ágar e o meio, que fornecem a nutrição para suas bactérias, devem ser pré-preparados e esterilizados em autoclavagem. Deixe o meio líquido esfriar até a temperatura ambiente antes de usar e deixe o ágar esfriar até 50-55? C ? a temperatura na qual o antibiótico pode ser adicionado e os pratos derramados. Em seguida, deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente para solidificar.

Como as bactérias usadas na transformação são armazenadas no freezer, elas devem primeiro ser descongeladas no gelo, espalhadas em uma placa de ágar sem antibióticos e depois cultivadas durante a noite a 37?C.

Usando técnica asséptica, selecione uma colônia bacteriana da placa de ágar e cultive-a em uma cultura maior de 500 mL durante a noite a 37? C em uma incubadora trêmula.

Enquanto as células estão crescendo, prepare cerca de um litro de água deionizada e faça uma solução de glicerol a 10% e água, volume a volume. Autoclave as soluções e deixe-as esfriar a 4?C.

As medições de absorbância são usadas para determinar se as bactérias estão ou não em sua fase intermediária de crescimento, o que significa que elas absorverão prontamente o DNA. Assim que as células atingirem essa fase, coloque-as no gelo e mantenha-as lá durante todo o procedimento.

Em seguida, lave as células separando-as em dois grandes tubos de centrífuga e gire a 4? C, despeje o sobrenadante e ressuspenda em água desionizada estéril fria de 100mL. Repita esta etapa pelo menos mais uma vez. O objetivo desta etapa em particular é remover o sal, o que afetará fortemente a técnica de eletroporação.

Realize duas lavagens adicionais em 50 ml de glicerol a 10% em água e, finalmente, ressuspenda as bactérias nesta mesma solução.

Adicionar 50? L de células em vários tubos Eppendorf. Essas células agora estão prontas para uso em eletroporação e devem ser mantidas a 4?C. Ou eles podem ser congelados rapidamente e armazenados a -80?C.

Como você está prestes a ver, a eletroporação tem muitas aplicações.

Uma alternativa à eletroporação é a transformação por choque térmico, que depende da exposição das bactérias ao cloreto de cálcio e ao calor para introduzir DNA em suas células.

Em geral, o choque térmico é mais suave para as bactérias do que a eletroporação e não requer baixo teor de sal. As reações de ligação, aquelas que envolvem a inserção do gene-alvo no plasmídeo, podem ser usadas diretamente na transformação por choque térmico. A transformação por choque térmico é mais barata do que a eletroporação e não depende de equipamentos ou cubetas caras. Por outro lado, o choque térmico leva a menores eficiências de transformação do que a eletroporação e leva mais tempo. Também é limitado a protoplastos bacterianos, leveduras e vegetais, enquanto a eletroporação pode ser aplicada a células de mamíferos.

Aqui você vê fibroblastos embrionários de camundongos sendo carregados em uma cubeta de eletroporação. Uma vez concluída a eletroporação, as eficiências de transformação podem ser determinadas observando até que ponto as células produzem uma proteína de fluorescência verde codificada pelo plasmídeo. Transfecção é o termo dado à transformação de células de mamíferos, que normalmente requer intensidades de campo mais baixas do que as células bacterianas e constantes de tempo mais altas.

A eletroporação também pode ser realizada em animais inteiros, como o embrião de galinha em desenvolvimento que você viu aqui. O DNA do plasmídeo é injetado no cérebro do filhote e, em seguida, uma sonda de eletroporação é usada para aplicar um campo elétrico ao tecido cerebral. Depois de um ou dois dias, as proteínas fluorescentes verdes e vermelhas - codificadas pelo plasmídeo - são produzidas pelos neurônios, e os cientistas podem observar mudanças estruturais no cérebro do pintinho em desenvolvimento.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à transformação bacteriana por eletroporação. Este vídeo apresentou o plasmídeo como o tipo de DNA mais comumente transformado, discutiu o mecanismo biofísico que se acredita estar subjacente à eletroporação, mostrou um procedimento generalizado para a realização de eletroporação e descreveu como a eletroporação pode ser usada no sistema de mamíferos. Obrigado por assistir!