Name: Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Aprenda a mapear circuitos neurais pré-motores usando traçamento transsináptico com vírus pseudorrábico e técnicas clássicas de marcação. Este método permite identificar redes neurais distribuídas que regulam alvos periféricos.

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Agradecemos ao Dr. Toshio Terashima, da Universidade de Kobe, no Japão, para o ensino da técnica de cirurgia de laringe, e Dr. Lynn Enquist da Universidade de Princeton para o fornecimento de PRV-Bartha. A pesquisa foi financiado pelo NIH prêmio pioneiro DP1 OD000448 para Erich D. Jarvis e um prêmio NSF Graduate Research Fellowship para Gustavo Arriaga. Dados do adequadamente creditado trabalho anterior são usadas sob a PLoS ONE acesso aberto licença Creative Commons (CC-BY), em conformidade com as políticas editoriais da revista.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso da Universidade Duke. 1. Armazenando vírus da pseudo- <ol><li> Obtemos vírus vivo (PRV152) a partir do laboratório do Dr. Lynn Enquist na Universidade de Princeton com uma concentração de 1 x 10 9 pfu / m. O protocolo para gerar o vírus foi publicada 2. </li><li> Alíquota do vírus em 20 ul por tubo dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2 e armazenar a -80 ° C em condições de biossegurança adequadas. </li><li> Descongelar uma alíquota de PRV imediatamente antes da injecção. </li></ol> 2. Preparação cirúrgica para injecções no músculo <ol><li> Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja as córneas com uma pomada oftálmica. </li><li> Prepare tele sítio cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local cirúrgico com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). Certifique-se de usar campos estéreis para cobrir áreas cirúrgicas. Certifique-se a aderir às técnicas estéreis durante os procedimentos. </li><li> Faça uma incisão na pele e revelar o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar a musculatura laríngea cricothyroid é necessário primeiro remover a parte sobreposta do músculo esterno. </li><li> Selar qualquer músculos transeccionados com adesivo de tecido Vetbond. </li></ol> 3. Injecção de PRV em músculo <ol><li> Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução PRV recém-descongelado, coloque uma agulha de aço inoxidável 34 G, e montá-lo cuidadosamente no dispositivo estereotáxico. </li><li> Lentamente limpar o espaço morto e verifique se solução saia a ponta micro. Descarte fluido como resíduos bioharzard. </li><li> Usando um microp estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente a ponta da microsseringa no músculo de interesse e lentamente encher o músculo até um ligeiro inchaço é visível. A taxa de injecção variará dependendo do tamanho do músculo e o volume a ser injectado. Por exemplo, de cinco injecções de 200 nl (1 mL no total) a uma taxa de 4 nl / s deve ser feito para além de 1 min no mesmo local para preencher o músculo crico. Mova a seringa para o próximo músculo de interesse (cricoaritenóideo lateral, neste caso) e repita o procedimento de injeção. Apenas perfurar cada músculo uma vez. </li><li> Retrair o micro depois de cinco minutos. </li><li> Selar a ruptura na fáscia usando adesivo de tecido Vetbond. </li><li> Depois de todas as injecções foram concluídos, fechar a ferida utilizando adesivo de tecido Vetbond. Dependendo de suas diretrizes locais institional uso de animais, suturas ou clipes ferida pode ser usado. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por ynossas diretrizes de uso de animais institucionais. </li><li> Após o tempo de sobrevivência determinados experimentalmente (neste caso, 90 h para rotular 2a ordem neurónios corticais), sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M. </li><li> Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas. </li></ol> 4. detecção imunoquímica de eGFP <ol><li> Cortar secções de 40 um em um micrótomo deslizante e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. Cortes mais finos, por exemplo de 30 um, pode ser utilizado quando a coloração secções montadas. </li><li> Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz. </li><li> Bloquear antigénios não específicos nas secções durante 30 minutos em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro de cabra normal a partir do kit Vectastain Elite (VE kit). </li><li&gt; Incubar secções bloqueados durante 3,5 horas em coelho anti-EGFP (1: 1.000), à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida incubar durante 1 h em anticorpo secundário de cabra anti-coelho a partir do kit de VE, à TA. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC do kit de VE, à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) e 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada). </li><li> Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem. </li><li> Imagem as seções montadas em um microscópio. O produto da reacção DAB inside as células devem aparecer marrom. Imagens digitalizadas podem ser cor invertida para realçar processos finas. </li></ol> 5. Preparação cirúrgica para a injeção de Tracers em regiões do cérebro Descoberto por PRV Tracing <ol><li> Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja as córneas com uma pomada oftálmica. </li><li> Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico apropriado. </li><li> Prepare o local cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). </li><li> Faça uma incisão no couro cabeludo e retrair a pele sobre a região do cérebro de interesse. </li><li> Realize uma pequena craniotomia nas coordenadas estereotáxica adequadas. Por exemplo, as coordenadas para córtex motor laryngeally conectado identificado por PRV rastreamento em umn rato adulto são 1,2 milímetros lateral e 0,2 mm rostral para Bregma. </li></ol> 6. Injecção da biotinilados Dextran Aminas em Cérebro <ol><li> Prepare a 7,5% biotinilados aminas dextrano (BDA) por dissolução de 25 mg de BDA (MW 10.000) em 333 ul de solução salina estéril. </li><li> Carregar o sistema micropipeta Nanoject II com solução BDA suficiente para as injeções planejadas. </li><li> Lentamente limpar o espaço morto e verificar que a solução é sair da ponta da micropipeta. </li><li> Usando um dispositivo estereotáxico microposicionamento cuidadosamente abaixe a ponta da micropipeta para a região do cérebro de juros e injetar lentamente BDA. Ajustar a velocidade de injecção, dependendo do tamanho da região a ser marcado. Por exemplo, 12 injeções de 4,6 nl deve ser fez em quatro locais diferentes 0,2 milímetros distante (sentido rostro-caudal) para cobrir o córtex motor laryngeally conectado em ratos adultos. O volume final de injecção deve ser ajustada de acordo com o tamanho da região do cérebro de interesse, Tendo em mente que a etiqueta pode difundir a partir do núcleo de injecção por difusão através do tecido cerebral e ao longo dos processos de neurónios marcados. </li><li> Selar a craniotomia com cimento dental, e fechar o ferimento no couro cabeludo usando adesivo de tecido Vetbond. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais. </li></ol> 7. Injecção da toxina da cólera Subunidade b no músculo <ol><li> Prepare 1% Toxina da Cólera subunidade b (CTB) por dissolução de 1 mg de CTB em 100 ul de solução salina estéril. </li><li> Seis dias após a injecção BDA no cérebro, realizar a preparação cirúrgica, como acima descrito para injecções PRV no músculo. </li><li> Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução CTb, anexar uma agulha de aço inoxidável 34 G, e cuidadosamente montá-lo no dispositivo estereotáxico. </li><li> Execute as microinjeções no músculo (s) de interesse como anteriormente descrito para PRV. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais. </li><li> Três dias após a injecção de CTB, sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M. </li><li> Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas. </li></ol> 8. Detecção de BDA e CTb nas mesmas seções <ol><li> Cortar secções de 40 um em um micrótomo e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. </li><li> Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC à TA. </li&gt; <li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina), 0,015% de H 2 O 2, e 0,05% de cloreto de níquel. O produto da reacção DAB no interior das células deve aparecer preto. </li><li> Secções de blocos de 30 min em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro normal de coelho a partir do kit Vectastain Elite. </li><li> Incubar secções bloqueados durante 2 horas em cabra anti-CTB (1: 10.000), à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, depois incubar durante 1 h em anticorpo secundário de coelho anti-cabra a partir do kit de VE, à TA. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem durante 30 min em solução ABC à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e para desenvolver até 8 min em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) e 0,015% de H 2 O 2. O produto da reacção de DAB no interior das células deve aparecer castanho. </li><li> Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada). </li><li> Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem. </li><li> Imagem as seções montadas em um microscópio. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Há uma série de questões que devem ser levadas em consideração ao planejar uma experiência usando PRV152 4,21. Mais importante ainda, vírus da pseudo é letal. Como mencionado anteriormente, grandes macacos, incluindo os seres humanos não são suscetíveis à infecção, mas cuidado apropriado deve ser exercido para proteger outros animais. Ratos adultos normalmente sobreviver cinco a sete dias após a inoculação com a estirpe atenuada PRV152. Portanto, PRV152 não é adequado para experiências que requerem tempos de ...

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido o mais amplamente utilizado no cérebro de roedor, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV), especialmente a estirpe atenuada de PRV-Bartha descrita pela primeira vez em 1961 12. A seguir, apresentamos um protocolo para a identificação da representação cortical motora dos músculos específicos ou grupos musculares utilizando uma estirpe do vírus da pseudo-raiva recombinantes (PRV152) que expressa o reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) gene repórter 2. O método descrito explora o comportamento de vírus neurotrópico, que produzem progénie infeccioso que sinapses cruzadas para infectar outros neurónios dentro de um circuito funcional 3,4,13. PRV152, que é isogênico com PRV-Bartha, única atravessa sinapses retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas longe do local de infecção 3,5 &lt;/ sup&gt;. Ao controlar com precisão o local periférico de infecção é possível limitar a entrada do vírus para o cérebro através de um subconjunto específico de neurónios motores. À medida que o vírus infecta sequencialmente cadeias de neurónios ligados, o padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida resolver a rede de neurónios que estão ligados às células inicialmente infectadas. Uma vantagem adicional da utilização de vírus, para um rastreio neural é a amplificação da proteína repórter (eGFP, neste caso) no interior das células infectadas. Esta amplificação de sinal fornece um nível de sensibilidade que permite a detecção de projeções ainda esparsas. Por exemplo, uma projecção a partir de córtex motor esparso vibrissa para os neurónios motores faciais que controlam os bigodes foi encontrada em ratos utilizando viralmente expressa a proteína fluorescente verde 14; Estudos anteriores não conseguiram encontrar essa projeção usando marcadores clássicos sem amplificação do gene repórter 11,15. Infelizmente, Muitos vectores virais de rastreio, tal como o utilizado no estudo citado, não atravessam sinapses, limitando assim o seu uso para o rastreamento de circuitos multi-sinápticos. Ao apresentar vantagens distintas para identificar a rede de células que participam em um circuito de motor, a natureza distribuída da transsináptica rastreamento com PRV-152 torna a interpretação de conexões específicas dentro do circuito difícil. Por isso, apresentamos um método simples para a validação de conexões específicas dentro de circuitos identificados usando PRV-152 by-dupla rotulagem utilizando aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB). O uso combinado do BDA e CTb é uma abordagem bem estabelecido para rastreamento de conexões entre conjuntos específicos de neurônios 6-8,11. Quando utilizados em conjunto, estes dois marcadores podem ser visualizados na mesma secção utilizando um DAB duas cores (3, 3&#39;-diaminobenzidina) Procedimento 16. Alto peso molecular BDA (BDA10kDa) foi selecionada para este protocolo porque yfields rotulagem detalhada dos processos neuronais 6,7,9. As vantagens adicionais da BDA10kDa incluem o seguinte: ele é preferencialmente transportados na direcção anterógrada 6-8; que podem ser entregues por iontoforese ou de injecção a pressão 6-8; que pode ser visualizada por uma simples HRP (ABC) Procedimento 17 biotinilada-avidina; e pode ser fotografada pela luz ou microscopia eletrônica 6,7,18. Detecção imunoquímica da CTB com peroxidase e DAB foi escolhido para a marcação retrógrada de neurónios motores, pois é eficaz em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 10,19. Nós recentemente utilizado esta abordagem para identificar a via motora vocal em camundongos e para revelar uma conexão escasso de córtex motor primário para os neurônios motores da laringe, que foi previamente assumidos estar ausente 20.

<table><tbody><tr><td>Nome do Reagente/Material</td><td>Número de</td><td>catálogo da</td> empresa <td>Comentários</td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção NanoFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G opção</td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Injetor de auto-nanolitro</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo deslizante</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano (Forano)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 contagem</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Aminas dextranas biotiniladas</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Vírus da pseudo-raiva</td><td>Laboratório do Dr. Lynn Enquist (Universidade de Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Título >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-Cólera Toxina B Subunidade (Cabra)</td><td>Lista Laboratórios Biológicos</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Cólera Toxina B Lista de Subunidades</td><td>Laboratórios Biológicos</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 comprimidos</td></tr><tr><td>de mg</td><td>Etanol Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 prova</td></tr><tr><td>de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluir a 4%</td></tr> <tr><td>de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr> <tr><td>Ketamine HCl & Xilazina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml e 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de níquel Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M; pH 7,4</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml dose</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Grau histológico</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (coelho); PK-6105 (cabra)</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica Optixcare</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsináptica rastreamento de alvos periféricos com vírus da pseudo-seguido por cólera toxina e biotinilado dextran aminas duplo labeling

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido mais amplamente utilizado no cérebro, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV) 1. O PRV não infectar grandes macacos, incluindo os seres humanos, por isso é mais comumente usado em estudos sobre pequenos mamíferos, especialmente roedores. O PRV152 pseudorabies estirpe expressa a proteína fluorescente (eGFP) gene repórter verde reforçada e só atravessa sinapses funcionais retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas de distância do local da infecção 2,3. Outras estirpes de PRV têm propriedades microbiológicas distintas e pode ser transportado em ambas as direcções (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo tratará exclusivamente com PRV152. Ao fornecer o vírus num sítio periférico, tais como o músculo, é possível limitar a entrada do vírus em tele cérebro através de um conjunto específico de neurônios. O padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida, resolve os neurónios que são ligados às células inicialmente infectadas. Como a natureza distribuída de rastreamento transsináptica com o vírus da pseudo-raiva faz interpretar conexões específicas dentro de uma rede identificada difícil, apresentamos um método sensível e confiável que emprega aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB) para confirmar as conexões entre as células identificadas usando PRV152. Detecção imunoquímica de BDA e CTB e com peroxidase de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) foi escolhida, porque eles são eficazes em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 6-11.

A coloração para eGFP deve começar mostrando sinal fraco em neurônios motores primários de aproximadamente 72 horas após a injecção de PRV152 em músculo. A replicação e transporte transsináptica de vírus são titer- e 4 dependente do tempo. Aproximadamente 90 horas após a injecção, coloração eGFP irá revelar sinal robusto em células infectadas 2ª ordem. Tempos mais longos de sobrevivência irá revelar 3 e células de ordem superior, mas o tempo de sobrevivência são limitadas por a letalidad...

O rastreamento transsináptico tornou-se uma ferramenta poderosa para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos por meio de circuitos multi-sinápticos. Aqui apresentamos um protocolo que explora o vírus da pseudo-raiva transsináptica para identificar e localizar um circuito cerebral funcional, seguido por técnicas clássicas de rastreamento de trato para validar conexões específicas no circuito entre grupos de neurônios identificados.

Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

O objetivo geral deste procedimento é descobrir a rede premotora central de células distribuídas que atuam sobre um alvo periférico específico e, em seguida, confirmar as conexões específicas entre essas células no cérebro. Isso é realizado primeiramente infectando retrogradamente os circuitos premotores com um vetor viral trans-sináptico que é administrado perifericamente através do músculo. O segundo passo do procedimento consiste em visualizar as células infectadas por meio de microscopia fluorescente de luz. O terceiro passo é confirmar conexões específicas no cérebro injetando traçadores monossinápticos direcionados a nós previamente identificados em um circuito pré-motor. Em última análise, os resultados podem mostrar como as células em uma rede pré-motora distribuída estão conectadas umas às outras por meio de uma combinação de rastreamento viral transsináptico e técnicas neuroanatômicas monossinápticas tradicionais. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o rastreamento neuroanatômico monossináptico tradicional, é que os nós de uma rede neural distribuída podem ser identificados e as conexões específicas entre células nessa rede podem ser resolvidas em um camundongo anestesiado.Prepare o local cirúrgico aparando os pelos e desinfetando a pele com pelo menos três fricções alternadas de Betadine e álcool a 70%. Agora, faça uma incisão na pele na região da garganta e exponha o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar o músculo laríngeo cricotireoideo, é necessário primeiro remover a porção sobrejacente do músculo esternotireoideo e selar quaisquer músculos seccionados com adesivo tecidual Vet Bond.Em seguida, carregue o sistema de microseringa nano fill de 10 microlitros com solução de PR RV recentemente descongelada. Remova lentamente o espaço morto e verifique se a solução sai da ponta da microseringa. Descarte o fluido como resíduo biológico perigoso e monte cuidadosamente no dispositivo estereotáxico.Usando o dispositivo de micro posicionamento, coloque cuidadosamente a ponta da agulha no músculo de interesse. Em seguida, encha lentamente o músculo até que um leve inchaço seja visível. Agora, mova a seringa para o próximo músculo de interesse, neste caso o cricoaritenóideo lateral, e repita o procedimento.O procedimento de injeção perfura apenas cada músculo. A taxa de injeção variará dependendo do tamanho do músculo e do volume a ser injetado. Por exemplo, cinco injeções de 200 nanolitros a uma taxa de quatro nanolitros por segundo devem ser feitas com intervalo de um minuto no mesmo local para preencher o músculo cricotireóideo.Após recolher a microseringa, feche a ruptura na fáscia utilizando adesivo tecidual vet bond. Quando todas as injeções forem concluídas, feche a ferida com adesivo tecidual vet bond. Monitore o animal até que apresente decúbito esternal.Em seguida, forneça analgesia, alimento, água e cuidados conforme exigido pelas diretrizes do comitê de ética em uso de animais da sua instituição. O procedimento para analisar a expressão de EGFP e neurônios infectados pelo PRV é abordado em detalhes no protocolo descrito no texto.O processamento do tecido é muito semelhante ao abordado posteriormente neste vídeo. Comece anestesiando um camundongo adulto, protegendo seus olhos e fixando a posição de sua cabeça. Em seguida, prepare o local cirúrgico conforme descrito anteriormente, com esfregaços alternados de Betadine e álcool 70%.Agora faça uma incisão no couro cabeludo e retrate o couro cabeludo sobre o cérebro. Região de interesse. Realize uma pequena craniotomia com a broca nas coordenadas estereotáxicas apropriadas.Por exemplo, as coordenadas para o córtex motor conectado à laringe identificadas pelo rastreamento com PRV em um camundongo adulto são 1,2 milímetros laterais e 0,2 milímetros rostrais em relação ao bgma. Em seguida, prepare uma solução de 7,5% de aminas de dextrana biotiniladas em água estéril. Então, carregue o sistema de micropipeta NanoJet dois com quantidade suficiente de solução de BDA para as injeções planejadas.Limpe lentamente o espaço morto e verifique se a solução está saindo da ponta da micropipeta. Usando o dispositivo de posicionamento micro, abaixe cuidadosamente a ponta da micropipeta na região cerebral de interesse e injete lentamente a solução de BDA. Ajuste a taxa conforme o tamanho da região a ser marcada.Por exemplo, devem ser feitas 12 injeções de 4,6 nanolitros em quatro locais diferentes, separados por 0,2 milímetros, para cobrir o córtex motor conectado à laringe em um camundongo adulto.O volume final de injeção deve ser ajustado de acordo com o tamanho da região de interesse. Tendo em mente que o marcador pode difundir a partir do núcleo da injeção através do tecido cerebral e ao longo dos processos dos neurônios marcados. Limpe e umedeça a craniotomia com solução salina estéril e feche a ferida no couro cabeludo usando adesivo tecidual vet bond.Monitore o animal até que apresente decúbito esternal. Em seguida, forneça analgesia, alimento, água e os cuidados exigidos pelas diretrizes do comitê de ética em uso de animais da sua instituição.Seis dias depois, a subunidade B da toxina do cólera pode ser injetada no músculo do animal. Em seguida, após três dias, o animal deve ser sacrificado para análise. Corte secções de 40 mícrons em um criostato e armazene as secções flutuantes em PBS 0,1 molar. Incube as secções com peróxido de hidrogênio 0,3% em PBS durante 30 minutos sob agitação e protegidas da luz.Lave as seções três vezes em PBS durante cinco minutos por lavagem. Em seguida, incube-as por uma hora em solução A b, C recém-preparada, à temperatura ambiente. Agora, lave as seções três vezes em tampão fosfato durante 10 minutos por lavagem.Em seguida, desenvolva as seções por oito minutos com agitação em tampão fosfato, pH 7,4, contendo peróxido de hidrogênio DAB e cloreto de níquel. O produto da reação DAB no interior das células deve aparecer preto.A seguir, bloquee as seções sob agitação por 30 minutos em PBS contendo 0,3% de tween 20 com soro normal de coelho do kit Vector Stain Elite. Em seguida, incube as seções bloqueadas com anticorpo caprino anti-CTB sob agitação por duas horas à temperatura ambiente. Então, lave as seções mais três vezes em PBS por cinco minutos cada lavagem.Adicione o anticorpo secundário antigo coelho do kit VE e incube os cortes sob agitação por uma hora à temperatura ambiente. Lave os cortes três vezes em PBS, cinco minutos por lavagem, e então reaja por 30 minutos em solução A, b, C recém-preparada à temperatura ambiente. Lave os cortes três vezes em tampão fosfato por 10 minutos e incube os cortes por oito minutos.Na solução de revelação, o produto da reação de DAB dentro das células deve aparecer marrom. Agora, monte as seções em lâminas super frosts plus, desidrate o tecido por meio de uma série alcoólica graduada, seguida por duas lavagens de clareamento em xilol. Em seguida, cubra as lâminas com paramount e prossiga com a obtenção de imagens.A coloração para EGFP deve começar a mostrar sinal fraco em neurônios motores primários 72 horas após a injeção do P RV 1 52, com a coloração tornando-se robusta após 90 horas. Esse núcleo ambíguo, que abriga os neurônios motores laríngeos, é observado 94 horas após a injeção do P RV 1 52 em dois dos sete músculos laríngeos. Porque o vírus entrou no cérebro por meio de neurônios que inervam os músculos infectados.Outros grupos de motoneurônios, como o núcleo hipoglosso, não expressam EGFP após 90 horas. O EGFP pode ser observado em células de segunda ordem. Esses neurônios do tronco encefálico foram corados após a infecção primária no núcleo ambíguo.A injeção foi unilateral e o padrão resultante de marcação no tronco encefálico mostra infecção do núcleo ipsilateral. Interneurônios reticulares dos núcleos ambíguo e solitário também foram infectados e apresentam forte coloração para EGFP. Esses interneurônios conectam diversas estruturas, incluindo os grupos de motoneurônios atórios e o núcleo contralateral ambíguo.No entanto, seus alvos eferentes permanecem não identificados porque o vírus se espalha apenas na direção retrógrada. O tempo de sobrevida com o PRV é limitado, mas pode mostrar coloração por EGFP em células de terceira ordem e superiores infectadas; neurônios pré-motores no córtex motor expressaram EGFP contralateralmente ao local de injeção periférica. Presumivelmente, apenas a população de células que compunha a representação cortical motora da musculatura laríngea foi infectada.Axônios marcados com BDA ao nível do núcleo ambíguo, indicado pelas setas, fazem contato com os neurônios motores positivos para CTB, marcados por retrotransporte a partir de injeções nos músculos laríngeos, visíveis em marrom; os axônios formam varicosidades e bastões terminais putativos próximos às dendrites dos neurônios motores laríngeos e perto do soma dos neurônios motores laríngeos. Experimentos adicionais utilizando microscopia eletrônica ou eletrofisiologia são necessários para determinar se essas varicosidades representam sinapses. Uma injeção bilateral de BDA realizada na córtex motora conectada à laringe é vista em preto, pois o BDA não é direcionalmente específico, podendo marcar tanto conexões aferentes quanto eferentes.Por exemplo, tanto um campo de projeção de marcação anterógrada quanto corpos celulares marcados por retrogradação são observados no tálamo. As células talâmicas são identificadas pela seta e a cápsula interna é marcada para orientação. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da raiva pseudotípico e DAB pode ser extremamente perigoso e que precauções, como a esterilização, devem ser tomadas.Todos os materiais que entraram em contato com o VPR ou com DAB devem ser tratados com solução de água sanitária a 10%. Deve-se sempre adotar uma adequada disposição de resíduos sólidos e líquidos biologicamente perigosos, conforme as regulamentações da sua instituição, durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Aqui, apresentamos um protocolo refinado para efetivamente revelar biotinilado amina de dextrano (BDA) rotulagem com uma fluorescente método através de um caminho neural recíproco de coloração. É apropriado para analisar a estrutura fina do BDA, rotulagem e distinguindo-a das outros elementos neurais sob microscópio confocal laser.

Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

A tomografia serial de dois fótons (STPT) é uma técnica para obter imagens de uma massa de tecido em sua forma tridimensional, combinando imagens de dois fótons com controle automático de estágio e corte de micrótomo. Aqui descrevemos um protocolo para implementá-lo para cérebros de saguis para entender melhor suas características estruturais.

Tomografia seriada de dois fótons de todo o cérebro do sagui para análises neuroanatômicas

Aprenda a mapear circuitos neurais pré-motores usando traçamento transsináptico com vírus pseudorrábico e técnicas clássicas de marcação. Este método permite identificar redes neurais distribuídas que regulam alvos periféricos.

Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling (Vídeo) | JoVE Journal

Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

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