Name: A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a separar tipos celulares espermatogênicos usando o método STA-PUT de sedimentação por velocidade. Esta técnica permite isolar populações de células testiculares de camundongos com alta pureza.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concede GM055360 para SLB e U54HD068157 a RGM. JMB foi apoiado pelo Training Grant T32 Genética da Universidade da Pensilvânia (GM008216).

O protocolo STA-PUT envolve três etapas: 1) Configure do aparelho e reagentes, 2) Preparação de suspensão de células de testículos inteiros, e 3) carregamento celular, sedimentação, e recolha de fracções. Quando realizada por uma equipe de dois pesquisadores, o protocolo leva oito horas, em média. 1. Configurar o aparelho STA-PUT (Figura 1) *** Aparelho STA-PUT deve ser colocado numa grande frigorífico a 4 ° C ou de um quarto frio que também pode acomodar um colector de fracções, se que o método de recolha é o preferido. <ol><li> Na noite anterior (ou pelo menos algumas horas antes), você executar o método, lavar todo o equipamento (especialmente o de vidro e tubos) e esterilizar com álcool 70%. Vamos equipamento seca completamente, antes de montar o aparelho como ilustrado na Figura 1. </li><li> Fixe os dois cilindros de 2 L (Figuras 1B e C) ea câmara de carga da célula ( <strong&gt; Figura 1A) para a plataforma superior e conectar todos com dois pequenos pedaços de tubos com grampos de tubo. Prenda todos os tubos fechados. Selar o bico sobre o L cilindro mais à direita 2. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação na câmara de carregamento de células (Figura 1A) e uma barra de agitação maior no 2 L cilindro mais à esquerda (Figura 1B) que conterá a BSA a 2%. </li><li> Coloque a câmara de sedimentação de 2 L sobre a plataforma (Figura 1D). Coloque o deflector de metal (Figura 1F) directamente por cima da abertura na parte inferior da câmara de sedimentação (Figura 1D). Isto é crítico, como o deflector impede o vórtice do líquido e perturbação do gradiente de células durante a recolha de fracções. Coloque a tampa na parte superior da câmara de sedimentação. </li><li> Após a aplicação de uma quantidade muito pequena de massa lubrificante de vácuo para a junta de vidro esmerilado de a torneira de três vias (Figura 1G), fixar a torneira de passagem para a parte inferior do sicâmara dimentation, ligando as juntas de vidro da torneira e da câmara de sedimentação. </li><li> Ligue a câmara da célula de carga (Figura 1A) para a saída para a direita da torneira com um tubo. Fechar a torneira. </li><li> Conecte o tubo de fracionamento celular para a tomada esquerda do torneira. O tubo de fraccionamento compreende uma peça de tubo com uma pipeta de Pasteur de vidro, ligado à extremidade aberta. Um pedaço da tubagem de furo menor é ligado à extremidade mais estreita da pipeta de vidro. A pipeta estreita restringe o fluxo da suspensão de células durante a fracção de recolha. Fixe este pequeno tubo na parte inferior. </li><li> Preparar 2 L de Krebs (1x) tamponar o dia da experiência (Tabela 1). Em seguida, preparar 550 ml de 2% de BSA em 1x de Krebs, 550 ml de 4% de BSA em 1x de Krebs, e 50 ml de BSA a 0,5% em 1x de Krebs. Filtra-se e arrefecer as soluções a 4 ° C. </li><li> Verter a solução de BSA a 4% no cilindro direito L 2 (Figura 1C) e BSA a 2%solução em 2 L da esquerda do cilindro (Figura 1B). Certifique-se que não há grandes bolhas na tubulação que conecta esses cilindros. </li><li> Despeje tampão Krebs para a câmara de carga da pilha e encher o tubo que liga esta câmara com a câmara de sedimentação, certificando-se de que não há bolhas grandes, pois estes podem perturbar o gradiente. Apertando ou sacudindo o tubo suavemente ajuda a remover as bolhas. Certifique-se de todo o tampão de Krebs é no tubo e não na câmara de célula. </li><li> Permitir que uma pequena quantidade de solução tampão de Krebs a fluir para dentro da câmara de decantação e depois drenar quase todo o tampão para os tubos de fraccionamento de células, a fim de encher o tubo e remover quaisquer bolhas de grandes dimensões. </li><li> Coloque o coletor de fração diretamente sob a câmara de sedimentação. Certifique-se que todos os tubos de fração estão no lugar e coberta com filme plástico para evitar a contaminação. </li></ol> 2. Isolando espermatogênicas células de testículos inteiros <ol&gt; <li> Dissecar testículos de ca 12 ratos adultos (de preferência pelo menos oito semanas de idade) e coloque em tampão Krebs à temperatura ambiente para lavar qualquer material contaminante. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com as diretrizes da Universidade do Comitê Institucional Animal Care e Use Pensilvânia. </li><li> Adicionar 45 mg de colagenase a 50 ml de tampão Krebs em um tubo cônico de direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Decapsulate os testículos em um prato separado, contendo 8 ml de tampão Krebs, descartando a túnica albugínea e liberando os túbulos seminíferos. A túnica albugínea é a fina membrana que envolve os túbulos seminíferos. Os túbulos deve prontamente separar da túnica albugínea. Para fazer isso, fazer uma incisão na túnica albugínea, segure esta membrana com um pair de uma pinça, e empurrar os túbulos de fora e para longe da membrana com o outro par de fórceps. </li><li> Adicionar 4 ml de tampão de Krebs contendo os túbulos de cada tubo cónico contendo 25 ml de solução de colagenase e incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. No final, os túbulos deve ter uma aparência de &quot;spaghetti-like&quot;. </li><li> Permitir que os túbulos que se contentar com ~ 5 min para o fundo do tubo. Derrama-se o sobrenadante e lavar 2x em 25 ml de tampão de Krebs (à temperatura ambiente), permitindo que os túbulos para assentar no fundo do tubo de cada vez. Deixar ~ 5 ml de tampão de Krebs, em cada tubo. </li><li> Enquanto a lavagem, adicionar 30 mg de tripsina a 50 ml de tampão Krebs em um tubo falcon direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Adicionar 25 ml de solução de tripsina a cada um dos dois tubos contendo os túbulos. Adiciona-se 3 ug de DNAse (1 μg/10ml) a cada tubo para prevenir a células de aglomeração. Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. </li><li> Usar uma pipeta de orifício largo para agitar a solução contendo os túbulos, pipetando-os dentro e para fora aproximadamente 10x. A solução deve começar a olhar mais como uma suspensão única célula. </li><li> Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min adicionais. Use uma pipeta de diâmetro grande para dispersar os túbulos em uma suspensão única célula, pipetando-los dentro e fora aproximadamente 25x. Se você ainda ver um monte de túbulos ou aglomerados de células, dispersar mais com a pipeta e / ou adicionar outro DNAse 3 mg a cada tubo (concentração inicial duplo). </li><li> Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um (uma para cada tubo de 30 ml de suspensão de células). Combina-se as suspensões de células e contagem do número total de células (deve estar entre 7-8 x 10 8 células). *** NÃO carregar mais de 800 milhões de células para o gradiente. </li><li> Com base na contagem das células obtidas na etapa 2.10, sedimentar a aproprvolume de iate de células filtradas em 450 rcf durante 5 min e lava-se com 30 ml de tampão de Krebs. Repetir. Normalmente *** 22 testículos vai render mais de 800 milhões de células, mas não coloque mais do que esse número de células. </li><li> Ressuspender cuidadosamente as células em 25 ml de BSA a 0,5%, contendo entre 2,5 e 5 ug de DNAse (dependendo do grau de agregação celular), sem criar bolhas. Certifique-se que as células não se aglutinar. Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um. As células estão agora prontos para carregar. Misture bem antes do carregamento, invertendo o tubo várias vezes. </li></ol> 3. Célula de carga e Sedimentação <ol><li> Certifique-se de que a torneira é fechada, mas na posição em que irá permitir que o líquido flua da câmara da célula (Figura 1A) para a câmara de sedimentação (Figura 1D). </li><li> Vire ambas as placas barra de agitação para um nível baixo (cerca de 70 rpm) para permitir que as barras de agitação para se mover continuamente, mas lentamente. </li><li> Despeje a suspensão de células para dentro da câmara de células (Figura 1A) e abrir a torneira de modo a que as células fluem lentamente para dentro da câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min (Figura 1D). Fechar a torneira. Taxa de fluxo pode ser determinada por marcação intervalos de volume na câmara de sedimentação. </li><li> Despeje 5 ml de solução de BSA a 0,5% para a câmara de célula e drene para a câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min. Fechar a torneira. Este passo irá lavar as células para fora da câmara de célula. Repita 4x. </li><li> Prepare o gradiente: Abra os grampos entre a câmara da célula (Figura 1A) e os dois cilindros de 2 L (Figura 1B e C), e começar a escoar o líquido para dentro da câmara de decantação a uma taxa de 40 ml / min (Figura 1D) imediatamente. Ajustar o fluxo de modo que leva cerca de 20-30 minutos para carregar o gradiente de BSA para a câmara de sedimentação. Uma camada fina, sem perturbações de células encontra-se na parte superior doGradiente BSA deve ser visível. Uma vez que a maior parte da BSA é carregado, feche a torneira e coloque-o na posição que irá permitir que o líquido escorra da câmara de sedimentação no tubo de fracionamento. </li><li> Desligue as placas de agitação. </li><li> Permitir que as células sedimentar durante uma hora e 45 minutos. Não perturbem o aparelho durante este tempo. Qualquer agitação mecânica poderia perturbar o gradiente. </li></ol> 4. O fraccionamento e Análise de fracções *** Como você execute os seguintes passos, tenha cuidado para não perturbar o gradiente. Se o gradiente de BSA é perturbado, o procedimento não vai funcionar! <ol><li> Uma vez que as células tiverem sedimentado, escorrer lentamente 50 ml da câmara de sedimentação em um tubo cônico de 50 ml e reserve. Esta fracção contém geralmente aglomerados indesejados das células e detritos. </li><li> Fixe o tubo fração para o coletor de fração. *** Também é possível coletar as frações à mão, se um colle fraçãoctor não está disponível. </li><li> Colete frações: Ajustar a taxa de fluxo com a torneira para que 10 ml (enchendo um tubo de coleta) é coletada a cada 45 seg. </li><li> Tapar os tubos de recolha de fracção e girar durante 5 minutos a 450 rcf a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender as células em líquido restante, e manter as células no gelo. </li><li> Uma vez que todas as frações são coletadas, microscopicamente analisar as frações para as populações de células diferentes. Diferentes tipos de células podem ser distinguidas com base no tamanho e morfologia celular nuclear 8,15. Figura 2 ilustra os resultados representativos &quot;&quot; para as três fracções reunidas que são enriquecidas para as células (uma) somáticas e meiose e espermatogónios, (b), e Espermátides arredondadas (c) alongando e condensação espermatídeos. <ul><li> Tipo A espermatogônias são 12 14μm ca. de diâmetro e têm núcleos redondos que são homogêneos em composição da cromatina. </li><li> Tipo B espermatogônias são 8-9μm ca. em diâmetro e têm round núcleos que mostram heterocromatina mais densa ao longo da periferia nuclear. </li><li> Espermatócitos Pré-leptotênicos são 7.5-8.2μm ca. de diâmetro, têm menos citoplasma de espermatogônias do tipo B, e têm núcleos que se assemelham às de Tipo B espermatogônias. </li><li> Espermatócitos primários leptotênicos são 8-10 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos pré-leptotênicos, mas parecem ter mais densa da cromatina na membrana nuclear. </li><li> Zigóteno espermatócitos primários são 10-12 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos primários leptotênicos. </li><li> Espermatócitos Paquíteno estão em qualquer lugar 12-18 mM ca. de diâmetro e são constituídos por uma borda fina de citoplasma em torno de um núcleo grande. Mais aglomerados de cromatina densa pode ser visto no núcleo. </li><li> Espermátides redondas são 10 m ca. em diâmetro e têm um núcleo redondo com um cromocentro densamente coloração no meio. </li><li> Residualcorpos são ~ 6,5 m de diâmetro, são redondos, e carecem de um núcleo. </li><li> Alongamento e condensação espermatídeos são semelhantes em tamanho a espermatídeos redondas, mas têm, de um núcleo em forma de foice única. </li></ul><ol><li> Comece com a fração de 15 e analisar cada cinco frações de até 85. Normalmente, as frações inferiores a 15 vai ser muito misturado e agrupado, e as frações superiores a 85 irá conter poucos ou nenhum células utilizáveis. </li><li> Para analisar uma fracção, tomar 5ul de líquido a partir do tubo de recolha de fracções (uma vez que as células foram ressuspensas após centrifugação) e adicionar a 5ul de 8% de formaldeído em tampão de Krebs. Permitir que as células fixas para descansar em temperatura ambiente por cinco minutos. </li><li> Adicionar 5 ul de 0,1% de Triton e DAPI (5 μ / ml de tampão de Krebs) para as células fixadas. Permitir que as células para descansar em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Coloque 10 ml da solução resultante sobre uma lâmina, cubra com uma lamínula, e analisar com um microscópio de fluorescência para determinar a pureza de cada fração. </li><li> Combine frações que são semelhantes em tamanho e morfologia nuclear (ver &quot;Os resultados representativos&quot;) para criar os seguintes populações de células: células diploides meiose e somáticos, espermátides redondas e condensação / alongando espermátides. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Animais utilizados neste protocolo são mantidos sob a orientação e aprovação da Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Pensilvânia (IACUC o protocolo n º 804284).

Aqueles que estudam a espermatogênese confiar em modelos animais para amostras de células de espermatogénese, como um sistema de cultura de células confiável ainda não existe para gerar todos os tipos celulares espermatogênicas 3. Embora as células espermatogênicas são facilmente coletadas de testículos inteiros, apenas uma população mista resulta. Isto coloca um problema para aqueles que desejam estudar subtipos específicos dessas células, como as células meióticas, espermátides redondas e espermátides conde...

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos 1. Resumidamente, células-tronco como espermatogônias que residem perto do epitélio da divisão dos túbulos seminíferos e se diferenciam em espermatócitos, que, em seguida, passam por divisões meióticas. Após a meiose é completa, as células haplóides resultantes, ou espermátides arredondadas, são submetidos a espermiogênese, um processo de diferenciação que envolve o derramamento de citoplasma e compactação do núcleo. Espermátides gradualmente desenvolver um flagelo e submetidos a alongamento e condensação do núcleo, produzindo alongamento e, em seguida, condensando espermatídeos, respectivamente. Os produtos finais são os espermatozóides, que são liberados no lúmen do túbulo seminífero e, finalmente, para o epidídimo, onde eles amadurecem mais. Como o processo de espermatogênese depende de condições hormonais e moleculares especiais emos testículos, um sistema in vitro de cultura de confiança para todo o processo de espermatogénese ainda não foi desenvolvido 2,3. Métodos de cultura têm sido desenvolvidos para a criação de &quot;células-como células germinativas primordiais&quot; e, &quot;espermátides-como a volta&quot; haplóides a partir de células-tronco, mas estes métodos ainda não são capazes de gerar um grande número dessas células e não conseguem produzir células espermatogênico mais tarde tipos 4,5. Felizmente, os tipos de células espermatogénicas diferem significativamente de tamanho, que permite a uma suspensão de uma única célula obtidos a partir de testículos inteiras sejam separadas com um gradiente de líquido. O método STA-PUT, demonstrado aqui, usa um gradiente linear BSA e sedimentação simples para separar células espermatogênicas com base no tamanho e massa 6-9. O método STA-PUT tem várias vantagens sobre os outros dois métodos mais amplamente utilizados para separar os tipos de células espermatogénicas: FACS e elutriação 10-13. O aparelho STA-PUT requer only vários pedaços de vidro especializada montado em uma sala fria ou geladeira grande. Assim, é menos dispendioso do que o uso de um separador de células ou um elutriator. O método STA-PUT produz quantidades elevadas de células, por tipo de célula e os testículos do que pode ser classificada por FACS num período de tempo comparável, embora a pureza de cada população de células não é tão elevada quanto as obtidas com FACS 11. Células de triagem utilizando esferas magnéticas (triagem magnético ativado celular, MACS), recentemente tem sido empregada com sucesso para o enriquecimento das espermatogônias a partir de uma população de células dos testículos mista, mas de momento inadequado para separar espermatócitos ou espermátides, devido à falta de conhecimento da superfície apropriada marcadores 14. Uma vantagem adicional do método de STA-PUT sobre FACS ou MACS é a capacidade para isolar células viáveis ​​adequados para a cultura subsequente, porque, em contraste com a maioria dos protocolos de FACS, que não requer qualquer ADN ou outros tipos de coloração. Para os estudos que requerem lrendimentos ARGE, de espermatogênicas tipos de células em ~ 90% de pureza, o STA-PUT é um método ideal.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate pode ser usado.</td></tr><tr><td>Soluções BSA a 0,5%, 2% e 4%</td><td>Dissolva 0,25 g, 11 g e 22 g (respectivamente) em volumes totais de 50 ml, 550 ml e 550 ml de 1x KREBS (respectivamente).</td><td>A ser feito dia do procedimento STA-PUT. Esterilize por filtro.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g de dextrose + 3,78 g de CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, levar a 2 L com autoclave/filtro ddH20</td><td>e conservar a 4 > C por vários meses.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolver 4,24 g de NaHCO3 em 100 ml de ddH20. Adicione 200 ml 10x KREBS. Levar a 2 L com ddH20.</td><td>A ser feito dia do procedimento STA-PUT. Esterilize por filtro.</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído (~37%)</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABELA 2: EQUIPAMENTO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catálogo</td><td>da Empresa</td><td>de Equipamentos #</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Aparelho STA-PUT completo</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (este procedimento usa a câmara de sedimentação padrão: Cat. Nº 56700-500)</td><td>Inclui todos os artigos de vidro e equipamentos para o aparelho. Vidraria alternativa está disponível para realizar STA-PUT com números de células menores.</td></tr><tr><td>10 &mu; m filtro de malha</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação de mouse</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de coleta de frações de fundo redondo de 14 ml com tampas</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precisa de aproximadamente 100 tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletor de frações</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Modelo: Frac-920, Código do produto: 18-1177-40</td><td>Alternativa pode ser usada.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, vidro de cobertura</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz / fluorescente</td><td>Preferência do pesquisador</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a separação de tipos de células espermatogênicas usando sta-put velocidade de sedimentação

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos. Atualmente, não existe um sistema de cultura de células confiável permitindo a diferenciação da espermatogênese in vitro, ea maioria dos estudos biológicos das células espermatogênicas requerem colheita de tecidos a partir de modelos animais, como ratos e ratinhos. Porque o testículo contém numerosos tipos de células - tanto não-espermatogênico (Leydig, Sertoli, mielóides e células epiteliais) e espermatogênicas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides redondas, condensando espermátides e espermatozóides) - estudos dos mecanismos biológicos envolvidos na espermatogênese requer o isolamento e o enriquecimento destes tipos de células diferentes. O método STA-PUT permite a separação de uma população heterogénea de células - neste caso, a partir de testículos - por meio de um gradiente linear de BSA. Tipos de células individuais sedimentar com velocidade de sedimentação de acordo com a diferente cetamanho ll, e fracções enriquecidas com diferentes tipos de células pode ser recolhido e utilizado em análises posteriores. Enquanto o método de STA-PUT não resulta em fracções de elevada pureza de tipos de células, por exemplo, como pode ser obtido com determinados métodos de classificação celular, que faz prever um rendimento muito maior do total de células em cada fracção (~ 1 x 10 8 células / tipo de célula espermatogênico de uma população inicial de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimento exige apenas vidraria especializada e pode ser realizada em qualquer sala fria ou geladeira grande, tornando-se um método ideal para laboratórios que têm acesso limitado aos equipamentos especializados como uma fluorescência ativada classificador de células (FACS) ou elutriator.

O resultado ideal do processo de STA-PUT é uma separação bastante perceptível de células dos testículos com base no tamanho de célula e a densidade. Enquanto as células isoladas a partir dos testículos são sedimentando através do gradiente de BSA, várias bandas distintas de células pode ser observada. Quaisquer aglomerados de células tendem a afundar-se para o fundo do gradiente e não contaminam as outras fracções. Um pouco mais acima do gradiente será o grande somáticas e células meióticas. Mais acima o gradiente ainda...

O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

O objetivo geral deste procedimento é separar os diferentes tipos de células encontrados nos testículos. Primeiro, colete uma população mista de células do camundongo. Carregue os testículos com as células e o gradiente de BSA no aparelho stay put.Agora, permita que as células sedimentem através do gradiente de BSA. Em seguida, colete as frações e combine-as com base na composição celular. Em última análise, a sedimentação por velocidade com o "stay put" é utilizada para separar diferentes tipos de células dos testículos com base nas diferenças de tamanho e densidade.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os fatos, é que é possível isolar grandes quantidades de diferentes tipos celulares com pureza relativamente alta utilizando apenas vidraria simples e a força da gravidade. Fixe os dois cilindros de dois litros e a câmara de carregamento de células na plataforma superior e conecte todos com dois pequenos pedaços de tubo com braçadeiras. Feche todas as tubulações com braçadeiras e vedar o bico do cilindro mais à direita, de dois litros.Coloque um pequeno bastão de agitação na câmara de carregamento da célula e um bastão de agitação maior no cilindro de dois litros mais à esquerda. Em seguida, posicione a câmara de sedimentação de dois litros sobre a plataforma. Posicione a chapa metálica diretamente sobre a abertura na parte inferior da câmara de sedimentação para evitar a formação de vórtices no líquido e a interrupção do gradiente celular durante a coleta das frações.Agora coloque a tampa na câmara de sedimentação. Aplique uma quantidade muito pequena de graxa de vácuo à junta esmerilhada da torneira de três vias. Em seguida, prenda a torneira na parte inferior da câmara de sedimentação, conectando as juntas esmerilhadas da torneira e da câmara de sedimentação.Em seguida, conecte a câmara de carregamento das células à saída direita da torneira de fechamento com um tubo. Feche a torneira de fechamento, depois conecte o tubo de fracionamento celular à saída esquerda da torneira de fechamento e prenda o pequeno tubo na extremidade inferior. Despeje a solução de BSA 2% no cilindro esquerdo de dois litros.Despeje a solução de BSA 4% no cilindro direito de dois litros. Certifique-se de que não haja bolhas grandes nos tubos que conectam esses cilindros. Despeje o tampão de Krebs na câmara de carregamento da célula e preencha os tubos que conectam esta câmara com a câmara de sedimentação.Verifique se não há bolhas grandes que possam perturbar o gradiente. Se necessário, comprima ou toque suavemente no tubo para remover as bolhas. Confirme que todo o crebs está no tubo e não na câmara celular.Deixe uma pequena quantidade de tampão de Krebs fluir para a câmara de sedimentação. Em seguida, drene quase todo o tampão para o tubo de fracionamento celular. Para preencher o tubo e remover quaisquer bolhas grandes, posicione o coletor de frações diretamente sob a câmara de sedimentação.Verifique se todos os tubos de fração estão no lugar e cubra com filme plástico para evitar contaminação. Desencapsule os testículos em uma placa separada contendo oito mililitros de Krebs. Faça uma incisão na membrana fina que envolve os túbulos seminíferos com um par de pinças.Segure a membrana agora com outro par de pin&ccedil;as. Empurre os t&uacute;bulos para fora e para longe da membrana. Transfira quatro mililitros de Krebs contendo os t&uacute;bulos para cada tubo c&ocirc;nico contendo 25 mililitros de solu&ccedil;&atilde;o de colagenase.Agite a 33 graus Celsius por 10 minutos até que os túbulos desenvolvam uma aparência semelhante à de espaguete. Em seguida, deixe os túbulos sedimentarem por cinco minutos até o fundo do tubo. Descarte o sobrenadante e lave duas vezes com 25 mililitros de Krebs à temperatura ambiente, permitindo que os túbulos sedimentem até o fundo do tubo a cada vez.Deixe aproximadamente cinco mililitros de Krebs em cada tubo. Após a incubação dos túbulos com tripsina, use uma pipeta de grande diâmetro para agitar a solução contendo os túbulos.Pipetar para dentro e para fora aproximadamente 10 vezes. A solução deve começar a parecer mais com uma suspensão de células isoladas. Agora, filtrar cada suspensão de células isoladas de 30 mililitros através de um filtro celular de malha de 100 mícrons.Após combinar as suspensões celulares, conte o número total de células. Certifique-se de que a torneira de fechamento esteja posicionada para direcionar o fluxo da câmara celular para a câmara de sedimentação. Ligue ambas as placas com agitadores magnéticos em uma configuração baixa.Em seguida, despeje a suspensão celular na câmara de células. Abra a torneira de fechamento para que as células fluam lentamente para a câmara de sedimentação a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Em seguida, feche a torneira de fechamento para lavar as células para fora da câmara de células.Despeje cinco mililitros de solução de BSA a 0,5% e drene para a câmara de sedimentação a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Feche a torneira de passagem e repita a lavagem com BSA mais quatro vezes. Agora, abra as pinças entre a câmara de células e os dois cilindros de dois litros para drenar imediatamente o líquido para a câmara de sedimentação a uma taxa de 40 mililitros por minuto; ajuste a taxa de fluxo para que leve aproximadamente de 20 a 30 minutos para carregar o gradiente de BSA na câmara de sedimentação.Observe a presença de uma fina camada de células não perturbada sobreposta ao gradiente de BSA. Quando a maior parte do BSA estiver carregada, feche a torneira de passagem e gire-a para a posição que permitirá o escoamento do líquido da câmara de sedimentação para o tubo de fracionamento. Desligue agora as placas de agitação e deixe as células sedimentarem por uma hora e 45 minutos.Após a sedimentação estar completa, conecte o tubo de fração ao coletor de frações. Ajuste a taxa de fluxo com a torneira de modo que 10 mililitros por tubo de coleta sejam coletados a cada 45 segundos. Após todas as frações serem coletadas, analise-as microscopicamente em busca de diferentes populações celulares.Diferentes tipos celulares podem ser distinguidos com base no tamanho celular e na morfologia nuclear para determinar a pureza de cada fração. Transfira 10 microlitros de células coradas com DPI para uma lâmina. Coloque uma lamínula e analise com um microscópio de fluorescência.Puxe as frações que são semelhantes em tamanho e morfologia nuclear para criar populações de células. Um preparo típico de aproximadamente 22 testículos. Com este procedimento "stay put", obtém-se aproximadamente 10 elevado à oitava potência de células.As frações de tipos celulares metagênicos podem ser analisadas rapidamente usando uma combinação de microscopia óptica e fluorescente. As células mióticas, espermátogonias e células diplóides somáticas são as maiores células encontradas nos testículos e conterão núcleos grandes que se coram de forma relativamente homogênea com dpi. Os espermátides redondos são células menores com núcleos pequenos e redondos, geralmente com um cromocentro intensamente corado. Os espermátides em condensação e alongamento são células pequenas que possuem núcleos em forma de foice.Uma vez que as frações celulares são combinadas, a pureza pode ser determinada adicionalmente por análise de western blot dos lisados celulares. Marcadores comuns de células mióticas são as proteínas do Complexo Sinaptonêmico Um. Marcadores comuns de espermátides em condensação são as proteínas de transição ou a protamina.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete horas, desde que executada corretamente após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da espermatogênese explorarem processos celulares em diferentes tipos celulares provenientes dos testículos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento das células de Sertoli dos túbulos seminíferos de camundongos, um componente dos testículos. A digestão enzimática e as lavagens repetidas promovem a liberação de células de Sertoli na solução, que podem ser cultivadas posteriormente para proliferação e crescimento.

Isolamento de células de Sertoli imunorreguladoras de túbulos seminíferos de camundongos

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Neste trabalho, pretendemos descrever o desempenho da técnica de centrifugação gradiente de densidade e sua aplicação na investigação de fisiologia de esperma.

Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Aqui, apresentamos um método para realizar a injeção redonda de espermátides (ROSI) em camundongos, uma técnica com aplicações clínicas promissoras e utilidade para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Aprenda a separar tipos celulares espermatogênicos usando o método STA-PUT de sedimentação por velocidade. Esta técnica permite isolar populações de células testiculares de camundongos com alta pureza.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

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