Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir nanossensores sensíveis ao pH e scaffolds autorrelatáveis que possam ser monitorados em tempo real e in loco, a fim de auxiliar na compreensão das condições que influenciam o crescimento celular. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de nanossensores biocompatíveis responsivos a analitos, os quais podem monitorar o pH por meio de sinais de fluorescência. Em um segundo passo, os nanossensores sensíveis ao pH são incorporados a scaffolds poliméricos eletrofiados, formando um ambiente tridimensional no qual as células podem ser cultivadas e monitoradas.

Em seguida, células mamíferas são cultivadas sobre os andamios eletrofiados e nanossensores também são introduzidos em seu ambiente intracelular para monitorar o pH intracelular. Durante os experimentos, são obtidos resultados que demonstram a capacidade dos nanossensores intracelulares e dos andamios autorrelatáveis de monitorar o pH em ambientes de engenharia tecidual com base nas razões de fluorescência adquiridas por microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de eletrodos eletrônicos de pH, é que as medições podem ser realizadas in situ e em tempo real, sem a necessidade de interromper o crescimento celular.

Para começar, prepare os fluoróforos dissolvendo 1,5 miligramas de fam SE em um mililitro de dimetilformamida, conhecida como DMF, em um balão de fundo redondo. Dissolva também 1,5 miligramas de Tamara SE em um mililitro de DMF em um segundo balão. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de três amino propil trietoxissilano a cada balão e agite continuamente no escuro, sob atmosfera seca de nitrogênio, a 21 graus Celsius por 24 horas.

Em seguida, adicione 250 microlitros de ambas as soluções corantes a uma mistura contendo seis mililitros de etanol e quatro mililitros de hidróxido de amônio contidos em um balão de fundo redondo. Agite essa nova mistura a 21 graus Celsius após uma hora. Adicione lentamente 0,5 mililitros de ortossilicato de tetraetila à mistura e continue agitando por mais duas horas.

Durante esse período, espera-se que a mistura fique turva; em seguida, colete os nanossensores por evaporação rotativa e armazene-os em um frasco de vidro a quatro graus Celsius para uso futuro. Em seguida, adicione os nanossensores secos de pH na concentração de cinco miligramas por mililitro em tampões fosfato de Sorenson, variando de pH 5,5 a pH 7,5 em incrementos de 0,5 unidade de pH. Re-suspenda os nanossensores agitando as amostras em vórtex por três minutos e, em seguida, sonique por cinco minutos ou até que a solução fique turva.

Colete os dados de calibração medindo as amostras em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros para FAM e 568 nanômetros. Para Tamara, colete as emissões entre 500 e 530 nanômetros para FAM e entre 558 e 580 nanômetros para Tamara, e calcule a razão entre os máximos de emissão produzidos em cada valor de pH. Em seguida, prepare a amostra para imagem de MEV colocando uma amostra de nanossensores sobre um suporte para microscópio eletrônico revestido com carbono e recobrindo as partículas com ouro por pulverização catódica durante cinco minutos sob atmosfera de argônio.

Uma vez revestidas, coloque as amostras no microscópio eletrônico e ajuste a distância de trabalho, a voltagem e a magnificação para minimizar a carga de elétrons e produzir as melhores imagens em uma capela de exaustão. Prepare uma solução de 20% de PLGA em diclorometano com 1% de formiato de perineu. Carregue a solução em uma seringa de 10 mililitros com uma agulha romba de 18 calibres e fixe-a com segurança em uma bomba de infusão.

Essa solução será utilizada para fabricar scaffolds de controle de PLGA, posicionando a ponta da agulha a 20 centímetros de distância de uma placa coletora de alumínio com dimensões de 20 por 15 centímetros, e conectando o eletrodo de uma fonte de alta tensão à ponta da seringa e aterrando o fio à placa coletora de alumínio. Em seguida, ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 12 quilovolts. Depois, ligue a bomba de seringa e administre a solução utilizando uma taxa de fluxo constante de 3,5 mililitros por hora durante duas horas.

Isso produzirá uma profundidade do suporte de aproximadamente 60 micrômetros. Após a conclusão, desligue o equipamento e deixe o suporte na capela por 24 horas para permitir a evaporação do resíduo de solvente. Para preparar suportes incorporados com nanossensores sensíveis ao pH, prepare a solução de PLGA como anteriormente, mas desta vez adicione também cinco miligramas por mililitro dos nanossensores.

Em seguida, eletrofie o material sensível ao pH usando as mesmas configurações anteriores. A seguir, calibre a sensibilidade ao pH do suporte colocando pequenas amostras do suporte seco com nanossensores incorporados em placas de cultura de 35 milímetros e imergindo-as em dois mililitros de tampões fosfato de Sorensen com pH entre 5,5 e 7,5, em incrementos de 0,5, em um microscópio confocal. Utilize um laser de argônio de 488 nanômetros para excitar o FAM e um laser de criptônio de 568 nanômetros para excitar o Tamara dentro dos nanossensores.

Observe a emissão em 500 a 530 nanômetros para FAM e 558 a 580 nanômetros para Tamara, e então calcule a razão entre os máximos de emissão produzidos em cada valor de pH. Primeiro, esterilize as superfícies dos suportes com uma fonte de luz UV a uma distância de oito centímetros, durante 15 minutos em cada lado. Em seguida, transfira os suportes esterilmente para uma placa de cultura de 12 poços e coloque um anel de aço com diâmetro interno de um centímetro e diâmetro externo de dois centímetros sobre o suporte.

Em seguida, adicione PBS com 5%pen strep à parte interna e externa do anel de aço e incube as amostras durante a noite. No dia seguinte, remova o PBS com 5%pen strep e lave as estruturas com PBS.

Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de cultura celular ao interior e ao exterior do anel de aço e pré-aqueça a placa em uma incubadora. Depois, recolha as células de interesse e prepare uma suspensão celular com uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Quando as células estiverem prontas, remova o meio do poço e adicione um mililitro de meio fresco ao exterior do anel de aço.

Em seguida, adicione 300 microlitros da suspensão celular no interior do anel de aço e balance suavemente a placa para distribuir as células uniformemente. Coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO2 e incube as células pelo tempo necessário. Troque o meio a cada dois ou três dias, semeando as células sobre os scaffolds conforme descrito na seção anterior e permitindo que cresçam sem interrupção por 72 horas.

Em seguida, lave as células com PBS e adicione 500 microlitros de meio sem soro na parte externa do anel e 300 microlitros na parte interna do anel. Incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius durante a incubação. Prepare a solução A adicionando cinco miligramas dos nanossensores a 50 microlitros de OptiMEM e vortexe brevemente.

Em seguida, prepare a solução B adicionando cinco microlitros de lipectomy 2000 a 45 microlitros de Optum e deixe a mistura incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. A seguir, adicione a solução A à mistura da solução B e incube por 20 minutos à temperatura ambiente para formar a solução C, que é o complexo de lipossomos nanossensores. Retire a placa do incubador e adicione 100 microlitros da solução complexa ao interior do anel de aço.

Em seguida, coloque a placa de volta no incubador e incube as células com os complexos do reagente lipectômico por três horas após a incubação. Aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS aquecido antes de imergir a matriz com células em tampões de diferentes pHs para monitorar a resposta dos nanossensores. Agora no interior das células, realize imagens das células utilizando microscopia confocal de fluorescência para rastrear a localização dos nanossensores dentro de células de mamíferos.

Primeiro, prepare e adicione apenas fam contendo nanossensores às células cultivadas em scaffolds de PLGA. Em seguida, adicione dois microlitros de lyo tracker red 50 nanomolar a 300 microlitros de meio e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Após o período de incubação, remova o meio e lave as células duas vezes com PBS.

Em seguida, adicione dois microlitros de PBS ou outro meio livre de vermelho de fenol para cobrir as células durante a imagem confocal. A seguir, adicione cinco micromolar do corante nuclear, drac cinco, ao PBS e incube com as células por três minutos a 37 graus Celsius. Após três minutos, remova a placa do incubador e coloque-a na platina confocal para obtenção de imagens, dos nanossensores, organelas ácidas e núcleo utilizando diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão conforme descrito no protocolo de texto acompanhante, usando varredura sequencial para evitar a coleta de comprimentos de onda de excitação. A distribuição de tamanho dos nanossensores sensíveis ao pH preparados foi caracterizada utilizando MEV, em que a população de nanossensores analisada foi medida e apresentou dimensões na escala de nanômetros na faixa de 240 a 470 nanômetros.

À esquerda, é mostrada uma imagem de fibras de PLGA eletrofiadas, e à direita, fibras de PLGA eletrofiadas com nanossensores. As micrografias de MEV das fibras fornecem evidências da associação de nanossensores na superfície das fibras. No entanto, eles também podem ser incorporados dentro das fibras da estrutura.

Uma vez eletrofiados, os nanossensores mantêm a capacidade de permanecerem opticamente e quimicamente ativos e são mostrados aqui associados às fibras do suporte. À esquerda está o corante fam mostrado em verde, e à direita está o corante Tamara mostrado em vermelho. A razão da intensidade fluorescente produz uma curva de calibração conforme mostrado aqui.

Os nanossensores avaliados isoladamente e quando incorporados em scaffolds de PLGA eletrofiados se assemelharam, demonstrando que os nanossensores mantêm sua atividade óptica após a incorporação nos scaffolds. Os nanossensores incorporados também responderam reversivelmente de forma adequada às variações de pH conforme o tampão foi alternado entre pH 5,5 e 7,5. A razão fam Tamra respondeu de maneira previsível a cada vez que foi medida.

Aqui estão imagens confocais de fibroblastos que tiveram nanossensores entregues intracelularmente por meio de reagente de transfeção. A colocalização pontuada dos corantes fam e Tamara sugere que os corantes permaneceram aprisionados na matriz do nanossensor. A entrega intracelular dos nanossensores pode ser confirmada pela medição da razão fam/Tamara em células colocadas em diversos tampões.

Como é possível observar aqui, a razão aumenta ao medir os nanossensores baseados em estruturas, mas permanece estável ao medir os sensores dentro das células. Após o desenvolvimento dessa técnica, pesquisadores na área de engenharia de tecidos poderão investigar in situ e em tempo real. Alterações do pH intracelular no microambiente dentro de construtos celulares tridimensionais sem perturbar o experimento em andamento.