Name: No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a distinguir inflamação aguda e crônica em camundongos vivos usando imagem por bioluminescência com substratos luminol e lucigenina. Este método não invasivo permite visualizar atividade de neutrófilos e macrófagos em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nancy Lurie Marks. Agradecemos a Dra. Nancy E. Kohl para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos K. Wong Kin por sua ajuda na preparação deste relatório vídeo.

Nota: Todos os estudos com animais foram realizados sob protocolos institucionais aprovados e orientações de cuidados com animais. 1. Reagentes e Soluções <ol><li> Solução PMA sc para inoculação: Prepara-se uma solução de estoque de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), a 5 mg / ml em DMSO. Armazene a solução de reserva, a -20 ° C. Antes da inoculação, descongelar a solução estoque e diluir a 1 mg / ml de PMA, em PBS. </li><li> Solução de LPS para inoculação sc: Dissolver lipopolissacarídeo (LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis) em PBS estéril a 1 mg / mL antes da inoculação sc. </li><li> Solução de luminol para imagiologia de fase aguda: Dissolver o luminol (,4-phthalazinedione, sal de sódio de 5-amino-2 ,3-di-hidro-1) em solução salina normal estéril (0,9% de NaCl) a 10 mg / ml. A solução pode ser armazenada a -20 ° C antes da utilização. </li><li> Lucigenina solução para a imagem latente fase crônica: Dissolver lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato) em soro fisiológico estérilde 2,5 mg / ml. A solução pode ser armazenada a -20 ° C antes da utilização. </li></ol> 2. Subcutânea PMA Inflamação Modelo <ol><li> Anestesiar NCR camundongos nus em uma câmara de indução com 1-2% de isoflurano. Confirme a anestesia geral pela perda de movimento e uma freqüência respiratória constante. Transferência de um animal a um cone de nariz alimentado com gás isoflurano-misturada e manter o animal sob anestesia. </li><li> Use um álcool isopropílico limpar de limpar e desinfectar o local da injecção no flanco esquerdo. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, injecta-se 50 ul da solução de inoculação PMA (contendo 50 ug de PMA) no espaço subcutâneo no flanco esquerdo. Retire o excesso de fluido no local da injeção, usando uma compressa embebida em álcool isopropílico. Evite o uso de analgesia, pois pode afetar respostas inflamatórias. </li><li> Coloque o animal de volta para a jaula habitação e acompanhar de perto a sua recuperação da anestesia. A fim de ajudar na recuperação, utilizar uma almofada de aquecimento para manter o animal quente.</li></ol> 3. Subcutânea LPS Inflamação Modelo <ol><li> Anestesiar camundongos C57BL/6J com 1-2% de isoflurano em uma câmara de indução. Uma vez que estabelece a anestesia geral, a transferência de um animal a um cone de nariz alimentado com gás isoflurano e manter o animal sob anestesia. </li><li> Use um álcool isopropílico limpar para limpar o local de injecção na pata esquerda. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, injecta-se 50 ul da solução de inoculação de LPS (contendo 50 ug de LPS) na pata traseira esquerda. Retire o excesso de fluido no local da injeção, usando uma compressa embebida em álcool isopropílico. Evite o uso de analgesia, pois pode afetar respostas inflamatórias. </li><li> Coloque o animal de volta para a jaula habitação e acompanhar de perto a sua recuperação da anestesia. Use uma almofada de aquecimento para manter o aquecimento de animais durante a recuperação. </li></ol> 4. Bioluminescência imagem de Inflamação <ol><li> Anestesiar o animal em uma câmara de indução com 1-2% de gás isoflurano misturado. Confirm anestesia geral pela perda de movimento e uma freqüência respiratória constante. </li><li> Enquanto o animal está ainda sob anestesia, por via intraperitoneal (ip) injectar a solução de luminol (10 mg / ml), ou a solução de lucigenina (2,5 mg / ml) para a imagem da inflamação aguda ou crónica, respectivamente. A dose final é de 100 mg / kg para o luminol e 25 mg / kg para lucigenina. Uma dose mais baixa de lucigenina (10-15 mg / kg) pode ser usado para evitar a possível toxicidade para algumas estirpes de ratinho. Os sinais de toxicidade incluem falta de ar e desconforto respiratório. A cepa C57BL/6J tem menor lucigenina tolerabilidade do que a cepa nu NCr. </li><li> Transferir o animal na câmara de imagem de um sistema de imagem de bioluminescência. </li><li> Realize imagem de bioluminescência seqüencial em intervalos de 1 min. Cada passo de imagem é composto por um tempo de aquisição min, m / paragem = 1, 16 e binning = 0 seg atraso. </li><li> Dentro do painel de aquisição da imagem, para permitir imagens de várias etapas sequenciais, clique na seqüência de configuração button. Fornecer etapas de imagem suficientes no perfil de aquisição para determinar a saída luminescência máxima (geralmente 15 passos de um minuto será suficiente). A secção de imagem de 15 min permite tempo suficiente para a absorção do substrato e circulação sistémica. </li><li> Remover o animal da câmara de imagem e movê-lo de volta para a jaula habitação. A fim de ajudar na recuperação, utilizar uma almofada de aquecimento para manter o animal quente. </li><li> Durante a análise pós-aquisição, usar o pacote de software de imagem para calcular o pico de sinal bioluminescente total por regiões padronizadas de interesse (ROI). As imagens estão presentes como radiação em fótons / seg / cm 2 / sr com limite mínimo e máximo indicados. Os dados quantitativos são apresentados como fluxo total de fótons por segundo por ROI. </li></ol>

<ol><li>Premack, B. A., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptors%3A+gateways+to+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection.</a> Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesse neste estudo.

Neste relatório, nós demonstramos um método de bioluminescência de imagem não invasivo da inflamação em animais vivos. Aproveitando os dois substratos luminescentes, o luminol e lucigenina, o método pode distinguir diferentes fases de inflamação. Bioluminescência luminol está associada com neutrófilos na fase aguda da inflamação, enquanto a bioluminescência lucigenina é mediada pelos macrófagos na fase crónica. Relativamente pequenas (PM = 177,16 g / mol) e electricamente carregadas, o luminol pode facilmente penetrar t...

A inflamação é uma resposta biológica altamente regulado envolvida numa variedade de doenças humanas, incluindo uma infecção microbiana, a cicatrização de feridas 2, 3 diabetes, câncer 4, 5 cardiovascular, neurodegenerativa, 6, 7 e as doenças auto-imunes. Inflamação de tecidos requer a coordenação adequado de diversas células imunes, a fim de obter a aprovação do patógeno, reparação de tecidos, e a resolução da doença. Neutrófilos e macrófagos são mediadores imunes chaves de inflamação de tecidos. Na fase aguda da inflamação, os neutrófilos são os primeiros socorros para vários estímulos nocivos, e danos no tecido 8. Os neutrófilos extravasar rapidamente da circulação para o local da lesão, onde as células inactivar micróbios invasores, liberando grânulos anti-microbianos e fagocitose. Durante a fagocitose, neutrófilos absorvem micróbios invasores para fagossomas, dentro do qual as células produzem níveis elevados de Superoxide (O 2 · -). Superóxido phagosomal é a principal fonte de muitas espécies reativas de oxigênio a jusante (ROS). Por exemplo, pode ser dismutadas superóxido em peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) por dismutação espontânea ou pela superóxido dismutase (SOD), 9, 10. Em neutrófilos, mieloperoxidase (MPO) converte mais de peróxido de hidrogénio em ácido hipocloroso anti-microbiana (HOCl) 11. À medida que as respostas inflamatórias continuar, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros 2, cuja função fagocítica ajudar a remover agentes patogénicos inactivadas e restos celulares. Além disso, como um regulador chave na fase tardia da inflamação, macrófagos promove a reparação de tecidos, produzindo citocinas anti-inflamatórias 12 e por meio da geração de ROS extracelular a um nível inferior 9. O ROS gerados nesta fase depois regulam a remodelação do tecido, formação de novos vasos, e reepithelialização 13. Fagocitário NADPH oxidase (Phox) é a fonte primária de produção de superóxido em neutrófilos e macrófagos 9. Phox é um complexo de múltiplas subunidades, cujo conjunto é fortemente regulada 9. O holoenzyme contém várias subunidades reguladoras citosólicas (phox p67, p47 phox, p40 phox e RAC) e uma ligada à membrana heterodímero citocromo b 558 (composto de subunidade CYBA e CYBB). O citocromo b 558 é o núcleo de reacção dentro do qual a subunidade CYBB (também conhecida como p91 e NOX2 phox) realiza a reacção em cadeia redox primário 9. Curiosamente, os seus locais de montagem são diferentes entre os neutrófilos e macrófagos. Em neutrófilos em repouso, citocromo b 558 é mais presente na membrana dos grânulos de armazenamento intracelular 14. Durante a fagocitose, os neutrófilos montar o holoenzymes em phagosomes 9, onde altos níveis de atividade MPO também estão presentes. O neutrófilo Phox consome rapidamente oxigênio e exerce seu poder microbicida pela produção de ROS, um fenômeno denominado explosão respiratória 11. Em contraste, os macrófagos possuem um nível mais baixo de expressão de MPO e citocromo b 558 é encontrado principalmente na membrana de plasma 15, 16. Assim, os neutrófilos produzir altos níveis de superóxido para a actividade anti-microbiana, ao passo que os macrófagos produzem menos superóxido para as funções de regulação 15. Uma vez que a inflamação é uma intrincada processo in vivo, métodos de imagem não invasivos específicos para as diferentes fases de inflamação permitiria a avaliação quantitativa e longitudinais de modelos de doenças. Utilizando estudos mecanicistas, já anteriormente demonstrado o uso de dois agentes quimioluminescentes, luminol (5-amino-2 ,3-di-hidro-1 ,4-phthalazinedione) e lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para a imagem não-invasivo de fase aguda e tardia (crônica) de inflamação, respectivamente 17. Luminol permite a visualização da actividade de MPO de neutrófilos durante a fase aguda da inflamação, 18-20, ao passo que a bioluminescência lucigenina pode ser usado para avaliar a actividade dos macrófagos, em associação com a fase tardia da inflamação crónica ou 17. Neste manuscrito, foram utilizados dois modelos de inflamação experimentais (sc sc PMA e LPS) para demonstrar as técnicas de imagem.

<table><tbody><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>P8139</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo do sorotipo enteritidis Salmonella enterica</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>L2012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona, sal de sódio)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>A4685</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lucigenina (nitrato de bis-N-metilacridínio)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>M8010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imagem IVIS Spectrum com pacote de software Living Imaging 4.2</td><td>Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

no método de imagem in vivo distinguir inflamação aguda e crônica

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

A inflamação é um dos aspectos fundamentais de muitas doenças humanas. Neste relatório, vídeo, demonstramos técnicas de imagem de bioluminescência não-invasivos que distinguem a inflamação aguda e crônica em modelos do rato. Com o dano tecidual ou invasão do patógeno, os neutrófilos são a primeira linha de defesa, que joga um papel importante na mediação da resposta inflamatória aguda. À medida que a reacção inflamatória progride, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros, que medeiam a inflamação crónica e promover a reparação do tecido, removendo detritos do tecido e produzir citocinas anti-inflamatórias. A injecção intraperitoneal de luminol (,4-phthalazinedione, sal de sódio de l ,3-di-hidro-1 5-amino-2) permite a detecção de uma inflamação aguda largamente mediada por neutrófilos infiltrantes de tecidos. Luminol reage especificamente com o superóxido gerado dentro dos phagosomes de neutrófilos pois os resultados de uma bioluminescência mieloperoxidase (MPO) reacção mediada. Lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato) também reage com o superóxido para gerar bioluminescência. No entanto, lucigenina bioluminescência é independente da MPO e só depende de NADPH oxidase de fagócitos (Phox) em macrófagos durante a inflamação crônica. Juntos, luminol e lucigenina permitir a visualização não invasiva e avaliação longitudinal de diferentes populações de fagócitos em todo fases inflamatórias agudas e crônicas. Dado o papel importante da inflamação numa variedade de doenças humanas, acreditamos que este método de imagem não invasiva pode ajudar a investigar os diferentes papéis de neutrófilos e macrófagos, em uma variedade de condições patológicas.

Realizamos imagem de bioluminescência longitudinal para avaliar a inflamação aguda e crônica em modelos experimentais de inflamação. De forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é um agonista de quinase C da proteína potente (PKC), que activa Phox para a produção de aniões de superóxido e desencadeia respostas inflamatórias agudas intensas 21. SC injeção de 50 mg de PMA na NCR camundongos nude causou irritação rápido da pele e inflamação aguda no local da injeção 18, 22, 23. Realizou imagiologia por dia...

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

O objetivo geral deste procedimento é distinguir visualmente a inflamação aguda e crônica em camundongos vivos. Isso é realizado por meio da injeção subcutânea de quatro, bola 12 me state, 13 acetato ou PMA para desencadear uma intensa resposta inflamatória aguda. Em seguida, é realizada a injeção intraperitoneal de um substrato quimioluminescente, luminol ou lucigen, para induzir sinais de luz no local da inflamação.A luminescência da luminol indica inflamação aguda. Enquanto a luminescência da lucigênia revela áreas de inflamação em estágio tardio ou crônica, o animal é então colocado dentro de um imageador de bioluminescência, que visualiza os sinais de luminescência produzidos pelos substratos de quimioluminescência nos locais de inflamação. Em seguida, são realizados passos sequenciais de imageamento para capturar a emissão máxima de luminescência para análise quantitativa, e o procedimento de imageamento é repetido em diversos pontos temporais para acompanhar diferentes respostas inflamatórias.No final, os resultados de imagem longitudinal mostram respostas inflamatórias diferenciais com base na cinética de emissão dos dois substratos luminiscentes. Dado o importante papel da

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Nós demonstramos como realizar macrófagos RM usando ultrasmall agente de contraste superparamagnético (USPIO) na artrite séptica, permitindo uma inicial e...

In vivo macrófagos Imagem Usando MR alvejado agente de contraste para avaliação longitudinal de artrite séptica

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações

Aprenda a distinguir inflamação aguda e crônica em camundongos vivos usando imagem por bioluminescência com substratos luminol e lucigenina. Este método não invasivo permite visualizar atividade de neutrófilos e macrófagos em tempo real.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

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