Name: Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Aprenda a realizar genotipagem em larga escala usando o ensaio Infinium da Illumina. Este protocolo permite analisar milhões de SNPs em centenas de amostras de DNA em apenas três dias.

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O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, e NIH R56 AI063274

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Os autores deste artigo não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.

Aplicações de genotipagem em larga escala têm sido usados ​​para compreender melhor o mecanismo genético subjacente muitas doenças humanas. A descoberta de qualquer variante significativa através de uma análise de associação do genoma pode sinalizar uma região candidata para um estudo mais aprofundado. Além disso, os dados do genótipo é uma boa ferramenta para o controle de qualidade em projetos de seqüenciamento. Para maximizar o rendimento da amostra, várias placas de amostra podem ser amplificados e armazenados em seus fragmentados, estados suspensão. Oito placas pode ser amplificado em um único dia, combinando a primeira 24 horas do protocolo para vários lotes e fornecer material suficiente para ~ 2-8 dias de processamento de chip. Se as placas são armazenadas previamente amplificados, e se novas amostras são cruzados para fichas imediatamente após a digitalização começa na corrida anterior, o processamento pode ser executado de forma contínua, sem a necessidade de fazer uma pausa para a preparação da amostra adicional. Portanto, apesar de amostras terá três dias para submeter-se ao completoensaio, os dados podem ser gerados por dia. Fichas Assuming24 são processados ​​a cada dia, uma semana de trabalho de cinco dias permite a mais de um mil amostras de DNA para serem executados em um chip de talão de 12 amostras. Se um dos passos ou reagente falhou, no entanto, vários lotes pode estar em risco para o mau desempenho antes de qualquer correção pode ser aplicada. Os erros podem passar despercebidos até que as matrizes são digitalizados ou analisado, portanto, se o rendimento é maximizado, centenas de amostras em vários estágios do protocolo já poderia ter recebido o mesmo tratamento com defeito após o descobrimento. Como os reagentes e os dados perdidos não podem ser recuperados, o usuário deve pesar os riscos contra a necessidade de um fluxo de trabalho acelerado. O software de análise de GenomeStudio é a primeira oportunidade de medir realmente o sucesso do processo de genotipagem. Se a Norma-R vs parcelas intensidade Norm-Teta estão devidamente agrupados, a taxa média de chamada (por cento do total de SNPs digitado com sucesso) das amostras deve se aproximar de 99%, embora este valor varia slightly dependendo do tipo de matriz. Os dados a partir de qualquer amostra com uma taxa de chamada menor que 85-90% não é confiável e deve ser descartada. Para fins de controle de qualidade, os resultados devem ser comparados a qualquer genótipos previamente conhecidos sempre que possível. Se esses dados não existe, intencional duplicação da amostra é uma ferramenta útil na verificação da placa ou matriz colocações. Estes pares duplicados devem ser colocados em chips separados, placas, lotes ou projectos; seus genótipos verificado após geração. Enquanto constrangimentos específicos QC variar de acordo com a preferência do investigador, as restrições comuns SNP são baseados em sucesso chamada de exemplo, o equilíbrio de Hardy-Weinberg, ou falta completa entre casos e controles, enquanto que as restrições de amostras comuns são baseados em taxas de chamada, inconsistências mendelianas, ou referências cruzadas do cromossomo X heterozygosity aos dados clínicos de gênero [13]. Se algum problema surge, o Dashboard Controles, encontrado na suíte de análise, podem ser submetidos àcompanhia, a fim de determinar a causa. Esses controles muitas vezes pode limitar o problema ao passo provável ou falha de reagentes. Se algum SNPs de interesse são encontrados através de um experimento genotipagem Infinium, suas parcelas de intensidade deve ser verificada em GenomeStudio por erros de agrupamento antes de mais pesquisas sejam efetuadas. Um experimento de genotipagem Infinium não é provavelmente devido a um erro de processamento humano ou DNA entrada de má qualidade. Amostra quantificação deve ser exato e preciso. Para melhores resultados, os reagentes adicionados a qualquer amostra ou chip tem de ser vertido para o volume definido pelo protocolo. As pipetas devem ser devidamente calibrado. Os reagentes não devem ser executados após o vencimento e não devem ser novamente congelados, uma vez descongelado, para salvar o reagente RA1. A fim de minimizar possíveis erros de coloração e de extensão, a mistura de formamida / EDTA deve ser preparado todos os meses. Todos os -20 ° C reagentes devem ser armazenados em freezers apenas o manual-degelo. Todo material de laboratório usado na ruaaining, de extensão e de lavagem de partes do protocolo deve ser lavada cuidadosamente com água e detergente neutro imediatamente após desuso. Os reservatórios de umidificação na câmara hyb deve ser limpo com uma escova de tubo de ensaio e detergente neutro. As lâminas de vidro devem ser lavados com água sanitária a 10%, conforme as instruções dos seus manuais do usuário, uma vez por semana.

Digitando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) é um método fundamental de identificar variantes de risco associados à doença. Historicamente, o âmbito de experiências de genotipagem tiver sido limitados pela tecnologia disponível. Métodos de genotipagem baseadas em electroforese em gel estão limitadas na amostra e SNP throughput [1]. O desenvolvimento destes ensaios muitas vezes pode ser trabalhoso, contando com a composição e estrutura da região em torno da variante de otimização [1]. Ensaios TaqMan genotipagem, desenvolvido pela Life Technologies, pode executar um grande número de amostras de forma rápida e com o mínimo envolvimento técnico [2], mas as restrições SNP-multiplexação continuam a limitar o número total de genótipos para bem menos de um milhão por dia [3,4 ]. Plataforma Iplex da Sequenom também pode executar muitas amostras de uma só vez, mas, como menos de cem SNPs podem ser multiplexados em conjunto, o throughput é comparativamente baixa global [5]. Tecnologia fluxo SNP da Beckman Coulterpoderia, teoricamente, produzir mais de três milhões de genótipos por dia, mas esta faixa de limites de tecnologia de projeto para um máximo de apenas quarenta e oito SNPs por reação [4,6]. Enquanto o ensaio GoldenGate pode processar quase duas centenas de amostras de DNA de cada dia em centenas ou milhares de SNPs por amostra, o preço por genótipo não é competitivo com, técnicas avançadas de ultra-alto rendimento ao digitar mais de três mil SNPs de uma só vez [4,7 ]. A fim de processar vários milhões de genótipos por dia, a escala necessária para grandes estudos de associação do genoma, os ensaios matriz de hibridização tornaram-se a opção mais rentável no mercado. Linha de Affymetrix de matrizes de hibridização e linha de matrizes à base de Infinium da Illumina permitir potencialmente centenas de amostras a ser digitado em centenas de milhares ou milhões de SNPs em paralelo [4,8]. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma, localizada em regiões de interesse, como a exomes, ou personalizado com a preferência do usuário. Estas matrizes têm a vantagem de não apenas ser capaz de genótipo com precisão um milhão de SNPs por amostra de uma vez, mas também para medir a variação do número de cópias, anormalidades cromossômicas potencialmente revelando. Infinium alinhados matrizes OMNI BeadChip atualmente tem a capacidade de genótipo até quase cinco milhões de marcadores por amostra, incluindo meio milhão de loci costume, em até cerca de cem amostras de cada dia. Como a maioria das doenças têm um componente genético, essas experiências em larga escala pode ser crucial na busca de genes associados com a doença. De alta capacidade para a geração de genotipagem permite genótipo eficiente no exemplo define grande o suficiente para detectar de forma convincente de associação genética em freqüências alélicas menores inferiores. Projectos de genotipagem todo o genoma pode ser usado para localizar regiões com freqüência do alelo de caso-controle estatisticamente significativa ou diferenças no número de cópias [9,10,11]. De acordo com o National Human GeInstituto de Pesquisa de nome, estudos de associação ampla de genoma levou a 1.490 publicações separadas entre 25 de novembro de 2008 e 25 de janeiro de 2013, decorrente da descoberta de SNPs 8283 com um valor de p menor que 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Esses estudos, que pesquisou as condições que vão desde a altura ao câncer testicular, beneficiou da abordagem ampla proporcionada por uma análise de todo o genoma. Em casos como estes, regiões inteiras de interesse poderia ter escapado à atenção tinha o escopo de digitação sido demasiado restritiva. Assim, para análises de associação em grande escala, uma técnica de genotipagem de todo o genoma é a técnica de escolha. Existem diferentes versões do ensaio Infinium, cada um projetado para uso com tipos específicos de arrays. O ensaio InfiniumUltra, discutidos em profundidade a seguir, é adequado para muitos 12 - ou lascas de matriz 24 de amostra. Estes, muitas vezes o genótipo mais de cem mil SNPs por amostra de DNA e se concentrar em targeted regiões, como em exome ou personalizados painéis. Outras versões do ensaio podem ser necessárias para outros tipos de chips, como as matrizes de genotipagem de todo o genoma. No entanto, como todos os ensaios Infinium compartilham uma base comum e diferem principalmente apenas pelos nomes de reagentes, os volumes de reagentes, ou o procedimento exato reagente coloração, técnicas aperfeiçoadas em uma versão ensaio muitas vezes pode ser universalmente aplicado. Outras matrizes, como matrizes de metilação, pode usar um protocolo quase idênticas, como bem. Cuidados devem ser tomados ao utilizar apenas a versão de ensaio necessários para o tipo de chip em uso. Alguns tipos, como as que medem nível de expressão de genes, pode exigir o uso de um protocolo de nonInfinium. As amostras devem ser processadas em lotes. Por exemplo, com o ensaio de InfiniumUltra, tubos de ensaio de pré-hibridação conter um volume suficiente para executar 96 amostras, e os tubos não podem voltar a ser congelados. Portanto, as amostras devem ser executados em lotes de 96 amostras de cada vez. As amostras serão amplificados sobre os abetosdia t. Após aproximadamente 1 hora de benchwork, as amostras devem ser aquecidos num forno de convecção durante 20-24 hr. No dia seguinte, cerca de 4 horas, será gasto fragmentação, precipitação, e ressuspensão das amostras, no ponto em que as amostras podem ser congeladas para uso futuro ou hibridadas com o chip. Carregando fichas leva quase 2 horas, após o qual as amostras serão hibridizados durante a noite por 16-24 horas. No terceiro dia, o passo de coloração e extensão leva ~ 4 horas. Uma hora mais será gasto lavagem, revestimento, secagem e os chips. Finalmente, as matrizes são verificados, o que pode levar 15-60 min / chip, dependendo do tipo usado. As precauções padrão de segurança de laboratório e limpeza aplicar. Embora a amplificação não é à base de RCP, as estações de trabalho separados para pré-e postamplification procedimentos são necessários a fim de minimizar a probabilidade de contaminação. O número de cada reagente fornecido pelo kit em uso de identificação deverá ser registrado em uma folha de rastreamento. Reagents devem ser descongeladas imediatamente antes da utilização e invertido várias vezes antes de dispensar. O DNA a ser digitado deve ser ADN genómico de alta qualidade (260/280 razão de absorvâncias de 1,6-2,0, 260/230 razão de absorvâncias de abaixo de 3,0), isolado através de métodos padrão e quantificados com um fluorómetro. Degradação de DNA é muitas vezes um fator que contribui para os resultados do ensaio de baixa qualidade. Normalmente, é necessária a 200 ng de ADN, embora esta quantidade pode variar de alguns tipos de chip. A-manipulação líquido Tecan robô pode automatizar muitas etapas do protocolo e minimizar o erro humano como um fator.

<table><tbody><tr><td><forte>Consumíveis ou Equipamentos</forte></td><td><forte>Fabricante</forte></td><td><forte>Número da peça</forte><</td><td>forte>Mínimo necessário para 96 amostras</forte></td></tr><tr><td>0,8 ml Placa de poço profundo</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>Tapetes</td><td>de placa Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>Bacia de reagentes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>Folhas de Selagem a Calor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Espaçador de Fluxo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta - 200 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta - 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta - 1.000 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>0,1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol (grau HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Etanol (200-prova)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>Formamida (100%)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipeta de 8 canais</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipeta de 8 canais</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipeta de canal único</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>Centrífuga de microplacas refrigerada</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Incubadora de microamostras Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Inserção</td> <td>de bloco de calor Hybex MIDIIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>Seladora Térmica</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Câmara Hyb c/ Inserto e Tapete</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>Tesouras Cirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>Peças de Montagem de Fluxo</td><td>Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>Lavatório e Prato</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>Genepaint Chamber Rack</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>Sonda de Temperatura</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>Staining Rack e Dish Illumina</td><td></td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>Pinça de Fechamento Automático</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>Coletor de Vácuo</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan ou HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

infinium ensaio para a grande escala applications genotipagem

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotipagem variantes no genoma humano provou ser um método eficiente para identificar associações genéticas com fenótipos. A distribuição de variantes dentro das famílias ou populações pode facilitar a identificação dos fatores genéticos da doença. Painel de BeadChips genotipagem da Illumina permite aos investigadores ao genótipo milhares ou milhões de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou analisar outras variantes genômicas, tais como número de cópias, através de um grande número de amostras de DNA. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma ou alvo em regiões específicas, a fim de maximizar o potencial de descoberta. O ensaio Infinium foi otimizado para produzir de alta qualidade, resultados precisos rapidamente. Com uma configuração adequada, um único técnico pode processar a partir de algumas centenas a mais de um milhar de amostras de ADN por semana, dependendo do tipo de matriz. Este ensaio orienta os usuários através de cada passo, começando com DNA genômico e terminando com a varredura da matriz. Usando decoro REAGEnts, ​​as amostras são amplificados, fragmentado, precipitado, ressuspenso, hibridizado com o chip, prorrogado por uma única base, manchado, e digitalizadas em cada um de alta resolução sistema de imageamento óptico iScan ou Hi Scan. Um passo durante a noite é necessário para amplificar o ADN. O DNA é desnaturado e isotermicamente amplificado por amplificação de todo o genoma e, portanto, não é necessária a PCR. As amostras são hibridizadas para as matrizes durante um segundo passo durante a noite. No terceiro dia, as amostras estão prontas para serem digitalizados e analisados. O ADN amplificado pode ser armazenados em grandes quantidades, o que permite matrizes grânulo para ser processado a cada dia da semana, maximizando assim o rendimento.

Um chip talão devidamente processado deve mostrar intensidades vermelhas e verdes brilhantes e distintas de luz a laser durante a digitalização. Na Figura 6, o software de digitalização iScan exibe uma amostra de ADN genómico padrão hibridizaram para um painel de costume matriz genotipagem. Os nucleotídeos marcados que foram anexados durante as etapas de extensão e de coloração fluorescente sob as luzes dos dois lasers. Como estes nucleótidos estender selectivamente cadeia de oligonucleótido do talão hibridado com a cadeia de DNA fragmentado, e como as cadeias de oligonucleótidos foram concebidos para terminar no local da variante, a cor e a intensidade do sinal resultante pode ser utilizado para determinar os alelos presentes no local SNP. Uma folha gerado por usuários da amostra, que corresponde IDs de amostra e informações clínicas para chipID e posição, e um manifesto específico SNP-array, obtido diretamente da empresa, são necessárias a fim de importar o scaarquivos de saída nner para o software de análise de GenomeStudio. Folhas de amostra Exemplo pode ser encontrada no site da empresa. Uma vez que o projeto GenomeStudio é construído, os genótipos podem ser obtidos a partir dos grupos de intensidade resultantes gerados automaticamente pelo software. Apesar de existirem várias opções de exibição, o modo de exibição padrão, Norm-R (um valor de intensidade normalizada) vs Norm-Theta (um rácio de intensidade alélicas), é muitas vezes o enredo mais fácil de diferenciar três grupos distintos. A maioria dos SNPs deve mostrar uma, duas, ou três grupos, dependendo da freqüência do alelo menor. Os três grupos representam amostras demonstrando AA, AB, ou alelos BB (ver Figura 7). Estes grupos podem ser atribuídos genótipos ou através da importação de um modelo de posição agrupamento padrão diretamente da empresa, selecionando &quot;Cluster Todos os SNPs&quot; na barra de ferramentas de análise do software, ou clicando e arrastando os círculos coloridos nas parcelas de intensidade para EDI manualmente<html> t chama. A cor da amostra no gráfico de intensidade (vermelho, roxo ou azul) indica que a chamada (AA, AB ou BB, respectivamente); preto indica nenhuma chamada. Ao percorrer os SNPs listados no painel de dados completa do software, o agrupamento para cada SNP podem ser vistos ou recolhidos. Uma vez que os clusters são atribuídos chamadas satisfatórios, o painel de dados completa do software lista os genótipos para cada amostra individual em cada SNP particular. A opção Seletor de coluna acima da tabela pode alternar formatos de dados. Os dados podem ser exportados através de barra de ferramentas de análise ou diretamente da tabela de dados completa para análise em profundidade. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Visão geral - Infinium Ensaio protocolo.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Completa Hyb Câmara de base e esteira, além de tampa. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3 Carregando um BeadChip -.. Dispensar a amostra sobre as portas de entrada [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior</a><html> imagem. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4 Retirar o BeadChip Coverseal -.. Segure o selo no canto e delicadamente descascar diagonal [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Completa Assembléia BeadChip Flow-through - O BeadChip é separado de uma lâmina de vidro com um espaçador e preso com grampos.&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Successful BeadChip Scan - A) O BeadChip é digitalizada com ambos um laser vermelho e verde; o software de digitalização exibe ambos simultaneamente. Seções passam intensidade QC irá destacar verde no visor BeadChip para a esquerda. Seções falhando intensidade QC irá destacar vermelho no visor BeadChip. B) Quando a digitalização estiver concluída, o software irá sobrepor os displays vermelhos e verdes. Uma imagem zoom-in é mostrado. A cor ea intensidade de cada talão indivíduo indica o alelo presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wipáginas fina = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. SNP NORM-R vs NORM-teta Perfis de Cluster - A) A SNP válido com três grupos distintos que representam AA, AB, e os genótipos BB, de cor vermelho, roxo e azul B) A edição exigindo SNP.. O cluster de meio, que deve ser homozigotos AB, é deixado sem chama. O cluster BB é erroneamente chamado de AB. C) A SNP pobre desempenho. Não genótipos podem ser obtidas a partir deste enredo intensidade, como não existem grupos distintos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Um protocolo é descrito que utiliza ensaios Infinium Illumina para realizar genotipagem em larga escala. Estes ensaios podem genótipo de forma confiável milhões de SNPs em centenas de amostras de DNA individuais em três dias. Uma vez gerados, os genótipos pode ser usado para verificar as associações com uma variedade de diferentes doenças ou fenótipos.

Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar com sucesso o ensaio Infinium para processar um chip de genotipagem com microesferas. Isso é realizado primeiramente amplificando, fragmentando e isolando o DNA. O segundo passo consiste em hibridar a fita de DNA desnaturada com oligonucleotídeos ligados a microesferas na matriz.Em seguida, o oligonucleotídeo ligado ao grânulo é corado e estendido seletivamente por uma base. O passo final consiste em escanear as lâminas com grânulos para detectar o nucleotídeo marcado. Por fim, os resultados de genotipagem são utilizados para determinar os alelos presentes no local de interesse.A demonstração visual deste método é essencial porque muitos dos passos para coloração e carregamento das lâminas para abelhas são difíceis de aprender. Muitas das manobras não são encontradas em outros métodos de genotipagem e muitos dos equipamentos têm nomes muito semelhantes. Um dia antes da amplificação, prepare a dispensação de DNA colocando 200 nanogramas de DNA por poço em uma placa de 96 amostras com poços profundos.Devem ser plaqueados pelo menos 96 amostras para garantir que nenhum reagente seja desperdiçado. Rotule a placa com um adesivo de código de barras fornecido pelo kit e centrifugue-a para normalizar os volumes. Deixe as amostras em uma gaveta ou capela de exaustão durante a noite para evaporar o líquido.Cubra a placa de forma frouxa com uma tampa ou papel toalha para evitar poeira na manhã seguinte. Verifique se os poços estão secos e use uma bacia de reagente e uma pipeta multicanal de 10 microlitros para dispensar quatro microlitros de tampão de rehidratação de DNA em cada poço, a fim de reidratar as amostras. Se tiver cuidado para não tocar o líquido, não é necessário descartar as ponteiras da pipeta entre cada coluna.Em seguida, distribua 20 microlitros do reagente MA um em cada poço da placa utilizando uma pipeta de oito canais e um recipiente novo para o reagente. Cubra a placa com um selo reutilizável, centrifugue brevemente e vortexie por um minuto a 1600 RPM em um agitador para microplacas, seguido de incubação à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Os passos restantes para amplificação não serão mostrados neste vídeo, mas o protocolo pode ser encontrado no manuscrito suplementar.Após a adição de todos os reagentes, coloque a placa em uma estufa devidamente calibrada ajustada para 37 graus Celsius por 20 a 24 horas. Após a amplificação, as amostras de DNA são fragmentadas e precipitadas conforme descrito no manuscrito, após a precipitação em uma centrífuga de alta velocidade. Inspecione a parte inferior da placa sem invertê-la.Para confirmar que as amostras estão precipitadas em um pellet azul, descarte a tampa e remova rapidamente o líquido invertendo a placa e batendo-a com força na bancada coberta com papel-toalha. Uma vez invertida a placa, tenha cuidado para não voltá-la. Enquanto houver líquido, bata repetidamente a placa contra a bancada até que todo o líquido seja removido.Coloque a placa em um suporte para tubos de ensaio invertido para secar em incubação à temperatura ambiente por uma hora. Posteriormente, o DNA é ressuspenso para iniciar o procedimento de hibridização. Coloque uma placa de 96 poços contendo o DNA ressuspenso em um bloco térmico a 95 graus Celsius por 20 minutos.Para desnaturar o DNA após 20 minutos, retire a placa de amostras do bloco térmico e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto a placa de amostras esfria, prepare a câmara da colmeia. Uma câmara será necessária para cada quatro lâminas de abelhas processadas. Coloque um tapete de borracha sobre a parte superior da base da câmara da colmeia, alinhando o orifício mais grosso com a frente da base.O símbolo do código de barras gravado na base ainda deve estar visível. Usando uma pipeta de 1000 microlitros, adicione 400 microlitros do reagente PB dois em cada um dos oito reservatórios umidificadores esculpidos na base. Coloque a tampa da câmara hi sobre a base e fixe ambas as extremidades colocando dois grampos em lados diagonalmente opostos.Primeiro, coloque quatro inserts de câmara Hi sobre a bancada para cada câmara Hi utilizada logo antes da conclusão dos 30 minutos. Resfriamento. Abra os pacotes do chip de contas prateadas.Remova os chips de suas capas plásticas transparentes sem tocar nas microesferas. Coloque cada chip de abelha em um inserto de câmara alta. Oriente o código de barras do chip com o símbolo de código de barras gravado na superfície superior do inserto.O próximo passo, que é o carregamento dos chips de abelha, pode ser o passo mais crítico do protocolo. Fazer isso corretamente exige a visualização antecipada da transferência da amostra da placa de DNA para o chip de abelha. Remova e descarte a tampa da placa de amostra. Uma pipeta multicanal pode ser usada para dispensar líquido nos chips, mas é necessário planejar com antecedência para aspirar apenas o número de amostras que possam ser colocadas com segurança no chip de abelha, pois o número de linhas em uma placa nem sempre corresponde ao número de linhas em um chip.Retire 15 microlitros de amostra da placa de amostra e dispense lentamente na entrada do arranjo. É necessário tomar cuidado extremo para colocar a amostra correta no chip de microesferas correto, na posição exata que corresponda ao chip de microesferas, conforme a ordem registrada anteriormente.Abra a câmara hi e posicione os insertos sobre as cubas umidificadoras. O código de barras do chip deve ser colocado sobre a marcação de código de barras na base da câmara hive. Substitua a tampa da câmara hive e feche os quatro fechos, fechando os fechos localizados em lados diagonalmente opostos.Primeiro, incube a câmara hi em uma estufa a 48 graus Celsius por 16 a 24 horas. Ao final da hibridização, as câmaras hi são removidas da estufa e incubadas à temperatura ambiente por 25 minutos para esfriar. Quando as câmaras hi tiverem esfriado, abra uma câmara hi. Remova o selo de proteção de um chip bee segurando o selo em um dos cantos e puxando suavemente na diagonal.Uma vez removido o selo, coloque imediatamente o chip em uma bandeja de chip para abelhas e submerja em PB um sem tocar nas esferas. Repita até que a bandeja esteja cheia de chips com esferas. Tendo o cuidado de não deixar nenhum chip secar.Agite suavemente a bandeja para remover quaisquer bolhas e deixe os cortes submersos por um minuto. Agite a bandeja novamente. Transfira a bandeja com os cortes de abelha para um segundo recipiente de lavagem contendo PB. Agite suavemente e deixe em solução por um minuto.Em seguida, agite novamente no fluxo líquido através da estação de montagem. Coloque quatro suportes plásticos pretos de passagem nas ranhuras. Encha a estação com PB um até que o líquido atinja quase a altura dos oito suportes de montagem, um por vez.Remova os chips de microesferas da bandeja e coloque-os na estação de montagem sobre um suporte plástico com fluxo contínuo, alinhando o código de barras do chip acima do símbolo de código de barras gravado na estação de montagem. Após posicionar quatro chips na estação de montagem, coloque um espaçador plástico transparente sobre cada chip de microesferas. As bordas externas do espaçador devem envolver os suportes localizados dentro da estação de montagem.Coloque a barra plástica de montagem na estação de montagem encaixando-a sobre as ranhuras. Coloque suavemente uma lâmina de vidro sobre o espaçador plástico, empurrando a extremidade traseira da lâmina contra a barra de montagem e abaixando lentamente a frente na solução. A ranhura na parte superior da lâmina deve ficar voltada para baixo, diretamente acima do código de barras do chip, deixando um espaço entre o chip da abelha e a lâmina na extremidade do código de barras.Após verificar que não há bolhas entre o chip e a lâmina, prenda dois grampos metálicos ao redor do vidro. Deslize um em direção à extremidade do código de barras e outro em direção à traseira. As bordas dos grampos plásticos devem segurar o suporte plástico de fluxo sob o chip.Esta figura mostra um diagrama completo de montagem em fluxo direto. Depois que todas as esferas estiverem nas suas montagens de fluxo direto, pegue um par de tesouras cirúrgicas e corte ambas as extremidades do espaçador o mais próximo possível da lâmina de vidro. Quando o suporte da câmara estiver a 44 graus, inicie este procedimento colocando uma montagem de fluxo direto do chip de abelha no suporte da câmara, deslizando a montagem para baixo e encaixando o suporte na parte superior. O lado traseiro do chip de abelha deve ficar em contato com o suporte da câmara.O lado do lâmina de vidro deve ficar voltado para fora, com o sulco na parte superior, formando um reservatório para reagentes. Após posicionar todas as montagens do chip de abelha na grade da câmara, utilize uma pipeta de 200 microlitros para adicionar 150 microlitros do reagente RA um às montagens de fluxo contínuo. Ao dispensar o líquido no reservatório de vidro, o reagente fluirá naturalmente para baixo ao longo da lâmina e sairá na base da montagem, permitindo que reagentes subsequentes sejam adicionados diretamente ao reservatório.Os passos restantes para a coloração de uma extensão não serão mostrados. Consulte o protocolo no manuscrito acompanhante ao final da coloração e da extensão. Desmonte o conjunto de fluxo contínuo inserindo uma barra metálica fina entre os fechos e o suporte.Em seguida, rotacione. Deixe de lado a lâmina de vidro e remova imediatamente o chip de abelha, colocando um chip de abelha em uma bandeja vertical para chip de abelha e submergindo em PB1, repetindo esse procedimento para cada conjunto de fluxo contínuo. Tendo o cuidado de orientar cada chip de abelha na mesma direção e minimizando sua exposição ao ar.Em seguida, conclua este procedimento. De acordo com o protocolo no texto acompanhante, um chip de abelha devidamente processado deve exibir intensidades luminosas vermelha e verde brilhantes e bem definidas ao ser escaneado, pois os nucleotídeos marcados que foram ligados durante as etapas de extensão e coloração fluorescerão sob as luzes dos dois lasers. Aqui é mostrado uma amostra padrão de DNA genômico hibridizada com sucesso a seções de um painel personalizado de matriz de genotipagem SNP que passaram no teste de intensidade.O QC exibirá destaque verde no visor do chip de abelha nas seções à esquerda. Intensidade insuficiente. O QC exibirá destaque vermelho no visor do chip de abelha.Uma vez concluída a varredura, será feita a sobreposição das exibições vermelha e verde. Uma imagem ampliada é mostrada aqui, pois esses nucleotídeos estendem seletivamente a cadeia de oligonucleotídeos das microesferas hibridizada ao fragmento de DNA. E como as cadeias de nucleotídeos são projetadas para terminar no local da variante, a cor e a intensidade do sinal resultante podem ser usadas para determinar os alelos presentes no sítio do SNP.Os arquivos de saída do scanner são importados para o software de análise Genome Studio, que gera perfis de agrupamento. Este é um exemplo de um SNP válido com três agrupamentos distintos representando os genótipos aa, A, B e B, B, coloridos em vermelho, roxo e azul, respectivamente. Este gráfico de intensidade mostra o SNP que exigiu a edição do agrupamento central preto, que deveria ser homozigoto.AB é deixado sem chamada. O agrupamento BB é incorretamente chamado de ab. O último gráfico de intensidade mostra um SNP com desempenho insatisfatório.Nenhum genótipo pode ser obtido a partir deste gráfico de intensidade, pois não existem agrupamentos distintos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de processar rapidamente os chips das abelhas. Não os exponha ao ar por períodos prolongados de tempo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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