Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir nanossensores responsivos ao pH e andaimes auto-relatados que possam ser monitorados em tempo real e in situ para auxiliar na compreensão das condições que influenciam o crescimento celular. Isso é obtido preparando primeiro nanossensores responsivos a analitos biocompatíveis, que podem monitorar o pH por meio de saídas de fluorescência. Como uma segunda etapa, nanossensores responsivos ao pH são incorporados em andaimes poliméricos eletrofiados, formando um ambiente 3D no qual as células podem ser cultivadas e monitoradas.

Em seguida, as células de mamíferos são assentadas nos andaimes eletrofiados e os nanossensores também são entregues em seu ambiente intracelular para monitorar o pH intracelular. Durante a experimentação, são obtidos resultados que mostram a capacidade de nanossensores intracelulares e andaimes auto-relatados de monitorar o pH em ambientes de engenharia de tecidos com base nas taxas de fluorescência adquiridas por microscopia confocal. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de sondas eletrônicas de pH, é que as medições podem ser realizadas in situ e em tempo real sem ter que perturbar o crescimento celular.

Para começar, prepare os fluoróforos dissolvendo 1,5 miligramas de fam SE em um mililitro de dimetilformamida conhecido como DMF em um fundo redondo. O frasco também dissolve 1,5 miligramas de Tamara SE em um mililitro de DMF em um segundo frasco. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de trietil de três amino propila a cada frasco e mexa continuamente no escuro sob uma atmosfera seca de nitrogênio a 21 graus Celsius por 24 horas.

Em seguida, adicione 250 microlitros de ambas as soluções de corante a uma mistura contendo seis mililitros de etanol e quatro mililitros de hidróxido de amônio contidos em um frasco de fundo redondo. Mexa esta nova mistura a 21 graus Celsius após uma hora. Adicione lentamente 0,5 mililitros de tetraetil ortossilicato à mistura e continue mexendo por mais duas horas.

Durante esse período, espere que a mistura fique turva, depois colete os nanossensores por evaporação rotativa e armazene-os em um frasco de vidro a quatro graus Celsius para uso futuro. Em seguida, adicione os nanossensores de pH secos a cinco miligramas por mililitro nos tampões de fosfato de Sorenson, variando de pH 5,5 a pH 7,5 em incrementos de pH 0,5. Ressuspenda os nanossensores por vórtice das amostras por três minutos e depois sonique-as por cinco minutos ou até que a solução fique turva.

Colete dados de calibração medindo as amostras em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros para FAM e 568 nanômetros. Para Tamara, colete as emissões em 500 a 530 nanômetros para FAM e 558 a 580 nanômetros para Tamara e calcule a proporção de emissões máximas produzidas em cada valor de pH. Em seguida, prepare a amostra para imagens de SEM colocando uma amostra de nanossensores em um microscópio eletrônico revestido de carbono, stub e stubter revestindo as partículas com ouro por cinco minutos sob uma atmosfera de argônio.

Uma vez revestidas, coloque as amostras no microscópio eletrônico e ajuste a distância de trabalho, tensão e ampliação para minimizar a carga de elétrons e produzir as melhores imagens em uma capela de exaustão. Faça uma solução de 20% de PLGA em di clorometano com 1% de formato de períneo. Carregue a solução em uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de enchimento rombo de calibre 18 e encaixe-a firmemente em uma bomba de seringa.

Esta solução será usada para fazer com que os andaimes PLGA de controle distanciem a ponta da agulha a 20 centímetros de uma placa coletora de alumínio de 20 por 15 centímetros e conecte o eletrodo de uma fonte de alimentação de alta tensão à ponta da seringa e aterre o fio à placa coletora de alumínio. Em seguida, ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 12 quilovolts. Em seguida, ligue a bomba de seringa e forneça a solução usando uma vazão constante de 3,5 mililitros por hora durante duas horas.

Isso produzirá uma profundidade de andaime de aproximadamente 60 mícrons. Uma vez terminado, desligue o equipamento e deixe o andaime na hotte por 24 horas para permitir que o resíduo de solvente evapore. Para preparar andaimes incorporados com nanossensores responsivos ao pH, prepare a solução de PLGA como antes, mas desta vez também adicione cinco miligramas por mililitro dos nanossensores.

Em seguida, gire eletrograficamente o pH responsivo usando as mesmas configurações de antes. Em seguida, calibre a capacidade de resposta ao pH do andaime colocando pequenas amostras do andaime seco com nanossensores incorporados em placas de cultura de 35 milímetros e imergindo-as em dois mililitros de tampões de fosfato sorensen entre pH 5,5 e 7,5 em incrementos de 0,5 em um microscópio confocal. Use um laser de argônio de 488 nanômetros para excitar o FAM e um laser de criptônio de 568 nanômetros para excitar Tamara dentro dos nanossensores.

Observe a emissão em 500 a 530 nanômetros para FAM e 558 a 580 nanômetros para Tamara e, em seguida, calcule a razão dos máximos de emissão produzidos em cada valor de pH. Primeiro, esterilize as superfícies dos andaimes com uma fonte de luz ultravioleta a uma distância de oito centímetros por 15 minutos de cada lado. Em seguida, transfira estérilmente os andaimes para uma placa de cultura de 12 poços e coloque um anel de aço com um diâmetro interno de um centímetro e diâmetro externo de dois centímetros sobre o andaime.

Em seguida, adicione PBS com 5% de tira de caneta no interior e no exterior do anel de aço e incube as amostras durante a noite. No dia seguinte. Remova o PBS com 5% de estreptococos e lave os andaimes com PBS.

Em seguida, adicione 500 microlitros de meios de cultura de células no interior e no exterior do anel de aço e pré-aqueça a placa em uma incubadora. Em seguida, colha as células de interesse e prepare uma suspensão celular de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro. Quando as células estiverem prontas, remova a mídia do poço e adicione um mililitro de mídia fresca na parte externa do anel de aço.

Em seguida, adicione 300 microlitros da suspensão celular no interior do anel de aço e balance suavemente a placa para distribuir uniformemente as células. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de CO2 e incube as células pelo tempo que for necessário. Atualizar o meio a cada dois ou três dias semeia células nos andaimes, conforme descrito na seção anterior, e permite que cresçam ininterruptamente por 72 horas.

Em seguida, enxágue as células com PBS e adicione 500 microlitros de meio livre de soro na parte externa do anel e 300 microlitros dentro do anel. Incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius durante a incubação. Prepare a solução A adicionando cinco miligramas dos nanossensores com 50 microlitros de óptimo e fornicando brevemente.

Em seguida, misture a solução B adicionando cinco microlitros de lipectomia 2000 a 45 microlitros de Optum e deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione a solução A à mistura da solução B e, em seguida, incube à temperatura ambiente por 20 minutos para formar a solução C, que é o complexo de lipossomas nanossensores. Remova a placa da incubadora e adicione 100 microlitros da solução complexa ao interior do anel de aço.

Em seguida, coloque a placa de volta na incubadora e incube as células com os complexos reagentes de lipectomia por três horas após a incubação. Aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS aquecido antes de imergir o andaime assentado da célula em tampões de phs diferentes para monitorar a resposta dos nanossensores. Agora, dentro das células, obtenha imagens das células usando microscopia confocal de fluorescência para rastrear a localização dos nanossensores dentro das células de mamíferos.

Primeiro, prepare e entregue apenas nanossensores contendo fam para células assentadas em andaimes PLGA. Em seguida, adicione dois microlitros de 50 nano molar lyo tracker vermelho a 300 microlitros de meio e incube por uma hora a 37 graus Celsius após o período de incubação. Remova a mídia e lave as células duas vezes com PBS.

Em seguida, adicione dois microlitros de PBS ou outro meio livre de vermelho de fenol para cobrir as células durante a imagem confocal. Em seguida, adicione cinco micromolares da coloração nuclear, drac cinco ao PBS e incube com as células por três minutos a 37 graus Celsius. Após três minutos, remova a placa da incubadora e coloque-a no estágio confocal para imagem de imagem, as organelas ácidas e o núcleo dos nanossensores usando vários comprimentos de onda de excitação e emissão, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha enquanto usa varredura sequencial para evitar a coleta de comprimentos de onda de excitação, a distribuição de tamanho dos nanosensores responsivos ao pH preparados foi caracterizada usando SEM, onde a população de nanossensores fotografados foi medida e encontrada para têm dimensões nanométricas na faixa de 240 a 470 nanômetros.

À esquerda é mostrada uma imagem de fibras PLGA fiadas por eletros e, à direita, são fibras PLGA fiadas por eletros com nanossensores. As micrografias de MEV das fibras fornecem evidências de associação de nanossensores na superfície das fibras. No entanto, eles também podem ser incorporados às fibras do andaime.

Uma vez que os eletros giram, os nanossensores mantêm sua capacidade de permanecer óptica e quimicamente ativos e são mostrados aqui associados às fibras do andaime. À esquerda está o corante fam mostrado em verde e à direita está o corante Tamara mostrado em vermelho. A taxa de intensidade fluorescente produz uma curva de calibração como mostrado aqui.

Nanossensores avaliados isoladamente e quando incorporados em andaimes PLGA eletrofiados espelharam uns aos outros, demonstrando que os nanossensores retêm sua atividade óptica após a incorporação nos andaimes. Os nanossensores incorporados também respondem bem de forma reversível à mudança dos valores de pH, pois o tampão foi alternado entre um pH de 5,5 e 7,5. A proporção da família Tamra respondeu previsivelmente a cada vez mostrada.

Aqui estão imagens confocais de fibroblastos que tiveram nanossensores entregues intracelularmente via reagente de transfecção. A colocalização puntiforme dos corantes fam e Tamara sugere que os corantes permaneceram presos na matriz do nanossensor. A entrega intracelular dos nanossensores pode ser confirmada medindo a proporção fam Tamara de células colocadas em vários tampões.

Como você pode ver aqui, a proporção aumenta ao medir os nanossensores baseados em andaimes, mas permanece estável ao medir os sensores dentro das células. Após o desenvolvimento desta técnica, pesquisadores da área de engenharia de tecidos poderão investigar in situ e em tempo real. O pH intracelular microambiental muda dentro das construções celulares 3D sem perturbar o experimento em andamento.