Name: Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis /i (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a preparar gânglios de sanguessuga Hirudo medicinalis para gravação intracelular, mapeamento de campos sensoriais e cultivo de neurônios. Este método permite estudar princípios fundamentais de neurofisiologia em um sistema nervoso acessível.

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1. Preparação de eletrodos e Solução Salina <ol><li> Prepare uma solução salina fisiológica e eléctrodos antes de o animal é dissecado. Solução de Ringer sanguessuga consiste do seguinte: NaCl 115,3 mM, 1,8 mM de CaCl2, KCl 4,0 mM, Tris 10 mM / ácido maleico ou HEPES. Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Preparar um fio de Ag-Cl mergulhando um fio de prata limpos em uma pequena quantidade de lixívia de 20 min ou até que o fio tem um acabamento liso cinzento escuro. Lava-se a fios com água destilada antes de usar. Em seguida, coloque o fio em um suporte micropipeta que se conecta ao amplificador. </li><li> Prepare um eletrodo de vidro cortante de vidro de borosilicato usando um extrator pipeta. A resistência do eléctrodo deve ser da ordem de 20 mohms. </li><li> Backfill a pipeta com a solução de acetato de potássio 3 M e cole em no suporte da micropipeta. </li><li> Para um eletrodo extracelular preparar uma pipeta de vidro afiada como descrito acima, quebrar a ponta de volta poresfregando outra pipeta afiada perto da borda afiada. Então fogo polir a ponta para que ele não rasgue os conectivos. Eletrodos extracelulares de plástico também irá funcionar, desde que haja um bom contato entre o eletrodo eo nervo. </li><li> Insira o eletrodo extracelular gravação em um suporte micropipeta (com fio de Ag-Cl), que está equipado com um tubo de borracha e uma seringa para sucção. Usar a seringa para extrair solução salina no eléctrodo pelo menos ao nível do fio de prata. </li><li> Configure o hardware (amplificador e isolador de estímulo) e parâmetros de gravação de software, seguindo o manual da sua unidade de gravação de sinal específico. Veja Leksrisawat et al. 22 para ver os detalhes sobre os equipamentos utilizados nos experimentos descritos abaixo. </li></ol> 2. Ventral Ganglion Dissection <ol><li> Dissecar a sanguessuga em um grande silicone forrada de elastômero prato com solução de Ringer sanguessuga. Se o animal é esticada longitudinalmente que vaiser mais fácil remover o cordão nervoso ventral (ver Figura 1A). </li><li> Com N º 10 ou n º 11 tamanho bisturi, faça uma incisão longitudinal com cortes muito superficiais na linha média ventral. Sobre o meio 2/3rd do corte ventral é mostrado na Figura 1B. Tente não cortar a meia preta (o seio de sangue ventral) até que o animal está totalmente aberto eo seio de sangue é esticado, sem dobras. Este seio de sangue percorre todo o comprimento do animal ao longo da linha média ventral. O VNC está contido dentro deste vaso sangüíneo. </li><li> Após a pele foi cortada do comprimento total do animal use as tesouras finas a íris nick o seio do sangue (Figura 2). Deslize uma lâmina da tesoura de íris finas sob o seio e aumentar ligeiramente a lâmina para separá-lo do tecido nervoso. Cortar o seio do comprimento do VNC, evitando as raízes nervosas, nervos segmentares, ou conectivos entre gânglios. </li><li> Em seguida, remova parte do cordão nervoso ventral porcortando as raízes distais ao local onde o vaso sanguíneo se junta as raízes. Repetir este processo para cada gânglio ao longo do comprimento do cordão nervoso ventral. </li><li> Transferir um segmento de um ou dois gânglios a um menor placa de Petri. Os gânglios ou o único gânglio deve ser fixado tenso com alguma folga. </li><li> Pin os conectivos e as raízes para que a bainha gânglio glial é um pouco esticado para evitar que os corpos celulares dos neurônios de se movimentar quando espetando através da bainha glial e no neurônio de interesse. Os pinos devem ser colocados através do seio preto para as raízes e no meio dos dois conectores para minimizar os danos dos axónios (Figura 3). </li><li> Colocar a placa de Petri com uma preparação sob o microscópio e fixá-lo com cera no fundo do recipiente para impedir o movimento. </li><li> Cuidadosamente concentrar o feixe de luz através de um espelho e um condensador de luz para ver os neurónios, como na Figura 4A (esquematicamente mostrado na Figura 4B </strong&gt;). Repare nas duas grandes células Retzius no centro do gânglio. </li><li> Para fazer uma gravação intracelular do Rz, T, P e N neurónios, colocar cuidadosamente a ponta do eléctrodo sobre a célula de interesse e baixar suavemente a ponta até uma covinha é visto na bainha glial. </li><li> Toque porta-eletrodo ou manipulador (com muito cuidado), de modo que a ponta do eletrodo &quot;pops&quot; na célula de interesse. </li><li> Injectar pulsos curtos (30-40 ms) de corrente positiva (1-10 nA) para dentro da célula para provocar potenciais de acção. </li></ol> 3. Neurônios Cultivar do gânglio ventral Preparação <ol><li> Pin gânglios lado ventral para cima num prato limpo contendo G-15 com soro fetal de vitelo (FCS) (Figura 3). Pin as raízes para que os gânglios são um pouco esticado como foi feito acima para gravações intracelulares. Com uma tesoura fina, entalhe da cápsula da glia em uma extremidade, uma tesoura de deslizamento sob a lâmina da cápsula, em seguida, cortadas em toda a cápsula glialcomo mostrado na Figura 5A. </li><li> Adicionar 100 uL de aliquota de colagenase / Dispase para o prato e lugar num agitador durante 15 min. Examine as células movendo o meio de cultura em torno dos corpos celulares expostas. Retorne as células para o agitador por mais 15 minutos ou mais até que as células saem com sucção mínima. </li><li> Usar uma pipeta ligada a uma seringa para extrair suavemente as células a partir do gânglio. Fogo polir a ponta da pipeta de modo que é ligeiramente maior do que o diâmetro do corpo da célula. Para as células de Rz em um adulto de sanguessuga, o diâmetro deve ser de aproximadamente 50 mm. </li><li> Prepara-se uma variedade de pipetas com diferentes diâmetros, sem um filamento, tal como o que diminui as possibilidades de as células que furam para dentro da pipeta. Armazenar as pipetas num frasco contendo 80% de etanol (EtOH) com uma bola de algodão no fundo para proteger as pontas de lascar. Lembre-se de lavar o EtOH para fora da pipeta com o meio antes de aspirar as células. </li><li> Depois do tratamento enzimático, lavagem dameio com L-15 (com FCS) 2x contendo a enzima. Identificar as células de interesse e desenhá-los suavemente para dentro da pipeta puxando a seringa (Figura 6A). Descarga as células aspirados em um outro prato que contém L-15 (com FCS). </li><li> Até agora, todos os procedimentos eram não-estéril. Execute as seguintes etapas em uma capa estéril. Coloque 3-4 grandes gotas de estéril L-15 (com FCS) em diferentes locais dentro de uma placa de Petri estéril. </li><li> Pipetar as células para uma das gotas antes mencionados, soprando-os em torno da gota para lavá-los. Repetir esta em série em três ou quatro gotas de meio. </li><li> Colocar as células em uma placa de Petri limpa preenchido com L-15 (com FCS). </li><li> Incubar as células durante 1-24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, as células limpas pode ser revestida. Ao deixar as células durante algumas horas ou durante a noite a matriz extracelular sai facilmente. Placa as células imediatamente para gerar processos mais longos. </li><li> Use substrato estéril para revestir uma microplaca di<html> sh e deixe-o secar completamente (durante a noite) antes de cultura experimentos. </li><li> Após o prato foi revestido, lava-se a louça suavemente com água estéril e em seguida, com uma pequena quantidade do meio L-15. Recorde usar a solução de G-15 sem FCS adicionado para permitir que as células aderem ao prato. O meio pode ser suavemente mudada de G-15 com FCS após as células terem aderido ao substrato. Se as células são para ser usadas algumas horas após o plaqueamento, o meio de interrupção, então a L-15 com FCS não é necessário. </li><li> Posicionar as células ao lado do outro no momento de plaqueamento para induzir sinaptogénese rápida (Figura 6B). Após 24 hr medida atividade fisiológica em pares de neurônios. </li><li> Use técnicas eletrofisiológicos intracelulares para gravar RP ou respostas sinápticas em pares em cultura de células (estimular um neurônio através de um eletrodo e gravar intracelulares respostas do celular emparelhado usando um eletrodo intracelular 2). </li></ol>título &quot;&gt; 4. gânglio-corpo parede Preparação <ol><li> Pin lado dorsal da sanguessuga para baixo num prato revestido de elastómero como descrito acima. </li><li> Pin a pele de um dos lados com raízes no outro lado do gânglio cortada (Figura 7A, ampliado na Figura 7B) ou fazer uma janela na face ventral da sanguessuga ao longo de um gânglio (Figura 7C), com todas as raízes para o organismo parede intacta. </li><li> Depois de obter uma gravação intracelular estável em uma das células sensoriais (T, P, N) usam um pequeno bastão de vidro que foi fogo polido para tocar levemente a pele no mesmo segmento. Se o neurónio a ser gravada a partir de uma célula é N então mais pressão terá de ser aplicado sobre a pele. Na maioria dos casos, a célula de N só irá responder se a pele é comprimida com uma pinça. Por esse motivo estas células devem ser tentados último como se poderia danificar a pele ou deslocar a recodificação intracelular por perturbar a preparação de uma tal maneira. </li><li> Deve-se tercapaz de esboçar rapidamente na pele e no gânglio com detalhes suficientes que um mapa do local onde uma tocado pode ser usado para determinar o campo de recepção para um neurónio particular. Depois de gravar a partir de tantas células quanto possível T e P em ambos os lados de um gânglio tentar as células N. </li><li> A fim de examinar se os neurônios sensoriais têm processos que percorrem os conectivos de uma maneira rostral ou caudal e, em seguida, as raízes do segmento adjacente à pele, os conectivos entre gânglios pode ser cortado e os campos receptivos reexaminados em relação ao propagação de detecção. Basicamente se está examinando se houve qualquer perda no campo receptivo. </li></ol> 5. Injetando fluorescente Corantes <ol><li> Preparar um gânglio sanguessuga como descrito acima. </li><li> Encher um microeléctrodo com uma solução de Lucifer amarelo-CH (3,0%) e cloreto de lítio (300 mM). </li><li> Empalar uma das células sensoriais ou células de Rz no lado ventral do gânglio como descritoacima. </li><li> Injectar corante para dentro da célula, passando a corrente negativa (3NA) através do eléctrodo, durante 15 min. Defina a duração do pulso de 100 ms ea freqüência de 2 Hz. </li><li> Visualize os neurônios cheios de corante por emocionante o corante com uma lâmpada de mercúrio e um conjunto de filtros FITC / GFP. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O objectivo deste conjunto de experimentos foi de 1) para ensinar e expor os princípios fundamentais de gravações intracelular de neurônios identificáveis ​​e 2) a reconhecer as formas características de sinais elétricos que podem surgir a partir desses tipos de neurônios específicos usando sanguessugas adultos. Há uma rica história de investigações usando o sanguessuga para investigações neurofisiológicas e investigação está em curso para abordar questões de circuitos neurais e regulação de genes durante o desenvolvimento, bem como durante a reparação e regeneração sináptica 10. Neuromodulação, principalmente através de vias de aminas biogênicas, também tem sido uma direção da investigação, de sanguessuga. Pela adição de dopamina e outros agentes farmacológicos para o sistema nervoso através da solução salina, foi demonstrado que a dopamina modula redes neurais envolvidos em 23 e os padrões motores para rastrear 24,25 comportamento de tomada de decisão. Esta abordagem experimental é uma simple (e barata) maneira de incorporar a modulação para o laboratório de ensino, e ajustando a composição iônica da solução salina é uma forma eficaz de ensinar as equações de Nernst e Goldman-Hodgkin-Katz. Para serem bem sucedidas com as preparações ganglionares é importante para que o gânglio tenso antes de tentar a picar uma soma com um eléctrodo intracelular. Caso contrário, a soma vai passar quando empurrando para baixo o pacote glial. Além disso, quando o gânglio desheathing para a remoção de neurónios por cultura, evitar a região de interesse, quando o corte através do gânglio assim somas não são danificadas à medida que são removidos. Além disso, a incubação excessiva nas enzimas podem resultar nos neurónios ser demasiado frágil para ser removido. Ele requer alguma tentativa e erro para obter um tempo de incubação ideal porque cada lote de enzimas é ligeiramente diferente nas suas acções. Outras investigações para otimizar meios de cultura poderia melhorar esta técnica. Various factores, tais como a presença de insulina, de açúcares, ou factores de crescimento, pode ser examinada por um período de manutenção de culturas. Para determinar se as células a manter a sua capacidade de síntese de transmissores, tais como a síntese de serotonina em células Rz, de coloração de vermelho neutro pode ser aplicado para identificar processos serotonérgicos. Também a invasão da microglia tecido lesionado e regeneração pode ser quantificado por manchas nucleares dias após uma lesão. Embora esta preparação tem muitos benefícios a oferecer ao examinar a regeneração e reparação, bem como circuitos neurais, a identificação farmacológica e molecular dos vários subtipos de receptores nas sinapses não foram totalmente caracterizados. Uma biblioteca de tag seqüência expressa está disponível 26, e do genoma sanguessuga medicinal está sendo montado 27, mas a principal limitação na sanguessuga em comparação com alguns preparativos modelo é a capacidade de modificar o genoma de genes seletivos em tipos específicos de células. Em embriões tsua limitação foi abordada pela injeção de DNA ou dsRNA para regular a expressão do gene 28. A técnica arma gene foi recentemente usada para expressar conexina invertebrados (innexin) proteínas em neurônios sanguessuga. Expressão de uma innexin de Hirudo verbana (Hve-inx6) é suficiente para a formação de junções de hiato ectópica no sanguessuga medicinal 29. A sanguessuga medicinal ou H. verbena como se fosse 30 é certo para avançar nossa compreensão da fisiologia e evolução de sinapses elétricas ao longo dos próximos anos.

A preparação sanguessuga é útil para investigar a função de identificação (sensorial, motora e inter-neurónios no sistema nervoso central do animal (CNS). A propriedade útil dos neurónios sanguessuga é que a forma dos seus potenciais de acção e propriedades biofísicas são característicos para uma determinado tipo de célula (isto é, P, N, T, Rz). neurónios Além disso pode ser removido a partir do animal e cultivadas num meio adequado, no qual as células de manter as suas características eléctricas durante o tempo até 45 dias 1,2. A vantagem do gânglio sanguessuga para aprender a fazer gravações eletrofisiológicas é que as células são caracteristicamente e confiável dispostos no gânglio em um padrão que permite a identificação de tipos de células distintas do gânglio para gânglio e de animal para animal. A localização única e morfologia de neurônios em sanguessuga gânglios foram anotados por Retzius já em 1891 3. Conhecimento do the a identidade e função de um neurónio é vantajoso para investigar circuitos neurais e para fazer experiências com um determinado tipo de célula. Devido à relativamente grande somata dos neurónios dentro de um gânglio serem visíveis com um microscópio de dissecação, e a somata pode ser empalado selectivamente com microeléctrodos para gravar as suas propriedades eléctricas. Corantes e moléculas grandes podem ser injectados em células individuais e as propriedades do canal estudados por sujeição do emplastro. Correntes iónicas que dão origem às várias formas dos potenciais de acção característicos em diferentes neurónios foram identificadas 4-7. A partir de investigações no padrão de inervação e ramificações dos neurônios individuais dentro do CNS, as conexões sinápticas foram reproduzidas em cultura com os neurônios identificados 2,8. Os estudos em gânglios da sanguessuga forneceram uma visão sobre o desenvolvimento de circuitos funcionais que pode ser medido com a electrofisiologia, bem como com cordãe estudos do comportamento animal. A sanguessuga CNS também serviu como uma preparação valiosa para a investigação de mecanismos envolvidos com a reparação e regeneração neuronal em todo o animal e na cultura 4-6,9-12. Em cérebros de mamíferos é uma tarefa difícil para explicar o comportamento em termos de propriedades e conexões de neurônios identificados individuais. Em princípio, pode-se esperar que o estudo de sistemas menos complexos, como a sanguessuga pode ajudar a definir mecanismos básicos usados ​​em animais superiores. As ligações que são usados ​​que sustentam um padrão de mergulho e 13,14 ritmicidade do coração 15, têm sido bem caracterizadas na sanguessuga. A capacidade de alguns neurônios sanguessuga para formar tanto a comunicação elétrica e química é intrigante. Algumas conexões são bidirecionais, enquanto outras são unidirecionais quimicamente, mas bidirecional eletricamente 7. Compreender as conexões sinápticas dentro do animal, bem como a recriação da mesma type de conexões em um prato de cultura são ferramentas poderosas para investigar synaptogenesis 16-18, bem como perfis farmacológico das sinapses 19. As técnicas de gravação e de estimulação intracelulares descritos aqui fornecer uma base para ensaios farmacológicos e pesquisas em neuroethology e desenvolvimento. Além disso, o cordão nervoso ventral segmentar pode ser dissecada com um pedaço de pele inervados. Com a capacidade de manter um pedaço de pele e os neurônios vivos, campos receptivos sensoriais podem ser sondado por gravar os sinais elétricos do corpo celular (ou seja, soma) de neurônios sensoriais no respectivo gânglio abdominal no SNC. Deste modo, pode-se avaliar a sensibilidade das terminações sensoriais, aplicando diferentes graus de força sobre a pele e mapear campos receptivos: leve toque, pressão, e nocivos (doloroso) estímulos 20,21. Uma vantagem desta sanguessuga preparação gânglio-da pele é que um can desenhar anatomicamente o mapa do campo receptivo e traçar os processos neuronais para o neurônio identificado uma vez que as respostas elétricas estão sendo gravados. As três experiências sanguessuga descritos abaixo podem ser completado várias vezes com um único espécime, o que torna este um módulo de ensino de baixo custo para laboratórios acadêmicos.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/ácido maleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água sanitária&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para clorar fio de prata</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Para ajustar o pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Para ajustar o pH</td></tr><tr><td>Colagenase/Dispase</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 com L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose-Monoidrato</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina&amp;nbsp;</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>Ácido livre, cristalino</td></tr><tr><td>Concanavalina A Tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobrometo</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>PM 15-30.000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Placa de micropoços, 60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>Fundo plano, 10 por embalagem</td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortimento</td><td></td></tr><tr><td>Prova de eletrodo intracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfinetes para insetos</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de fibra óptica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequeno espelho ajustável</td><td></td><td></td><td>Para direcionar o feixe de luz em direção à preparação.</td></tr><tr><td>Eletrodos de vidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Caixa com 200, eletrodos de sucção</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;Pode ser fixado na base ou em uma haste metálica</td></tr><tr><td>Suporte elevado para preparação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata (10/1.000 polegada)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial CA/CC</td><td>A-M Systems</td><td>Modelo 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Estágio de cabeçote</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Vem com amplificador CA/CC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabos elétricos</td><td>qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de vidro&amp;nbsp;</td><td>confeccionar você mesmo</td><td></td><td>Para manipular nervos</td></tr><tr><td>Cabos e conectores</td><td>qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas com bolas&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Caixa com 500</td></tr><tr><td>Béqueres</td><td>qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera ou massa de modelar</td><td>qualquer empresa ou lojas locais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 ou S88</td><td></td></tr><tr><td>Ponta plástica para eletrodo de sucção</td><td>loja de material de construção local (marca Watt&amp;rsquo;s)</td><td>&amp;frac14; polegada de diâmetro externo x 0,170 polegada de diâmetro interno</td><td>Cortar em pequenos pedaços. Puxar sobre uma chama e cortar a ponta para o tamanho correto.</td></tr></tbody></table>

intracelular de gravação, sensorial campo mapping, e cultivando neurônios identificados nos sanguessuga, hirudo medicinalis</i

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

A sanguessuga de água doce, Hirudo medicinalis, é um organismo modelo versátil, que tem sido usado para tratar de questões científicas nos campos da neurofisiologia, neuroethology e biologia do desenvolvimento. O objetivo deste relatório é o de consolidar técnicas experimentais do sistema de sanguessuga em um único artigo que será de utilidade para os fisiologistas, com experiência em outras preparações do sistema nervoso, ou para estudantes de biologia, com pouca ou nenhuma experiência em eletrofisiologia. Demonstramos como dissecar a sanguessuga para gravação intracelular de circuitos neurais identificados no gânglio. A seguir, mostram como as células individuais de função conhecida pode ser removido a partir do gânglio a ser cultivadas numa placa de Petri, e como gravar a partir desses neurónios em cultura. Então nós demonstrar como preparar um pedaço de pele inervada a ser utilizado para o mapeamento de campos sensoriais ou motoras. Estas preparações sanguessuga ainda são amplamente utilizados para tratar as propriedades elétricas básicas de networ neuralks, comportamento, sinaptogênese e desenvolvimento. Eles também são um módulo de formação adequada para a neurociência ou fisiologia laboratórios de ensino.

Gravações intracelulares de neurónios sensoriais do gânglio da sanguessuga são caracterizados pelos seus traços de tempo de tensão distintas mostradas na Figura 4C. O potencial de repouso da membrana celular em células ganglionares da sanguessuga saudáveis ​​é -45 para -60 mV. Se potenciais são menores (menos negativo) deve-se mudar o eletrodo de vidro, ou se o potencial ainda é baixo, passar para outro segmento do cordão nervoso. Potenciais de ação espontânea, com pequena amplitude pode indicar que o eletrodo está em um neurônio motor. Se isto acontece na parede do corpo de um gânglio-injecção de corrente pode ser utilizado para determinar se o neurónio inerva qualquer dos músculos ainda ligado à pele. O neurônio motor anel montador (AE) está no lado ventral do gânglio (Figura 4B) e vai fazer com que a anéis (sulcos ou segmentos) a subir pela ativação do músculo eretor anel. A injeção de corrente para as células sensoriais deve evocar potencial de açãos com as formas de onda característicos mostrados na Figura 4C. Se as formas de onda de um aspecto diferente que poderia ser devido a uma ponte desequilibrado ou compensação de capacitância offset. Deve-se consultar o manual que acompanha a unidade de aquisição de sinais para obter detalhes sobre como equilibrar a ponte dentro de uma célula. Observe os artefatos de estímulo no início e no fim dos pulsos de corrente na Figura 4C. Esta é a forma como os artefatos olhar quando a ponte está equilibrada. As culturas primárias de neurônios do gânglio sanguessuga formar sinapses elétricas e químicas no prato. Inicialmente as propriedades elétricas das células em cultura não são exatamente o mesmo que eles estão em vivo. No entanto, depois de alguns dias, os impulsos são quase indistinguíveis dos registrados no gânglio. Isto é demonstrado na Figura 6C com um par de células de Rz. Depois de 7 horas na cultura da amplitude de potenciais sinápticos foi de 1-2 mV. Após 56 h em cultura sypotenciais naptic eram maiores do que 10 mV (traços principais da Figura 6C). A forma do potencial de acção também muda depois 56hr em cultura. Sob as condições descritas estas células são viáveis ​​durante vários dias. Comunicação intercelular pode ser demonstrado por estimular as raízes nervosas ou conectivos e gravar a partir de neurônios do gânglio. Estimulando estes nervos gera potenciais sinápticos robustos e potenciais de ação em células ganglionares diferentes. Traços na Figura 8B foram registados a partir de uma célula de um gânglio Retzius em que tinha sido retirado do animal e fixado num prato. O traço preto foi evocado por um estímulo subliminar aplicado com um eletrodo extracelular para o conjuntivo. Aumentando a tensão estímulo causado a célula para disparar um potencial de ação (traço vermelho). Corantes ou peroxidase de raiz forte fluorescente pode ser injetado essas células para estudar a sua morfologia. Lúcifer amarelo foi injectada uma Rzneurônio passando uma corrente através do eletrodo negativo. Uma alternativa consiste em injectar o corante utilizando sopros de pressão de ar. Figura 9A mostra o corante pouco depois da injecção começou. Trinta minutos mais tarde, o corante já tinha migrado para as raízes nervosas (Figura 9B). O tipo de corante depende da aplicação, por exemplo, corantes pequenos pesos moleculares que podem passar através de junções de hiato são utilizados para identificar as sinapses eléctricas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Dissecção sanguessuga ventral (A) O animal é completamente preso lado ventral para cima em um prato forrado de elastômero preenchido com sanguessuga salina (B) A incisão pouco profunda que abrange o anterior:. Eixo posterior é feita imediatamente lateral à linha média, para evitar danificar o nervo cabo. O seio sangue negro (que contains o cordão nervoso ventral) pode ser facilmente visto. Note-se a um gânglio exposto que é branca em comparação com a bainha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Dissecção do seio preto. O vaso sanguíneo (seta) deve ser cuidadosamente cortada de um lado para expor o cordão nervoso ventral (seta dupla). Deixe segmentos da embarcação de sangue intactas ao redor das raízes segmentares para uso como um identificador para manipular o cordão nervoso ventral durante a transferência entre dissecção e pratos de gravação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3"fo: content-width = &quot;3 pol&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figura 3. Secção isolada do cordão nervoso ventral. Fixando o cordão nervoso ventral por os fragmentos de vaso sanguíneo restantes sobre as raízes segmentares e nas extremidades dos conectivos segmentares expõe os gânglios para registos electrofisiolicos. A tenso alongamento dos gânglios permite ver os corpos celulares identificáveis ​​e permitirá uma mais fácil penetração da bainha glial com um eletrodo de vidro afiada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Anatomia celular do gânglio sanguessuga. (A) O ideal é que as células Retzius (R) e de outros organismos de células grandes (P-imprensaure, T-touch, N-nociceptiva, instalador AE-anel) será claramente visível se o microscópio e condensador de luz estão configurados corretamente. (B) Representação esquemática de células no gânglio. Ligeiras diferenças na localização das somas ocorrerá em cada gânglio devido à forma como o gânglio é esticado e preso tenso. Potenciais (C) Ação gravadas da soma desses neurônios têm formas de onda característicos. Estes picos foram evocados pela injeção de corrente positiva para dentro da célula (pulso quadrado sobrepondo os traços em tempo de tensão). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Desheathing gânglio para remover corpos celulares individuais. (A) A bainha glialdevem ser cuidadosamente cortadas em todo o gânglio para evitar danificar as células de interesse. A linha vermelha indica um corte para evitar bater a soma dos neurônios Rz. Abrindo a bainha dá as enzimas digestivas acessar a matriz de tecido conjuntivo. (B) os corpos celulares saudáveis ​​saltados para fora do gânglio após a bainha glial foi aberto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Cultivar neurónios do gânglio da sanguessuga. (A) As células são aspirados a partir do gânglio usando uma micropipeta e transferido para uma placa contendo meio de cultura. (B) Colocar várias células próximas uma da outra irá aumentar a taxa de sinaptogénese entre neurónios identificáveis. Aqui o stumps de dois neurônios formaram uma sinapse. (C) Os neurônios em cultura exposição ligeiramente diferentes propriedades elétricas. Os melhores traços mostram potenciais sinápticos evocados por estimulação da célula adjacente 7 horas e 56 horas após as células foram plaqueadas. Os traços de fundo foram evocados pela injeção de corrente diretamente em uma das celas Rz. Observe o aumento da amplitude do potencial sináptico e mudar no potencial de ação de forma de onda após 56 horas em cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. A sanguessuga gânglio-corpo preparação de parede para o mapeamento de campos receptivos. (A) Uma abordagem é para remover uma seção inteira da parede do corpo, juntamente com 1-3 gânglios. Aqui as raízes de um lado têm bcorte een eo gânglio foi preso para o lado. (B) Um preso fora gânglio em maior ampliação. (C) Outra abordagem é a criação de uma pequena janela na parede do corpo e gravar a partir dos gânglios intacta, enquanto o mapeamento de um campo receptivo . (DG) Cada um dos neurônios sensoriais exibe uma resposta característica a um estímulo mecânico. (D) Um leve toque evoca atividade nas células T, mas não em P ou N células. (E) A resposta das células T desliga em resposta à forte estímulos, abrindo caminho para a ativação da célula P. À medida que o estímulo se fortalece as células N torna-se ativado (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. Evoked actividade no gânglio da sanguessuga. estimulação extracelular dos conectivos pode ser utilizado para dirigir a transmissão sináptica no cordão nervoso. (A) Isto é feito ligando um eléctrodo de sucção de um dos conectivos e aplicando uma pequena tensão. O eletrodo de vidro cortante (seta) pode ser visto espetando uma célula Retzius no gânglio. (B) os traços de tensão em tempo mostrando o artefato de estímulo seguido por um potencial sináptico (preto) e um potencial de ação (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar imagem</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figura 9. Injetando corante nos neurônios sanguessuga. (A) Lucifer amarela pode ser injetada no soma passando corrente through o microeletrodos gravação. A lâmpada de mercúrio e conjunto de filtros FITC pode então ser usado para visualizar a fluorescência. (B) Dye tem difundido na Rz axônios cerca de 30 minutos após a injeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Este artigo descreve três preparações do sistema nervoso usando sanguessugas: gravação intracelular de neurônios no gânglio ventral, cultivando neurônios do gânglio ventral, e gravar a partir de um pedaço de pele inervados para mapear campos sensoriais.

Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

O objetivo geral deste procedimento é aprender como preparar gânglios de sanguessuga para gravação intracelular a partir de neurônios individuais, como preparar um fragmento de pele para mapear um campo receptivo sensorial e como cultivar neurônios de sanguessuga. Isso é realizado primeiramente utilizando gelo para anestesiar a sanguessuga e fixá-la em posição dorsal para cima. O próximo passo é dissecar cerca de três gânglios separados e esticá-los para gravação.O passo final consiste em impalar os neurônios individuais e registrar os potenciais de ação. De modo geral, o comportamento da rede neural pode ser caracterizado mediante caracterizações fisiológicas dos diversos tipos celulares em conjunto com experimentações. A principal vantagem do uso de leches em comparação com outras preparações invertebradas simples, como lesmas S ou crustáceos, é que os gânglios possuem pouco mais de 400 neurônios facilmente acessíveis, e esses neurônios podem permanecer ativos em cultura por vários dias.A demonstração visual deste método é fundamental, pois o preparo da pele e a retirada de neurônios individuais são difíceis de aprender. Pode-se facilmente danificar um gânglio que invade uma porção de pele ou danificar os neurônios durante o cultivo. Uma pergunta que você naturalmente poderia fazer ao ouvir que vai ver um filme e ler um texto sobre o sistema nervoso da sanguessuga é: por que diabos alguém trabalharia com um cérebro de invertebrado quando o cérebro humano é muito mais interessante?E se você fosse trabalhar com um invertebrado, por que escolheria a sanguessuga, um animal horrível, sugador de sangue, que secreta muco e é nojento? Bem, existem várias boas razões para isso. A primeira é que a sanguessuga possui um sistema nervoso extremamente simples comparado ao nosso.E nele você pode estudar células nervosas individuais, observar como elas estão conectadas e ver como essas conexões resultam no comportamento de um animal de maneira que seria impossível em um animal mais complexo. Outra razão é que a Leech, introduzida pela primeira vez na neurociência em 1960 por Stephen Koffler, oferece oportunidades para estudar problemas básicos que, na verdade, são relevantes para o funcionamento do nosso próprio cérebro. E existem muitos exemplos aos quais eu poderia me referir.Uma delas é que a maioria das células no cérebro, nossos cérebros, não são células nervosas, mas as chamadas células gliais, células satélites, que foram inicialmente estudadas na sanguessuga, e depois, uma vez conhecido seu funcionamento nesse animal, foi possível verificar se eram semelhantes em nossos próprios cérebros, o que de fato são, e isso foi importante também para diversas aplicações clínicas. Mas a razão principal para trabalhar com este animal, como você verá no filme, é que ele possui um sistema nervoso belíssimo. O sistema nervoso consiste em uma cadeia de gânglios, grupos de células nervosas, em número limitado.Você pode observar todas as células e registrá-las individualmente. Você pode descobrir como elas estão conectadas, de forma semelhante ao estudo de um mapa do metrô de Paris. E é essa beleza que torna a preparação tão fascinante para se trabalhar, aliada à possibilidade de descobrir certos princípios fundamentais antes de iniciar a dissecação.Certifique-se de configurar primeiro o software de gravação e o eletrodo de gravação. Prepare-se para dissecar uma sanguessuga em um recipiente grande revestido com elastômero de silicone, preenchido com solução de Ringer, utilizando pinos. Estique o animal com a face ventral voltada para cima usando um bisturi número 10 ou número 11.Realize uma incisão longitudinal com cortes muito rasos na linha média ventral. Evite cortar o seio sanguíneo ventral até que o animal esteja completamente aberto e o seio sanguíneo esteja esticado sem dobras. Agora, o CNV está contido dentro dele.Use uma tesoura fina de íris para fazer um pequeno corte no seio sanguíneo, inserindo uma lâmina da tesoura sob o seio e levantando ligeiramente a lâmina para separar o seio do tecido nervoso. Em seguida, corte o seio ao longo do comprimento da corda nervosa ventral, evitando as raízes nervosas, os nervos segmentares ou as conexões entre os gânglios. Depois, remova parte da corda nervosa ventral cortando as raízes distalmente ao ponto onde o vaso sanguíneo se une às raízes.Agora transfira o gânglio para um recipiente limpo contendo salina e fixe-o pelos ramos nervosos e conexões. Utilize este preparo para obter gravações intracelulares dos corpos celulares dos neurônios sensoriais. Fixe os gânglios com o lado ventral voltado para cima em um recipiente limpo contendo L 15.Com o soro fetal bovino (FCS), as raízes devem ser levemente esticadas com uma tesoura fina. Faça um pequeno corte na cápsula glial em uma das extremidades, insira uma lâmina da tesoura sob a cápsula e mova-a através da cápsula. Em seguida, adicione 100 microlitros de colagenase ao prato e coloque o prato em um agitador durante 15 minutos; posteriormente, examine as células movimentando o meio de cultura ao redor dos corpos celulares expostos.Retorne as células ao agitador por mais 15 minutos ou mais, até que possam ser extraídas do gânglio utilizando sucção mínima de uma pipeta com ponta polida a fogo e diâmetro interno de cerca de 50 mícrons, ligeiramente maior que o diâmetro do corpo celular. Para liberar a MEC das células, adicione algumas gotas do meio L 15 com FCS às células e incube-as por algumas horas até 24 horas à temperatura ambiente. Quando estiverem prontas, plaque as células lado a lado em uma placa de poços revestida com substrato.Com meio L 15. Não use SBF. Após 24 horas, estarão prontas para eletrofisiologia e permanecerão viáveis por vários dias.Inicialmente, as propriedades elétricas não são exatamente iguais às de uma preparação in vivo. No entanto, após alguns dias, os impulsos são quase indistinguíveis. Fixe a sanguessuga com o lado dorsal voltado para baixo em um recipiente revestido com elastômero, conforme descrito anteriormente.Em seguida, fixe a pele em um dos lados com as raízes no outro lado do gânglio seccionado. Alternativamente, faça uma janela na face ventral da sanguessuga sobre um gânglio, mantendo todas as raízes ligadas à parede corporal intactas. Após obter uma gravação intracelular estável em uma das células sensoriais, use uma pequena haste aquecida e polida para tocar levemente a pele no mesmo segmento com as células t e p.O toque suave na pele gerará uma resposta elétrica. Com as células terminais, será necessária maior pressão do bastão, e na maioria dos casos, uma célula terminal só responderá se a pele for pinçada com pinças. Portanto, para minimizar possíveis danos teciduais, registre primeiro as células N para determinar se os neurônios examinados possuem processos em determinadas localizações.Os conectivos entre os gânglios podem ser cortados e os campos receptivos podem ser reexaminados quanto a quaisquer perdas. Os registros intracelulares de neurônios sensoriais no gânglio da sanguessuga são caracterizados por seus traçados temporais distintos. Seu potencial de repouso varia entre menos 45 e 60 milivolts.Se a medição for mais baixa, um novo eletrodo de vidro ou uma nova preparação deve ser utilizada. Potenciais de ação espontâneos com pequena amplitude indicam que a célula pode ser um neurônio motor. Na preparação da parede corporal do gânglio, uma injeção de corrente pode ser usada para determinar se o neurônio inerva quaisquer músculos ainda ligados.Por exemplo, o neurônio motor do anel eretor no lado ventral do gânglio fará com que o olho do anel se levante. Se após a injeção de corrente for observada uma forma de onda não característica, isso pode ser devido a uma ponte desequilibrada ou à compensação de capacitância de deslocamento. Quando a ponte está equilibrada, artefatos de estímulo são observados no início e no final dos pulsos de corrente após sete horas.Em cultura primária, as medições foram realizadas em um par de células retiais. A amplitude dos potenciais sinápticos era de cerca de um a dois milivolts. Após 56 horas em cultura, os potenciais sinápticos eram maiores que 10 milivolts.A forma do potencial de ação também mudou. Na mesma preparação, as raízes nervosas ou os conectivos foram estimulados. O traçado preto foi evocado por um estímulo sublimiar aplicado com um eletrodo extracelular ao conectivo.O traço vermelho mostra como o aumento na voltagem do estímulo provocou a despolarização da célula e o potencial de ação. Uma injeção de amarelo de Lucifer em uma célula retiniana foi realizada mediante a passagem de uma corrente negativa através do eletrodo. Pouco tempo após a injeção, o corante permaneceu localizado no soma. Trinta minutos depois, o corante já havia difundido nas raízes nervosas após seu desenvolvimento. Esta técnica ajuda os pesquisadores na área de neurobiologia a explorar os mecanismos subjacentes às formas dos potenciais de ação e a investigar mais a fundo a circuitaria neural. Além disso, a promover a compreensão da regeneração e reparação em neurônios identificáveis.Este vídeo demonstra uma série de técnicas experimentais. O uso do leach pode ser aplicado à sinaptogênese, neuromodulação ou aspectos fundamentais da neurofisiologia.

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