Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células microgliais primárias do córtex neonatal do camundongo ou da medula espinhal de um camundongo adulto. Isso é feito removendo primeiro o cérebro de um filhote de camundongo pós-natal ou de um filhote de camundongo no primeiro dia ou dois ou de uma medula espinhal adulta. Em seguida, os córtices são colhidos do tecido neonatal ou o tecido da medula espinhal é digerido.

As células corticais e do tecido espinhal são então cultivadas até o uso experimental. Em última análise, as células microgliais neonatais e adultas colhidas podem ser analisadas por microscopia imunofluorescente. A principal vantagem do nosso protocolo de cultura microglial neonatal sobre os métodos existentes, como a agitação das células microgliais para placas corticais mistas, é que as células retornam prontamente ao estado de repouso e podem fornecer uma imagem mais precisa do comportamento das células microgliais in vivo.

A principal vantagem da cultura na microglia da medula espinhal adulta é que as células podem ser citadas no contexto de patologias que afetam principalmente o sistema nervoso central adulto Antes da dissecção. Placas de cultura de tecidos Preco de 10 centímetros com cinco microgramas por mililitro de poli de licina ou PDL diluído em água de autoclave Após três horas a 37 graus Celsius, aspire o PDL e lave as placas uma vez com água de autoclave pouco antes de iniciar a dissecção da microglia neonatal. Seque as placas sob a luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos por 20 minutos.

Em seguida, use um lenço Kim, embebido em etanol a 70% para desinfetar as cabeças dos filhotes anestesiados do dia pós-natal zero a dois depois de remover as cabeças com uma tesoura. Coloque quatro cabeças por placa em placas de Petri de 10 centímetros contendo solução salina tamponada com fios gelados. Usando uma pinça curva, ancore as cabeças através das órbitas oculares e, em seguida, use uma micro pinça reta para remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio.

Em seguida, começando perto do cerebelo, remova os ossos cranianos, tomando cuidado para não perfurar ou danificar os córtices. Use uma pequena espátula para remover os cérebros que agrupam os órgãos em uma placa de Petri fresca contendo HBSS gelado. Agora começando no lado ventral do cérebro.

Segure o cerebelo com a micropinça para ancorar o tecido e, em seguida, faça duas pequenas incisões em cada lado do mesencéfalo sem cortar todo o tecido. Provoque suavemente o mesencéfalo e o cerebelo inteiros dos córtices, que devem formar uma forma côncava. Em seguida, separe os córtices isolados e oriente um único córtex com o lado medial para cima para posterior dissecção.

Tanto no protocolo neonatal quanto no adulto, uma das etapas mais complexas é a remoção adequada das meninges. Também é difícil remover o hipocampo. No protocolo neonatal, usamos solução salina tamponada com fios gelados para endurecer os tecidos e também usamos um procedimento de dissecção lento e metódico para minimizar a trituração.

Remova o hipocampo em forma de meia-lua localizado em frente ao bulbo olfatório, que aparece como um pequeno nódulo na extremidade pontiaguda do córtex. Em seguida, vire o córtex para ver o lado dorsal. Em seguida, usando o bulbo olfatório como ponto de partida, remova todas as meninges e o próprio bulbo olfatório do córtex.

Em seguida, puxe os córtices dissecados para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 14 mililitros de HBSS gelado no gelo. Agora aspire o HBSS do Cordis e use uma ponta de pipeta P 1000 para tritar os córtices algumas vezes. Adicione quatro mililitros de tripsina EDTA aos tecidos e, em seguida, incube os tecidos a 37 graus Celsius.

Após 15 minutos, pare a reação enzimática com quatro mililitros de meio microglial completo e, em seguida, gire as suspensões celulares por cinco minutos a 1000 vezes G e temperatura ambiente. Após uma segunda lavagem com quatro mililitros de meio resus completo, suspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio microglial completo e, em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de malha de 40 mícrons. Finalmente, coloque as células em uma densidade de oito córtices por 10 mililitros de meio microglial em uma das placas de cultura de tecidos de 10 centímetros revestidas com PD L e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após 10 dias de cultura de células, desprenda a micróglia adicionando 400 microlitros de lidocaína 60 milimolar em HBSS à placa de cultura de tecidos e incube a placa em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Em seguida, colete as células ressuspensas. Enxágue a placa uma vez com HBSS e colete a lavagem para recuperar qualquer micróglia restante.

Em seguida, adicione EDTA 0,5 molar à suspensão celular até uma concentração final de cinco milimolares e, em seguida, diminua o resus das células. Suspenda o palato em um mililitro de DMEM com 1% de FBS e determine o número de células viáveis por exclusão de azul triano. Em seguida, cultive as células na densidade experimental desejada.

Por exemplo, para análise por placa de microscopia imunofluorescente as células em 2,5 vezes 10 elevado a quarto células por lamínula de 18 milímetros para coleta de tecido de micróglia adulta. Comece usando etanol a 70% para limpar a coluna de um camundongo adulto sacrificado. Em seguida, use uma tesoura para cortar a pele acima da medula espinhal e corte a medula da região T um a T 12.

Corte o músculo restante das laterais da medula espinhal e, em seguida, segure suavemente a medula espinhal com as pontas dos dedos de uma mão. Use uma microtesoura para cortar lentamente as vértebras sem perfurar o cordão. Em seguida, use um par de microfórceps para extrair lentamente a medula espinhal, mergulhe a medula em uma placa de Petri contendo HBSS gelada e, em seguida, remova todas as meninges visíveis ao microscópio.

Agora corte a medula espinhal em segmentos transversais, não mais grossos do que dois milímetros para facilitar a digestão eficiente e, em seguida, transfira os fragmentos para um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de HBSS resfriado com gelo no gelo. Para digerir os fragmentos de tecido da medula espinhal, comece aspirando a HBS do tecido da medula espinhal, tomando cuidado para não perturbar o tecido. Em seguida, incube o tecido em um mililitro de tripsina a 37 graus Celsius.

Após 30 minutos, remova a tripsina e adicione três mililitros de meio primário de microglia contendo soro para interromper a digestão enzimática. Depois de pipetar para cima e para baixo algumas vezes para desalojar o tecido, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons. Em seguida, misture uma alíquota da suspensão celular com um volume igual de DPI e conte as células em um microscópio fluorescente para determinar o número total de células viáveis.

Finalmente, coloque as células dissociadas do tecido da medula espinhal em placas revestidas com PD L na densidade experimental apropriada. Execute uma troca completa de mídia quatro horas após o revestimento para remover o excesso de detritos celulares. Neste primeiro conjunto de imagens, as células microgliais em repouso e ativadas são mostradas 24 horas após o plaqueamento da microglia exibem, morfologia ramificada ou enferrujada A exposição ao lipopolissacarídeo bacteriano do reagente de escorva resulta em alterações na morfologia microglial para uma forma mais amebóide à medida que as células são ativadas.

O globo ocular que colore um marcador específico para macrófagos e proteínas da superfície celular microglial e que aparece em verde, facilita a visualização das células. A imagem de campo claro mostra as populações gerais de células e o DPI em azul destaca os núcleos e indica a pureza da cultura. Nesta imagem representativa de células isoladas de uma medula espinhal de camundongo adulto, foram obtidas aproximadamente sete vezes 10 até a quinta células viáveis.

As configurações do microscópio de campo claro e fluorescência foram combinadas para visualizar células positivas para DAPI, bem como a grade do hemocitômetro para uma contagem precisa de células. Microglia totalmente aderida a placas de cultura revestidas com PD L após aproximadamente dois dias. Em cultura aqui, a microglia isolada da medula espinhal de camundongos Mac green, que expressam GFP sob o controle da micróglia e do promotor de macrófagos CSF one R, são mostradas na imagem de campo claro.

Microglia conforme indicado pelas setas azuis e astrócitos conforme indicado pelas setas vermelhas, podem ser observados Uma vez dominados. Esta técnica pode ser concluída em cerca de uma hora Após este procedimento. Outros métodos, como aculturamento, microglia com outros tipos de células, podem ser realizados para estudar o efeito que a microglia tem em outras células.

Após este procedimento, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a delicada dissecção necessária para cultivar células neocorticais e adultas da medula espinhal e empregar essas células em aplicações a jusante.