Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

O objetivo geral deste procedimento é descobrir a rede pré-motora central de células distribuídas que colidem com um alvo periférico específico e, em seguida, confirmar as conexões específicas entre essas células no cérebro. Isso é feito primeiro retrógrado infectando os circuitos pré-motores com um vetor viral trans-sináptico que é entregue perifericamente através do músculo. A segunda etapa do procedimento é visualizar as células infectadas com microscopia fluorescente de luz.

O terceiro passo é confirmar conexões específicas no cérebro injetando traçadores monossinápticos direcionados a nós previamente identificados em um circuito pré-motor. Em última análise, os resultados podem mostrar como as células em uma rede pré-motora distribuída estão conectadas umas às outras por meio de uma combinação de rastreamento viral trans-sináptico e técnicas anatômicas neuro monossinápticas tradicionais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o rastreamento neuro sináptico monos tradicional, é que os nós de uma rede neuro distribuída podem ser identificados e as conexões específicas entre as células dessa rede podem ser resolvidas em um camundongo anestesiado.

Prepare o local da cirurgia aparando o cabelo e desinfetando a pele com pelo menos três esfoliações alternadas de Betadine e álcool 70%. Agora faça uma incisão na pele na área da garganta e revele o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar o músculo laríngeo cricotireóideo, é necessário primeiro remover a porção sobrejacente do músculo hióide de Sterno, selar todos os músculos seccionados com adesivo de tecido de ligação veterinária.

Em seguida, carregue o sistema de microseringa de enchimento nano de 10 microlitros com solução PR RV recém-descongelada. Limpe lentamente o espaço morto e verifique se a solução sai da ponta da microseringa. Descarte o fluido como resíduo de risco biológico e monte-o cuidadosamente no dispositivo estereotáxico.

Usando o dispositivo de microposicionamento, coloque cuidadosamente a ponta da agulha no músculo de interesse. Em seguida, preencha lentamente o músculo até que um leve inchaço seja visível. Agora mova a seringa para o próximo músculo de interesse, o cricoaritenóideo lateral, neste caso, e repita.

O procedimento de injeção apenas perfura cada músculo. Uma vez que a taxa de injeção irá variar dependendo do tamanho do músculo e do volume a ser injetado. Por exemplo, cinco injeções de 200 nanolitros a uma taxa de quatro nanolitros por segundo devem ser feitas com um minuto de intervalo no mesmo local para preencher o músculo cricotireóideo.

Depois de retrair a micro seringa, sele a ruptura na fáscia usando adesivo tecidual vet bond. Assim que todas as injeções terminarem, feche a ferida usando adesivo de tecido veterinário. Monitore o animal até que ele mostre o esterno reclinado.

Em seguida, forneça analgesia, comida, água e cuidados conforme exigido pelo seu animal institucional. Use diretrizes. O procedimento para analisar a expressão de EGFP e neurônios infectados por PRV é abordado em detalhes no protocolo de texto.

O processamento de tecidos é muito semelhante ao abordado posteriormente neste vídeo. Comece anestesiando um camundongo adulto protegendo seus olhos e fixando a posição de sua cabeça. Em seguida, prepare o local da cirurgia conforme descrito anteriormente com esfoliações alternadas de Betadine e álcool 70%.

Agora faça uma incisão no couro cabeludo e retraia o couro cabeludo sobre o cérebro. Região de interesse. Realize uma pequena craniotomia com a broca nas coordenadas estereotáxicas apropriadas.

Por exemplo, as coordenadas para o córtex motor conectado à laringe identificadas pelo rastreamento PRV em um camundongo adulto são 1,2 milímetros laterais e 0,2 milímetros rostral ao bgma. Em seguida, prepare uma solução a 7,5% de aminas dextranas biotiniladas em água estéril. Em seguida, carregue o sistema de nano jato de duas micropipetas com solução BDA suficiente para as injeções planejadas.

Limpe lentamente o espaço morto e verifique se a solução está saindo da ponta da micropipeta. Usando o dispositivo de microposicionamento, abaixe cuidadosamente a ponta da micropipeta na região do cérebro de interesse e injete lentamente a solução de BDA. Ajuste a taxa dependendo do tamanho da região a ser rotulada.

Por exemplo, 12 injeções de 4,6 nanolitros devem ser feitas em quatro locais diferentes. 0,2 milímetros de distância. Stro mimo para cobrir o córtex motor conectado à laringe em um camundongo adulto.

O volume final de injeção deve ser ajustado de acordo com o tamanho da região de interesse. Tendo em mente que o rótulo pode se difundir do núcleo de injeção através do tecido cerebral e ao longo dos processos dos neurônios marcados. Limpe e umeihe a craniotomia com solução salina estéril e feche a ferida no couro cabeludo usando adesivo tecidual vet bond.

Monitore o animal até que ele mostre o esterno reclinado. Em seguida, forneça analgesia, comida, água e cuidados conforme exigido pelo seu animal institucional. Use diretrizes.

Seis dias depois, a subunidade B da toxina da cólera pode ser injetada no músculo do animal. Então, em três dias, o animal deve ser sacrificado para análise. Corte seções a 40 mícrons em um criostato e salve seções flutuantes em PBS 0,1 molar, tempere as seções com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PBS por 30 minutos com agitação e protegidas da luz.

Lave as seções três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem. Em seguida, reaja por uma hora em solução A, b, C recém-preparada à temperatura ambiente. Agora lave as seções três vezes em tampão fosfato por 10 minutos por lavagem.

Em seguida, desenvolver as seções por oito minutos com agitação em tampão fosfato. pH 7,4 contendo DAB peróxido de hidrogênio e cloreto de níquel. O produto da reação DAB dentro das células deve aparecer preto.

Em seguida, bloqueie as seções agitando por 30 minutos em PBS contendo 0,3% entre 20 com soro de coelho normal do kit de elite de coloração vetorial. Em seguida, incube as seções bloqueadas em cabra anti CTB com agitação por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave as seções mais três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.

Aplicar o anticorpo secundário antigo coelho do kit VE e incubar as secções agitando durante uma hora à temperatura ambiente. Lave as secções três vezes em PBS durante cinco minutos por lavagem e depois reaja durante 30 minutos em solução A, b, C à temperatura ambiente. Lave as seções três vezes em tampão fosfato por 10 minutos e incube as seções por oito minutos.

Na solução de desenvolvimento, o produto da reação DAB dentro das células deve parecer marrom. Agora monte as seções em super geadas e lâminas nas lâminas, desidrate o tecido por meio de séries de álcool graduado, seguidas de duas lavagens de limpeza em xileno. Em seguida, cubra as lâminas com paramount e prossiga com a imagem.

A coloração para EGFP deve começar a mostrar sinal fraco nos neurônios motores primários 72 horas após a injeção de P RV 1 52, com a coloração se tornando robusta após 90 horas. Este núcleo ambíguo, que abriga os neurônios motores da laringe, é visto 94 horas após a injeção de P RV 1 52 em dois dos sete músculos laríngeos. Porque o vírus entrou no cérebro através de neurônios que inervam os músculos infectados.

Outros pools de neurônios motores ativos, como o núcleo do hipoglosso, não expressam EGFP após 90 horas. O EGFP pode ser visto em células de segunda ordem. Esses neurônios do tronco encefálico foram corados após a infecção primária no núcleo ambíguo.

A injeção foi unilateral e o padrão resultante de marcação no tronco encefálico mostra infecção do núcleo ipsilateral. Neurônios inter reticulares de núcleo ambíguo e solitário também foram infectados e coraram fortemente para EGFP. Esses neurônios inter conectam várias estruturas, incluindo os pools de neurônios motores atórios e o núcleo contralateral. Ambíguo.

No entanto, seus alvos eferentes permanecem sem rótulo porque o vírus só se espalha na direção retrógrada. O tempo de sobrevida com PRV é limitado, mas pode mostrar coloração de EGFP em células de terceira ordem e de ordem superior infectadas neurônios pré-motores no córtex motor expressos EGFP contralateral ao local periférico da injeção. Presumivelmente, apenas a população de células que compunham a representação cortical motora da musculatura laríngea estava infectada.

Axônios marcados com BDA no nível do núcleo ambíguo marcado por pontas de setas, fazem contato com os neurônios motores positivos CTB retrógrados marcados por injeções nos músculos laríngeos vistos em marrom os axônios formam varicosidades e bastões terminais putativos perto dos dendritos dos neurônios motores da laringe e perto do soma dos neurônios motores da laringe. Mais experimentos usando microscopia eletrônica ou eletrofisiologia são necessários para determinar se essas varicosidades representam sinápticas. Uma injeção bilateral de BDA colocada no córtex motor conectado à laringe é vista em preto porque o BDA não é direcionalmente específico, tanto as conexões aferentes quanto as eferentes podem ser rotuladas.

Por exemplo, tanto um campo de projeção de marcação anterógrada quanto corpos celulares marcados por retrógrados são vistos no tálamo. As células talâmicas são identificadas pela ponta da seta e a cápsula interna é rotulada para orientação. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da pseudo-raiva e DAB pode ser extremamente perigoso e precauções como esterilização.

Todos os materiais que estiveram em contato com PRV ou DAB usando solução de alvejante a 10%. Um descarte adequado de resíduos sólidos e líquidos de risco biológico de acordo com os regulamentos de sua instituição deve sempre ser feito durante a execução deste procedimento.