Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é reconstruir e visualizar um cérebro inteiro de camundongo com resolução na escala de mícrons. Isso é realizado primeiramente desidratando um cérebro de camundongo fixado, integrado em série tetrahedran. O segundo passo é clarear a amostra em éter benzílico.

Em seguida, o cérebro é imageado com um microscópio confocal de folha de luz. O passo final é utilizar um software para alinhar e montar as pilhas de imagens adquiridas. Em última análise, uma ferramenta de visualização de múltiplas resoluções pode ser usada para navegar pelo volume de imagem reconstruído.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como microscopia confocal ou de foto, é que o volume completo de um cérebro de camundongo pode ser obtido em apenas alguns dias. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da neurociência, como a distribuição de diferentes tipos neuronais em todo o cérebro. Esta tampa metálica fornece informações sobre a autonomia fina do cérebro?

Pode ser aplicado também a embriões de camundongo ou moscas de patas, demonstrando que o procedimento será reiniciado. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este protocolo, realize a fixação padrão de cérebros de camundongo por meio de perfusão transcardial e pós-fixação durante a noite antes de realizar a desidratação e a clareza.

Em seguida, como o solvente de desidratação, THF, inibe fortemente a fluorescência de XFP, realize a filtração para remover peróxidos com óxido de alumínio ativado básico utilizando uma coluna de cromatografia, evitando rachaduras na coluna, o que reduziria a remoção de peróxidos ao estabilizante na solução final. Mesmo que o THF já tenha sido estabilizado antes da filtração, o estabilizante será retido pelo óxido de alumínio. Observe que o THF sem estabilizante pode desenvolver grandes quantidades de peróxidos e pode ser explosivo e perigoso.

Em seguida, desidrate o cérebro inteiro do camundongo com uma série integrada de THF em água pura. Em seguida, coloque o frasco com a amostra em uma roda rotativa para evitar a exposição à luz. Envolva o frasco com uma folha de alumínio.

Finalmente, filtre o solvente de clareamento com óxido de alumínio utilizando um funil de filtração. Em seguida, clarifique a amostra em DBE a 100%, trocando a solução após três e seis horas, quando o cérebro parecer transparente. Normalmente uma hora após a segunda troca de DBE, monte-a em uma placa de imagem inclinada por um dos métodos mostrados aqui.

Montagem direta por meio de disco agros ou montagem por meio de um alto-falante agro para montagem direta, mergulhe suavemente a amostra em uma das pontas para utilizar o disco agros de imersão. Um disco feito de gel de agros a 6% sobre as pontas. Em seguida, fixe suavemente a amostra no disco agros com cola acrílica e aguarde cerca de um minuto para a cura antes de montar.

Usando o mergulho de béquer de agros, um béquer feito de gel de agros a 3% nos bicos. Em seguida, coloque suavemente a amostra no fundo do béquer. Após montar o espécime seguindo um desses métodos, posicione a placa de imagem dentro da câmara do espécime usando pinças.

Em seguida, preencha a câmara com solução de clareamento. Depois, prepare-se para a tomografia. Primeiro, remova a fenda para coletar o máximo de fluorescência possível e, então, ilumine a amostra com baixa potência de laser.

Para evitar o desbotamento induzido pela luz, mova a amostra nas três direções x, y e z usando o sistema de micro posicionamento controlado por software. Para cada direção, identifique as coordenadas mínima e máxima nas quais a amostra é iluminada enquanto estiver dentro do campo de visão da câmera. Em seguida, insira as coordenadas determinadas como parâmetros para a subrotina de pré-tomografia.

Além disso, especifique a distância entre pilhas adjacentes a ser utilizada na tomografia e na etapa de amostragem pré-tomografia na direção Z. Por fim, inicie a pré-tomografia, que coletará as imagens em cada pilha com os parâmetros de amostragem Z especificados na etapa anterior. Para iniciar a aquisição, primeiro mova a amostra para fora da folha de luz utilizando o sistema de micro-posicionamento.

Em seguida, aumente a potência do laser e pare o movimento de todos os sistemas de varredura para iluminar apenas uma linha fixa no centro do campo de visão. Depois, monte a fenda e alinhe-a utilizando o sinal de autofluorescência da solução de clareamento. Agora você deverá ver claramente a linha da fenda no centro do campo de visão.

Agora reative o sistema de varredura. Reduza a potência do laser e mova a amostra para dentro da folha de luz utilizando o sistema de micro posicionamento. Observe que a potência do laser utilizada com a fenda será maior do que aquela utilizada sem ela.

Como o filtro espacial bloqueia uma fração não desprezível de luz, ajuste a amplitude e o deslocamento dos sistemas de varredura e d varredura com o software de controle até que as imagens pareçam nítidas e brilhantes. Em seguida, defina o passo Z apropriado para o experimento e execute o software de aquisição de tomografia. O volume será imageado em várias pilhas paralelas e parcialmente sobrepostas, e as imagens serão salvas em uma estrutura hierárquica de pastas.

Para que o software de montagem funcione com um volume cúbico completo, complete o volume adquirido com imagens pretas sintéticas, ou seja, imagens do mesmo tipo e dimensões das coletadas, mas com intensidade zero, utilizando software automatizado. Em seguida, inicie o software VA A 3D com os plugins Terra, Stitcher e Tarly instalados e carregue o plugin Terra Stitcher. Selecione o diretório contendo o volume imageado e indique as orientações relativas dos eixos em relação a um sistema de coordenadas dextrógiro de referência e o tamanho do vóxel.

Agora inicie a primeira parte do empilhamento. O software calculará o deslocamento relativo entre pares de pilhas e encontrará uma colocação global ideal para todas as pilhas em conjunto, permitindo salvar o volume montado em resolução única ou em formato de múltiplas resoluções. A escada permite a visualização em múltiplas resoluções com o plugin tarly.

Em ambos os casos, se a imagem de maior resolução for maior do que alguns gigabytes, selecione também o modo de salvamento em múltiplas pilhas e especifique o tamanho das subpilhas individuais. Isso permitirá um acesso eficiente aos dados armazenados. Agora, inicie a segunda parte do alinhamento.

O software irá mesclar as pilhas alinhadas e salvá-las no modo de pilha única ou múltipla. Quando concluído, feche o plugin Terra Stitcher. Em seguida, carregue o plugin terra fly.

Selecione a pasta com o volume multicanal de múltiplas resoluções e indique o tamanho do poço e as orientações dos eixos. O volume será carregado na resolução mínima. Para aumentar a resolução, basta usar a roda do mouse.

Alternativamente, pode-se clicar duas vezes em um ponto específico da imagem ou selecionar o zoom em torno de uma referência existente ou especificar diretamente as coordenadas do volume de interesse. Para voltar ao zoom com resolução mais baixa, basta usar a roda do mouse. O protocolo descrito pode ser usado para reconstruir, com resolução na escala de micrômetros, cérebros inteiros de camundongos ou partes excisadas, sem a necessidade de seccionamento físico.

Como resultado representativo, é mostrado aqui o cerebelo inteiro de um camundongo L sete GFP no dia pós-natal 10 deste animal. Todos os neurônios do gene Perkin são marcados com EGFP. Após aumentar o zoom, pode-se observar a estrutura laminar típica do córtex cerebelar; um aumento adicional do zoom permite distinguir claramente o soma de cada célula burkini.

O protocolo descrito pode, portanto, ser utilizado para analisar a organização espacial neuronal em diversos estudos de neurodesenvolvimento. Como um segundo resultado representativo, aqui podemos observar imagens da seção UN do cérebro de uma coxa adulta, de um camundongo GFPM. Neste animal transgênico, a EGFP é expressa em um subconjunto neuronal esparsamente aleatório.

A metade direita do cérebro é mostrada aqui. À medida que aumentamos o zoom, os processos neuronais tornam-se distinguíveis. Esse resultado demonstra que o protocolo descrito permite a obtenção de imagens com resolução em escala micrométrica em cérebros inteiros de camundongos adultos, abrindo a possibilidade de estudar a anatomia de todo o cérebro em resolução celular.

Em modelos murinos de doenças neurodegenerativas, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de filtrar adequadamente a solução de desidratação e limpeza para preservar a fluorescência da GFP. A ferramenta de visualização multirresolução apresentada aqui também pode ser usada para explorar conjuntos de dados muito grandes obtidos com outras técnicas, como seccionamento óptico microscópico em tomografia.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como datar, classificar e tornar transparente o cérebro fixado de camundongo. Imagem com microscopia de folha confocal e visualize o volume reconstruído em 3D com realidade virtual utilizando o plugin Tely.