Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

O objetivo geral deste procedimento é imprimir um molde reverso para criar hidrogéis de dois componentes padronizados para cultura de células 3D. Isso é feito imprimindo primeiro um molde reverso a partir de um polímero termo-reversível, que é um líquido a quatro graus Celsius, mas um gel macio à temperatura ambiente. Este molde reverso pode ser iludido posteriormente.

O segundo passo é preencher o molde reverso com um biopolímero de sua escolha. Aqui usamos aros. O biopolímero pode ser reticulado por reticulação enzimática, UV ou de temperatura.

Em seguida, o molde reverso é aludido por submergir o molde em água fria. Após esta etapa, o molde AROS resultante está pronto para processamento posterior. A etapa final é preencher os vazios com um segundo biopolímero, que pode conter células e pode ser reticulado por meio de enzimas, luz ultravioleta ou temperatura.

Em última análise, estabelecemos um método reprodutível para criar andaimes de cultura de células D espacialmente organizados. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando um colega sugeriu que poderíamos aproveitar as propriedades termorresponsivas do Oxr usando-o como um molde de sacrifício. Demonstrando o procedimento estará Misha Muah, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para começar, adicione 60 mililitros de solução gelada de PBS em uma garrafa de vidro e mexa vigorosamente usando uma agitação magnética. Em seguida, pese 24,5 gramas de Paul ER e adicione-o em pequenas quantidades ao PBS frio. Espere até que o Paul Oxr se dissolva parcialmente no PBS antes de adicionar mais.

Continue a mexer a solução até que todo o Paul Oxr se dissolva. Em seguida, adicione PBS gelado adicional até atingir um volume final de 100 mililitros, produzindo uma concentração final de 24,5% de peso por volume. Em seguida, mexa a mistura até que esteja bem misturada.

Pare de mexer a solução e deixe-a descansar a quatro graus Celsius durante a noite até que as bolhas e a espuma na solução desapareçam. As bolhas que ficam presas dentro do gel são transferidas para o cartucho da impressora e levam a defeitos nos moldes de sacrifício impressos. Estéril Filtre a solução diretamente no cartucho de impressão usando um filtro de pré-resfriamento para remover quaisquer partículas indesejadas que possam entupir a agulha.

Conservar o cartucho a quatro graus Celsius até 30 minutos antes da experiência. Prepare a válvula solenóide e a agulha para impressão, colocando-as em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro cheios de água ultrapura e distribuindo-os por 30 minutos. Em seguida, enxágue as válvulas limpas com etanol e seque-as com uma pistola de nitrogênio.

Em seguida, instale a válvula solenóide limpa e a agulha na impressora. Além disso, instale um cartucho de impressão limpo vazio para testar o sistema. Aplique pressão de três bar ao sistema e sopre quaisquer líquidos residuais da válvula e agulha instaladas com ar comprimido.

Para pequenos diâmetros de agulha. Instale um filtro na saída do ar comprimido para evitar a entrada de pequenas partículas que possam entupir a agulha. Em seguida, desligue a pressão.

Quando a pressão cair para zero, instale o cartucho pré-carregado com o poly oxr. O cartucho deve ser retirado da geladeira aproximadamente 30 minutos antes de montar o cartucho para que o poli oxr ainda líquido possa atingir a temperatura ambiente e gelificar antes de imprimir. Verifique se o poli oxr está gelatinoso virando o cartucho.

Em seguida, aplique três bar de pressão no sistema e dispense Paul Emer até atingir a ponta da agulha e ser extrudado em um fio contínuo. Usando o software bio CAD, desenhe uma única linha com o mesmo comprimento da estrutura que você pretende imprimir no menu de configurações do software da impressora. Defina a válvula solenóide para uma alta frequência de 50 hertz na seção de parâmetros e ajuste manualmente a configuração de alta pressão para três bar.

Em seguida, coloque um microscópio de vidro, deslize a impressora e prenda-a no lugar ligando o aspirador. Em seguida, imprima uma camada de uma única linha com uma velocidade de estágio de 300 milímetros por minuto. Obtenha a largura da linha desejada reduzindo a pressão manualmente e as configurações de frequência no software para cada nova linha, certifique-se de que a linha permaneça contínua.

Se a linha traçada for quebrada, o limite inferior foi atingido. Uma vez que uma linha contínua com a largura desejada seja alcançada, determine a velocidade ideal do estágio e a espessura da camada verificando se há defeitos nas construções impressas. Para ajustar a espessura da camada, a pressão e a frequência também podem precisar ser ligeiramente reajustadas.

Para testar a configuração da espessura da camada, imprima várias camadas umas sobre as outras e observe se a agulha está na posição correta acima da camada anterior. Ajuste a espessura da camada para que cada camada seja impressa diretamente sobre a anterior. Para otimizar a velocidade do estágio, comece diminuindo a velocidade do estágio de 300 milímetros por minuto passo a passo para que as camadas extrudadas comecem e terminem nas mesmas posições que as anteriores.

Se o palco se mover muito rápido, um padrão semelhante a uma onda aparecerá na parte superior da camada. Para imprimir estruturas de pilares, desenhe um único ponto em vez de uma linha no software CAD. Em seguida, ajuste a pressão e a frequência para regular a espessura da camada e o diâmetro do pilar e o tempo de passo da cabeça de impressão para maximizar a velocidade de impressão.

Depois de otimizados, salve os parâmetros para uso posterior. Primeiro, imprima a estrutura interna, como esta matriz de pilares, em uma lâmina de microscópio de vidro e deixe secar. A secagem durante a noite reduz o tamanho e a espessura das estruturas e proporciona melhor aderência entre a estrutura e o substrato.

No dia seguinte, desenhe uma estrutura que consiste em uma parede externa ao redor das estruturas que você pretende iludir e preencher. A parede de polímero deve ser impressa a pelo menos 3,5 milímetros de distância das estruturas internas devido às dimensões da agulha. Em seguida, prepare uma mistura de 1%aros em água deionizada, aquecendo-a no micro-ondas depois de totalmente dissolvida.

Resfrie a solução agrícola entre 35 e 45 graus Celsius. Em seguida, preencha o molde de sacrifício com a solução agrícola usando uma pipeta. Isso deve ser feito lentamente para evitar a destruição da estrutura dentro da parede.

Depois de preenchido, coloque o molde a quatro graus Celsius para solidificar o gel. Após cerca de 10 minutos, retire o gel da geladeira e coloque-o em um banho de gelo por 10 minutos para eluir a estrutura do polímero. Em seguida, remova a estrutura com cuidado e remova a água residual enxugando-a com um lenço de papel.

Pressione a estrutura cuidadosamente em uma nova lâmina de microscópio de vidro para criar uma boa vedação, evitando o vazamento do terceiro hidrogel. Em seguida, prepare uma solução a 1% de metacrilato de alginato em cloreto de sódio 0,15 molar. Vortex a solução para dissolver o metacrilato de alginato.

Em seguida, adicione 2,5% de volume ao volume. Alexa, 4 88 fibrinogênio conjugado e 0,05% de peso por volume. Fosfato de fenil de lítio 2 4 6 trimetilbenzoíla para obter um terceiro hidrogel que pode ser facilmente visualizado por fluorescência.

Coloque esta solução em uma seringa de 0,3 mililitro equipada com uma agulha de calibre 30. Em seguida, use a seringa para preencher os vazios deixados pelo polímero iludido. Certifique-se de preencher completamente cada coluna ejetando o polímero à medida que a agulha é retirada de cada coluna.

Finalmente, fotopolimerize o polímero injetado com uma lâmpada UV de alta intensidade por cinco minutos e, em seguida, fotografe a construção usando uma epifluorescência ou microscópio confocal. Aqui é mostrada uma reconstrução 3D Zack de uma construção semelhante à que acabou de ser fabricada, o alginato marcado com fluorescência usado para preencher. As formas dos pilares aparecem como colunas verdes e a parte externa da construção é transparente.

As técnicas mostradas neste vídeo são amplamente adaptáveis a muitos arranjos 3D diferentes, como os círculos concêntricos mostrados aqui. A resolução depende do diâmetro da agulha. A agulha de 150 mícrons de diâmetro usada para este projeto pode produzir fios entre 120 e 200 mícrons de diâmetro.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das etapas envolvidas na impressão do oxr. Demonstramos o uso de oxr como um molde de sacrifício para criar hidrogéis padrão, mas o oxr também pode ser estabilizado por UV se uma versão relacionada à fabricação do polímero for usada.