A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

O objetivo geral deste procedimento é separar os diferentes tipos de células encontradas nos testículos. Primeiro, colha uma população mista de células do camundongo. Os testículos carregam as células e o gradiente BSA no aparelho de permanência.

Agora permita que as células sedimentem através do gradiente BSA. Em seguida, colete as frações e combine-as com base na composição celular. Em última análise, a sedimentação de velocidade com a permanência é usada para separar diferentes tipos de células dos testículos com base nas diferenças de tamanho e densidade.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como fatos, é que se pode isolar grandes quantidades de diferentes tipos de células com pureza bastante alta usando vidraria simples e gravidade. Prenda os cilindros de dois litros e a câmara de carregamento da célula na plataforma superior e conecte todos com dois pequenos pedaços de tubulação com braçadeiras de tubo. Prenda todos os tubos fechados e sele o bico no cilindro de dois litros mais à direita.

Coloque uma pequena barra de agitação na câmara de carregamento da célula e uma barra de agitação maior no cilindro de dois litros mais à esquerda. Em seguida, coloque a câmara de sedimentação de dois litros na plataforma. Posicione o defletor de metal diretamente no topo da abertura na parte inferior da câmara de sedimentação para evitar o vórtice do líquido e a interrupção do gradiente celular durante a coleta de frações.

Agora coloque a tampa na câmara de sedimentação. Aplique uma quantidade muito pequena de graxa a vácuo na junta de vidro esmerilado da torneira de parada de três vias. Em seguida, prenda a torneira de parada no fundo da câmara de sedimentação, conectando as juntas de vidro fosco da torneira de parada e da câmara de sedimentação.

Em seguida, conecte a câmara de carregamento da célula à saída direita da torneira de parada com a tubulação. Feche a torneira de parada e, em seguida, conecte o tubo de fracionamento da célula à saída esquerda da torneira de parada e prenda o pequeno tubo na parte inferior. Despeje a solução 2% BSA no cilindro esquerdo de dois litros.

Despeje a solução 4% BSA no cilindro direito de dois litros. Certifique-se de que não haja bolhas grandes na tubulação que conecta esses cilindros. Despeje o tampão Krebs na câmara de carregamento da célula e encha a tubulação que conecta esta câmara à câmara de sedimentação.

Verifique se não há bolhas grandes que possam perturbar o gradiente. Se necessário, aperte ou sacuda o tubo suavemente para remover as bolhas. Confirme se todos os crebs estão no tubo e não na câmara da célula.

Deixe uma pequena quantidade de tampão Krebs fluir para a câmara de sedimentação. Em seguida, drene quase todo o tampão para o tubo de fracionamento de células. Para encher o tubo e remover quaisquer bolhas grandes, coloque o coletor de frações diretamente sob a câmara de sedimentação.

Verifique se todos os tubos fracionados estão no lugar e cubra com filme plástico para evitar contaminação. Desencapsule os testículos em uma placa separada contendo oito mililitros de Krebs. Faça uma incisão na membrana fina que envolve os túbulos seminíferos com um par de pinças.

Segure a membrana agora com outro par de pinças. Empurre os túbulos para fora e para longe da membrana. Transfira quatro mililitros de Krebs contendo os túbulos para cada tubo cônico contendo 25 mililitros de solução de colagenase.

Agite a 33 graus Celsius por 10 minutos até que os túbulos desenvolvam uma aparência de espaguete. Em seguida, deixe os túbulos assentarem por cinco minutos no fundo do tubo. Despeje o sobrenadante e lave duas vezes com 25 mililitros de Krebs em temperatura ambiente, permitindo que os túbulos se depositem no fundo do tubo a cada vez.

Deixe aproximadamente cinco mililitros de Krebs em cada tubo. Depois de incubar os túbulos com tripsina. Use uma pipeta de furo largo para agitar a solução contendo os túbulos.

Pipetagem para dentro e para fora aproximadamente 10 vezes. A solução deve começar a se parecer mais com uma suspensão de célula única. Agora filtre cada suspensão de célula única de 30 mililitros através de um filtro de célula de malha de 100 mícrons.

Depois de combinar as suspensões celulares, conte o número total de células. Certifique-se de que a torneira de parada esteja posicionada para direcionar o fluxo da câmara celular para a câmara de sedimentação. Gire as duas placas da barra de agitação para uma configuração baixa.

Em seguida, despeje a suspensão celular na câmara celular. Abra a torneira de parada para que as células fluam lentamente para a câmara de sedimentação a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Em seguida, feche a torneira de parada para lavar as células para fora da câmara celular.

Despeje cinco mililitros de solução de 0,5% BSA e drene para a câmara de sedimentação a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Feche a torneira e repita a lavagem BSA mais quatro vezes. Agora abra os grampos entre a câmara celular e os dois cilindros de dois litros para drenar imediatamente o líquido para a câmara de sedimentação a uma taxa de 40 mililitros por minuto, ajuste a taxa de fluxo para que demore aproximadamente 20 a 30 minutos para carregar o gradiente BSA na câmara de sedimentação.

Monitore uma camada fina e não perturbada de células no topo do gradiente BSA. Uma vez que a maior parte do BSA esteja carregada, feche a torneira de parada e gire-a para a posição que permitirá que o líquido escorra da câmara de sedimentação para o tubo de fracionamento. Agora desligue as placas de agitação e deixe as células sedimentarem por uma hora e 45 minutos.

Após a conclusão da sedimentação, conecte o tubo de fração ao coletor de frações. Ajuste a vazão com a torneira de parada para que 10 mililitros por tubo de coleta sejam coletados a cada 45 segundos. Uma vez que todas as frações são coletadas, analise microscopicamente as frações para diferentes populações de células.

Diferentes tipos de células podem ser distinguidos com base no tamanho da célula e na morfologia nuclear para determinar a pureza de cada fração. Transfira 10 microlitros de células coradas com DPI para uma lâmina. Coloque uma lamínula e analise com um microscópio de fluorescência.

Puxe as frações que são semelhantes em tamanho e morfologia nuclear para criar populações de células. Uma preparação típica de aproximadamente 22 testículos. Com este procedimento de permanência, obtém-se aproximadamente 10 elevado à oitava célula.

As frações do tipo celular metagênico Perper podem ser analisadas rapidamente usando uma combinação de microscopia de luz e fluorescente. Células mióticas, espermatogônias e diplóides somáticas são as maiores células encontradas nos testículos e conterão grandes núcleos que se coram de forma relativamente homogênea com dpi. As espermátides redondas são células menores com núcleos redondos menores, geralmente com um centro cromomagro de coloração brilhante condensando as espermátides alongadas são células pequenas que possuem núcleos em forma de foice.

Uma vez que as frações celulares são combinadas, a pureza pode ser determinada pela análise de sangue ocidental dos lisados celulares. Marcadores comuns de células mióticas são as proteínas do Complexo Synap Neal. Marcadores comuns de condensação de espermátides são proteínas de transição ou protamina.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas se for executada corretamente após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da espermatogênese explorarem processos celulares em diferentes tipos de células dos testículos.