Name: A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a avaliar inibidores de tirosina quinase para leucemia aguda em modelos pré-clínicos. Este método utiliza Western blot, ensaios clonogênicos e imagem bioluminescente para confirmar inibição do alvo e eficácia terapêutica in vivo.

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Na imagem in vivo foi realizado com o recurso compartilhado IVIS na Universidade do Colorado Cancer Center (apoiada pela concessão P30-CA046934). A citometria de fluxo foi realizada no Resource Citometria de Fluxo Compartilhada, da Universidade do Colorado Cancer Center (apoiado pela concessão P30CA046934). Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (RO1CA137078 a DKG). ABLS é membro do Programa de Desenvolvimento Pediátrica Scientist, apoiada por doações da Academia Americana de Pediatria, a Sociedade Americana de Pediatria, eo Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (K12-HD000850) Eunice.

Todos os experimentos envolvendo animais seguiu as normas regulamentares aprovadas pela Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Colorado. O protocolo foi aprovado demonstrado pela Universidade do Comité Animal Care and Use Institucional Colorado. 1. Fosfo-proteína Western Blot <ol><li> Preparação de lisados <ol><li> Linhas de células de cultura que expressam o receptor tirosina-quinase de interesse. Células colheita e placa de 3-5 x 10 6 células / amostra em 400 mL meio de crescimento em um tecido de 48 poços cultura prato. Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2-3 horas. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de 5x TKI em meio de crescimento e incubar durante 60 min. </li><li> Preparar tampão de lise com 50 mM de HEPES (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glicerol, 1% (v / v) de Triton X-100 e inibidores da protease. Se as culturas não serão tratadas com pervanadato antes da colheita, adicionar inibidores de fosfatase (orthova de sódio 1 mMnadate e 0,1 mM de molibdato de sódio) para tampão de lise. </li><li> Prepare pervanadato (PV) solução do inibidor de fosfatase imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma solução de 0,3% de peróxido de hidrogénio (CUIDADO) em solução salina fria tamponada com fosfato (PBS), num tubo escuro em gelo (diluição 1:100 de uma solução de estoque de 30%). Ferve-se uma alíquota de 0,2 M de ortovanadato de sódio (OV, CUIDADO) solução estoque de 5 min. Diluir 1:10 em PBS para fazer uma solução 20 mM de OV, à temperatura ambiente (RT). Misture 0,3% de peróxido de hidrogénio e 20 mM de OV 1:1 e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Diluir PV em meio completo (60 + 940 mL PV médio mL). Adicionar 100 ul de PV diluído / poço. Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 3 min e, em seguida, colocar a placa em gelo. </li><li> Colher as células em tubos de microcentrífuga de frio a 2.500 rpm durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 120 ul de tampão de lise. Incubar em gelo durante 15 min. Clarificar o lisado numa microcentrífuga frio a 6000 rpm durante 3 min. Supe Transferirrnatant a um tubo de frio fresco. Armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Imunoprecipitação <ol><li> Girar proteína G sepharose contas em microcentrífuga a 1.000 rpm por 1 min. Remover o sobrenadante e lava-se os grânulos 2x com 1 ml de PBS gelado. Adicionar um volume igual de PBS para fazer uma pasta a 50%. Adicionar anticorpo primário e 20 mL de 50% proteína G contas para cada amostra. Incubar durante 2 horas - O / N a 4 ° C num rotor. </li><li> Pulso para baixo contas em uma microcentrífuga frio a 9.000 rpm. Remover o sobrenadante e lava-se os grânulos 2x com 150 ul de tampão de lise frio. Gire em microcentrífuga frio a 1.000 rpm por 1 min. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 20 mL 2X SDS Sample Buffer com 2-mercaptoetanol (CUIDADO). Use imediatamente ou armazenar a -80 ° C. </li><li> Amostras ferva por 5 min e correr em um gel de tris-glicina SDS-PAGE. Transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose e detecção de fosfo-proteína por western blot. </li><li> Lavar blot com água e, em seguida, incuba-se 2% de SDS, Tris 62,5 mM (pH 6,8), 0.1 H β-mercaptoetanol (CUIDADO) durante 30 min a 50 ° C. Lavar 2x com água e, em seguida, lavado por 60-90 min em 5-6 mudanças de TBS-T para remover a solução de decapagem. </li><li> Detectar-proteína total por Western Blot. </li></ol></li></ol> 2. Methylcellulose Assay <ol><li> Alíquota de 4 ml de meio base humana metilcelulose em 50 ml tubos cônicos usando um estéril grande furo de agulha sem corte final. (Nota:. Metilcelulose podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C. Descongelar à TA S / N antes de usar) </li><li> Adicionar 500 mL de 10x TKI ou veículo em meio de crescimento de 4 ml de metilcelulose e mistura em vórtice durante 10 seg. </li><li> Colheita e contagem de células. Prepara-se uma suspensão de células em meio de crescimento numa concentração, a qual é de 10x maior que a concentração celular final. Adicionar 500 ul de suspensão celular a mistura de metilcelulose. Vortex por 10 segundos e deixe descansar por 10 min para remover as bolhas. </li><li> Elaborar 4 ml de mistura de metilcelulose utilizando uma seringa de 5 ml e larg estérile suportou agulha fim brusco. Evite elaboração de bolhas. Repartir 1 ml da mistura de metilcelulose para o centro de três placas de cultura de tecidos de 35 mm. Agitar os pratos até que a parte inferior é completamente coberto com metilcelulose. </li><li> Para cada placa de metilcelulose, preparar um tecido estéril placa de cultura de 10 centímetros com duas placas de cultura de adicionais 35 milímetros de tecido cheios de água esterilizada para garantir um ambiente úmido. Colocar em culturas com camisa de água numa estufa a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 10-14 dias. </li><li> Contagem das colónias após 1-2 semanas. Colónias deve ser mais do que 20 células e não se sobrepõem. As colónias podem ser contadas utilizando um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio com uma grade ou utilizando um contador de colónias automatizado. Mudanças no tamanho ou morfologia da colónia em resposta ao tratamento com TKI também devem ser avaliadas. Para melhorar a detecção de pelo contador de colónias, as colónias de manchas pela adição de 60-100 ul de (3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazólio, brometo de solbuição (MTT 5 mg / ml em H2O, guardar a -20 ° C, protegido da luz, CUIDADO) gota a gota sobre a superfície de cada placa e incubou-se durante 8 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li></ol> 3. Agar Mole Ensaio <ol><li> Prepare 1% agar nobre para a camada inferior, 0,7% de ágar nobre para a camada superior e 2x meio de crescimento. Equilibrar meio de crescimento 2x em um banho de água a 42 C °. O calor a 1% e 0,7% de agar noble, em um forno de microondas (cerca de 1 min/100 mL) e equilibrar num banho de água a 42 ° C. Mistura de partes iguais de 1% de agar e meio 2x e, separadamente, 0,7% de agar e em meio 2x 50 ml conicals. Plano de 10 ml de agar suave mistura / seis bem-placa para cada camada. </li><li> Etiqueta de 6 placas de cultura de tecidos. Encher cada poço com 1,5 ml de 1% de mistura de agar mole. Evite bolhas durante plaqueamento. Secar as placas com tampas fora em capa de estéril para 30 min. </li><li> Contagem de células. Prepara-se uma suspensão de células em meio de crescimento numa concentração, que é 500 vezes mais elevada do que a de células final concentratina. Adicionar a suspensão de células de 0,7% de mistura de ágar, misturar bem e dispensar 1,5 ml da mistura de células de ágar sobre o topo da camada de agar a 1%. Deixe que a camada superior solidificar, durante 30 min. </li><li> Prepare meio de crescimento contendo 1x TKI ou o controle do veículo. Adicionar 2 ml de meio com a concentração desejada de TKI no topo da camada de agar de topo. </li><li> Incubar as culturas durante 10 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Remover e substituir o meio sobrepondo a cada 3 dias. </li><li> Quando as colônias são visíveis a olho nu, aspirado sobrepondo médio e adicione 200 mL solução de azul de nitro-tetrazólio (1 mg / ml NBT em H 2 O, armazenar a 4 ° C, protegido da luz, CUIDADO). Retornar para incubadora de 24-48 horas. Mover a 4 ° C durante pelo menos 2 horas antes da contagem. Placas coradas podem ser guardadas a 4 ° C durante um mês. Contagem das colónias utilizando um microscópio ou um contador de colônia automático. </li></ol> 4. Avaliação da Inibição Fosfo-proteína in vivo <ol><li> Colete cells crescimento em fase log por centrifugação numa centrífuga de mesa a 1500 rpm durante 5 min. Lave as células uma vez com PBS estéril, e ressuspender em PBS a uma concentração adequada (tipicamente de 1-5 x 10 7 células / ml). Transplante de células num volume de 100 ul em 6-12 semanas de idade, ratinhos NSG por injecção intravenosa na veia da cauda usando uma seringa de insulina de 28 L. Colocar o animal em um limitador, aqueça o rabo em um copo de água morna para dilatar as veias, e limpar o rabo com um cotonete de clorexidina antes da injeção. Após a injeção, aplicar pressão no local da injeção usando gaze estéril até parar o sangramento. Transplante pelo menos 3 animais / grupo. Manter a ratinhos em água contendo 1 mg / ml de sulfato de gentamicina. </li><li> Quatorze dias após o transplante, o tratamento de animais com TKI ou o veículo só e amostras de colheita para análise de inibição alvo. Pesar animais e trata-se com uma dose apropriada (mg / kg de peso corporal) de TKI ou veículo. Administrar tratamento em um volume de 5 ml / kg de massa corporal por via intraperitoneal (ip) de injecção ou 10 ml / kg de peso corporal, por sonda oral. Para injecção ip, conter o mouse manualmente e injetar no quadrante inferior direito do abdômen através de um G agulha 29. Para sonda oral, conter o mouse manualmente e manter o animal em pé. Colocar o tubo de gavagem na boca ao longo da língua e na parte posterior da boca. Aplique uma leve pressão para passar o tubo através do esôfago e no estômago. Pressione o êmbolo da seringa para administrar o tratamento. Se o êmbolo não deprime facilmente a agulha gavage devem ser removidos e reposicionados. Prepare formulações TKI imediatamente antes da utilização. </li><li> Se o tratamento com pervanadato for desejado, preparar a solução PV 20 min antes da colheita, tal como descrito acima (passo 1.1.4) e dilua em meio com 1 uM de MgCl 2 e 100 U / ml de DNase (120 ul PV + 880 ul de meio). Nota: PV permanece estável durante pelo menos 1 hora após a diluição. </li><li> Sacrifício de animais por CO 2 narcose no apvez (es) quado pós-tratamento. Dissecar fémur, removendo pele, pele e músculo de toda a perna, de modo que os ossos são completamente exposta. Retire os fêmures grampeando com dissecando tesoura, logo abaixo da articulação do quadril e novamente acima da articulação do joelho. Transfira para uma placa de Petri e medula óssea nivelada com 1 ml de PBS frio ou solução PV diluídos utilizando uma seringa e uma agulha G 27. Se o tratamento com PV, incubar à temperatura ambiente no escuro durante 10 min. </li><li> Prepare lisados ​​e analisar os níveis de fosfo-proteína e proteína total, como indicado acima (passos 1.1.6-1.2.5). </li><li> Quantificar fosfo-relativa de proteína e níveis das proteínas totais para cada amostra usando densitometria. Calcular em relação phospho-protein/total-protein para o valor médio phospho-protein/total-protein para animais tratados com veículo. </li></ol> 5. Avaliação da atividade anti-leucemia de TKI em todos os modelos Xenoenxerto <ol><li> Se necessário, expor ratos a 200 cGy de radiação em um irradiador RS-2000 um dia prior para transplante. Transplant ratinhos com linhas celulares de leucemia, tal como descrito acima (passo 4.1). Transplante de pelo menos seis ratos por grupo. Identificar os ratos por punção da orelha. Em alternativa, um marcador de preto podem ser utilizados para identificar os ratinhos com marcas de hash nas suas caudas. Adicionar enriquecimento de gaiolas para reduzir o potencial de agressão gaiola companheiro durante o estudo. </li><li> Tratar os ratos com um TKI ou apenas veículo como descrito acima (passo 4.2). Monitorizar o estado de saúde de ratos diariamente através do exame físico e determinação de peso. Sintomas esperados de leucemia (reduzido nível de atividade, perda de peso, paralisia dos membros posteriores, e infecções nos olhos). A perda de peso superior a 10% -15% é geralmente associada com a morte do rato dentro de dois dias e é tipicamente um terminal substituto para a morte, de acordo com requisitos da norma IACUC. </li><li> Monitore o enxerto e desenvolvimento de leucemia por meio de um sistema de imagem in vivo bioluminescência até 2x por semana. Prepara-se uma solução estoque de 200x D-luciferina (30 mg / ml) em Steriágua le. Misturar suavemente por inversão até D-luciferina está completamente dissolvido. Use imediatamente ou alíquota e congelamento a -20 ° C. Antes da imagiologia utilizando um sistema de imagem in vivo, a bioluminescência, descongelar alíquotas de D-luciferina à RT e dilui-se 1:02 em PBS para uma concentração final de 15 mg / ml e esterilizar filtro através de um filtro de 0,2 um. </li><li> Anestesiar os ratos antes de imagem com 1,5% de isoflurano inalado em oxigênio. Monitorar anestesia suficiente, caracterizada por relaxamento muscular, perda de movimento e perda de resposta à estimulação toe-pinch. </li><li> Imediatamente antes de imagem, administra 150 mg / kg de peso corporal de D-luciferina, por injecção ip (10 ul de 15 mg / ml de luciferina / g de peso corporal). </li><li> Use um sistema de imagem de bioluminescência in vivo para capturar duas séries de imagens com seqüenciais 30, 60 e 90 exposições SEC e uma imagem final com uma exposição sec 120. Depois de imagem, voltar camundongos em gaiolas e monitor para a recuperação da anestesia. Dependendo dointensidade de bioluminescência, tempo de exposição pode ser variada. Vezes a exposição ideal deve ser determinada para um determinado modelo e mantidos consistentes de tal forma que a intensidade de sinal para momentos individuais são comparáveis ​​ao longo de todo o estudo. </li><li> Determinar a intensidade de bioluminescência para cada rato usando Viver 3,2 aquisição e análise de software de imagem. Determine os valores totais de fluxo medidos em fótons / segundo por regiões de interesse (ROI) de tamanho idêntico em cada rato de desenho. </li><li> Sacrifício ratinhos por CO 2 a exposição e deslocamento cervical se moribundos, apresentando paralisia, no caso de mais do que 15% de perda de peso, ou no final do estudo. Dissecar camundongos e observações de discos (por exemplo, da ampliação do baço, fígado, ou linfáticos; pálido da medula óssea). Dissecar fêmures e medula óssea nivelada com PBS frio usando uma agulha G 27. </li><li> Recolher as células numa microcentrífuga a 2500 rpm durante 5 min. Ressuspender as células em PBS contendo 2% de FBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.Recolher as células e mancha com 20 mg / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato, 1:1000) e conjugados com FITC α-hCD45 (1:100) ou anticorpos IgG de ratinho de controlo de isotipo 1 (1:100) . Avaliar leucemia enxerto utilizando citometria de fluxo. Portão na população viável (DAPI negativo) e determinar porcentagem de células CD45 + (blastos da medula óssea%). </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics.+2010%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li>
<li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+childhood+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li>
<li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li>
<li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li>
<li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li>
<li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43%2C+phosphatase+inhibition%2C+and+thiol+reactivity+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li>
<li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+anticancer+agents%3A+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li>
<li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts%3A+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10(2013).</li>
<li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li>
<li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro%3A+malignant+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li>
<li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li>
<li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+a+strategy+for+preclinical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li>
<li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação de inibidores de tirosina-quinase novos no tratamento de leucemia aguda. Usando esta abordagem, as actividades bioquímicas e anti-leucémicas são avaliados pela primeira vez em ensaios baseados em células in vitro e, em seguida, em modelos de xenoenxerto in vivo. A análise por imunotransferência foi utilizado com êxito para demonstrar a inibição da tirosina quinase alvo em células de leucemia após o tratamento com inibidores da tirosina qui...

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia maligna mais comum em crianças 1,2. A taxa de sobrevida global para pediátrico ALL linhagem B (B-ALL) é de aproximadamente 85%, mas subtipos biológicos específicos, incluindo T-linhagem ALL (T-ALL), têm prognóstico ainda mais pobre, mesmo com protocolos terapêuticos atuais. A continuação do tratamento de recaída ALL continua sendo um desafio 3. Embora a maioria dos pacientes adultos com leucemia aguda alcançar uma remissão com antecipado quimioterapia, muitos doentes ainda sofrem de recaídas 4. Regimes de quimioterapia correntes no tratamento de leucemia aguda são conhecidos por causar efeitos colaterais de curto e de longo prazo associada a toxicidade. Portanto, terapias menos tóxicas que visam especificamente as células cancerosas com efeito mínimo sobre os tecidos normais são bastante necessárias. Nos últimos anos, a ênfase foi colocada no desenvolvimento do romance, os agentes molecularmente-alvo com especificidade para as células cancerosas, muitas vezes utilizando química iterativopara gerar vários compostos ativos que devem então ser comparados e priorizados 5. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase para o tratamento da leucemia aguda, o que pode ser utilizado para a avaliação de um único composto ou por comparação directa dos vários compostos, a fim de facilitar o desenvolvimento de drogas. O método aqui apresentado consiste em quatro etapas. Primeiro o bioquímico (1) e anti-leucemia (2) actividade do composto (s) são avaliados numa cultura de células, em seguida a inibição do alvo é confirmado em modelos animais (3), e, finalmente, a eficácia terapêutica dos inibidores da tirosina quinase (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos (4). Para estes estudos, é importante a escolha de linhas celulares relevantes, que são representantes dos subtipos biológicos mais comuns. As linhas celulares devem ser selecionados, o que ambos, expressar o alvo de interesse e falta o alvo de interesse, para investigar se os efeitos biológicos são mediated por inibição do alvo. Isto é particularmente relevante para o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas, as quais têm efeitos fora do alvo, que podem ser importantes para a actividade anti-tumoral. Também é necessário escolher uma linha de células que é dependente do alvo para efeitos funcionais, tais como a proliferação ou sobrevivência. Estudos de validação alvo preliminares (fora do âmbito deste artigo) com RNA de interferência ou de outros meios específicos para inibir o alvo pode ser usado para identificar linhas celulares dependentes de alvo. Também é desejável escolher linhagens de células que podem formar xenoenxertos de murino, de tal modo que os resultados da cultura de células pode ser mais directamente traduzidos para experiências in vivo. Para a avaliação da actividade bioquímica mediada por inibidores da tirosina quinase em células de leucemia, uma diminuição na fosforilação do receptor pode ser usado como um indicador de inibição alvo. Análise de ELISA ou Western blot ensaios podem ser empregues, dependendo da disponibilidade e da especificidade dos anticorpos.Se os anticorpos com uma especificidade suficiente para o alvo estão disponíveis, testes de ELISA são preferíveis uma vez que são mais quantitativa e eficiente. Nos casos em que os anticorpos com uma especificidade suficiente para o ELISA não estejam disponíveis, a análise de mancha de Western podem ser necessárias. Neste caso, a imunoprecipitação de uma grande quantidade de lisado pode ser útil para a detecção de alvos que se encontram em baixa abundância. Esta abordagem é particularmente relevante para a medição de proteínas de fosfo, que podem ter uma meia-vida curta para permitir mudanças rápidas na sinalização em resposta a estímulos ambientais. Algumas proteínas fosforiladas são extremamente lábil, provavelmente como resultado da formação de complexos com fosfatases. Para a detecção robusta e consistente destes proteínas fosforiladas, pode também ser possível tratar células com pervanadato, uma proteína-tirosina-fosfatase inibidor irreversível 6, para estabilizar a proteína fosfo antes para a preparação de lisados ​​de células inteiras. Paradeterminar se a actividade bioquímica resulta em efeitos anti-tumorais, os processos biológicos dependentes de alvo pode ser monitorizada em ensaios baseados em células. Para as linhas celulares de leucemia, a actividade anti-leucemia mediada por inibidores da tirosina quinase pode ser avaliada através de ensaios de formação de colónias em metilcelulose realizados em agar mole ou 7. Ágar mole podem ser preferidos como este é um meio sólido, que é mais fácil de manipulação, se o tratamento repetido com um TKI é necessário. Enquanto muitos leucemia myloid (AML) linhas de células agudas irá formar colónias em ágar mole, a maioria das linhas de células ALL apenas irá formar colónias em metilcelulose, que é um meio semi-sólido. Embora seja possível para refrescar médio e / ou inibidores da tirosina quinase, em culturas de metilcelulose, apenas pequenos volumes pode ser utilizado e com frequência limitado. Do mesmo modo, é mais difícil para corar colónias sem interromper los em metilcelulose. Estudos preliminares que define a capacidade de linhas de células adequadas para formar colónias em metilcelulose e / ou de agar mole e tele densidade ideal de células em cultura de tal forma que as colônias não são sobrepostos e em número suficiente para obter estatisticamente (geralmente 50-200 colônias por 35 milímetros placa) dados relevantes. Enquanto ensaios in vitro são robustos e de baixo custo, e têm menos implicações éticas do que as experiências com animais inteiros, avanço de compostos terapêuticos requer prova de eficácia e segurança em modelos animais. Para estudos in vivo, as linhas celulares de leucemia aguda humana pode ser transplantado para ortotopicamente NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) ratos e TKIs pode ser facilmente administrado por injeção ou por sonda oral. Algumas linhas de células podem exigir a exposição de ratos a uma dose NSG dependente da linha celular de baixo de radiação, a fim de estabelecer xenoenxertos, e, neste caso, os ratos não podem tolerar a administração por sonda oral, sem um período de recuperação de 5-10 dias pós-irradiação. Este manuscrito descreve geração de B-ALL e T-ALL xenografts usandolinhas celulares específicas (697 e Jurkat), como exemplos, mas pode ser estabelecido xenoenxertos em ratinhos NSG utilizando uma ampla variedade de linhas celulares. No caso em que outras linhas de células são mais aplicáveis, o requisito para a irradiação, o número óptimo de células para transplante, e tempo de aparecimento e progressão da doença deve ser determinada experimentalmente. Idealmente, estes modelos terão penetrância completa (todos os animais transplantados desenvolve leucemia), cinética consistentes (leucemia progride de forma semelhante em todos os animais), e uma janela de tratamento razoável (idealmente 20-30 dias entre o início do tratamento e remoção de estudo devido a doença) . O número de células transplantadas podem ser aumentados para melhorar a penetração e consistência cinética ou diminuída para melhorar a janela de tratamento, se necessário. Para determinar se TKIs mediar a inibição alvo in vivo, as amostras são coletadas de ratos com leucemia xenografts após o tratamento com TKI ou só veículo. Idealmente, a uma dosed esquema de administração para estas experiências são guiados por estudos farmacocinéticos, que muitas vezes podem ser realizados por laboratórios comerciais e estão fora do escopo deste artigo. Se estão disponíveis dados farmacocinéticos, a concentração de composto requerida para a inibição eficaz alvo em cultura de células e a concentração máxima no soro, após uma única dose de TKI pode ser utilizado para definir uma dose de partida para estudos com animais. Os estudos farmacocinéticos também pode informar o período de recolha de amostra de pós-tratamento para os estudos farmacodinâmicos e da via de administração. A inibição do alvo pode ser avaliada em qualquer órgão afectado, mas os tecidos que são mais facilmente recolhidas e processadas são preferíveis. Linhas de células de leucemia mais agudos estabelecer no fígado, medula óssea, o baço, o sangue periférico, e o sistema nervoso central, embora os órgãos específicos afectados e a extensão do enxerto de órgãos varia entre estes modelos. O protocolo aqui apresentado avalia fosfinibição o-proteína na medula óssea através da análise de western blot, mas órgãos sólidos pode ser mais fácil para a colheita de forma consistente e exigem o mínimo ou nenhum tratamento até à congelação, permitindo que menos oportunidade para a degradação de proteínas fosfo durante a coleta e processamento das amostras. A imuno-histoquímica pode ser usada para avaliar tumores sólidos ou de órgãos atingidos por leucemia. Finalmente, a eficácia terapêutica do TKI (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos. Para estes estudos, a temporização de início do tratamento pode ser variada, de modo a que a doença é mais ou menos estabelecido. O tratamento pode começar imediatamente após o transplante para os estudos iniciais e, em seguida, ser adiada em estudos subseqüentes, até que a carga da doença significativa é detectada a aproximarem mais um modelo de tratamento de diagnóstico. Idealmente, estes modelos animais também têm a capacidade de medição não invasiva da carga de doença. Nós otimizamos os métodos de introdução do lucifer vaga-lumegene ase em linhagens celulares de leucemia usando partículas semelhantes a vírus, permitindo a análise não-invasivo, longitudinal do início da doença e progressão e avaliação da carga de doença na medula óssea e órgãos sólidos. Crítico para esta abordagem é a utilização de linhas de células monoclonais etiquetados-luciferase para evitar a variabilidade no desenvolvimento de leucemia que expressam a luciferase associada com a utilização de linhas celulares policlonais e não está relacionada com o tratamento com um TKI de 8. Tomados em conjunto, estes passos podem ser utilizados para a avaliação de um único TKI ou por comparação direta e classificação de várias TKIs. Embora os protocolos aqui apresentados se concentrar no desenvolvimento de inibidores da tirosina quinase, estes métodos podem ser adaptados para outros objectivos e considerações para o desenvolvimento do ensaio são descritos. Assim, esta estratégia pode ser mais amplamente aplicável para a avaliação pré-clínica de agentes molecularmente-alvo para o tratamento de leucemia aguda.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Reagente/Material</forte></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>MP Biomedicals</td><td>#02194057</td><td>GHS05, GHS07, H302-H318</td></tr><tr><td>Ortovanadato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>#S6508</td><td>GHS07, H302+ H312+H332&nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M7522</td><td>GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ColonyGel Base Humana Média&nbsp;</td><td>ReachBio</td><td>#1101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brometo de 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT)</td><td>Sigma</td><td>#M5655</td><td>GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ágar Nobre Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>#214883</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de Azul de Nitrotetrazólio</td><td>Sigma</td><td>#N6639</td><td>GHS07, H302&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferina Firefly, Sal de Potássio</td><td>PerkinElmer</td><td>#122796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6- Di-hidrocloreto de diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma</td><td>#D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC CD45&nbsp;</td><td>BD Biociência</td><td>#347463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle de Isotipo IgG1 de Mouse FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>#51-35404X-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfato de Gentamicina</td><td>Sparhawk</td><td>#NDC58005-633-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibidores de Protease&nbsp;</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>#D4263</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Grânulos de Proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>#10-1242</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>VETONE</td><td>#NDC13985-030-60</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Equipamento</forte>Placas de</td></tr> <tr><td>cultura celular, diâmetro 35 mm &vezes; H 10 mm</td><td>Nunclon</td><td>#D7804-500EA&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, diâmetro 100 mm x&nbsp; A 20 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>#D8429-1CS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>BD Bioscience</td><td>#353046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulhas de ponta romba de 14 gauge x 4 polegadas</td><td>Ciência da cadência</td><td>#7956</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de 5 ml com luer-lok</td><td>BD Bioscience</td><td>#309646</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de colônias automatizado GelCount</td><td>Oxford Optronix</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>#IVIS200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Balanças portáteis Scout pro, balança</td><td>Ohaus</td><td>#SP202</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Limitador de roedores estilo Broome</td><td>Plas-labs</td><td>#551-BSRR&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Punção de orelha, diâmetro da punção: 2 mm</td><td>FST</td><td>#24210-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cotonetes de clorexidina, PDI prevantics</td><td></td><td>#B10800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de insulina 1 mL (40 unidades) 29 G x 1/2</td><td>Monoject</td><td>#8881500042</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulhas de alimentação de plástico para roedores (descartáveis) 20 ga x 38 mm, estéreis</td><td>Instech</td><td>#FTP-20-38</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa descartável Luer-Lok de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>#309628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de insulina Lo-Dose U-100 com 28 G x &frac12;, agulha permanentemente acoplada</td><td>BD Bioscience</td><td>#329465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de bonn extra fina</td><td>FST</td><td>#14084-08</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura fina para estudantes</td><td>FST</td><td>#91460-11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça ultra fina Moria</td><td>FST</td><td>#11370-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça de graefe extra fina</td><td>FST</td><td>#11150-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>FST</td><td>#10003-12</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>FST</td><td>#10011-00</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

As tirosina quinases receptoras tem sido implicado no desenvolvimento e progressão de muitos cancros, incluindo tanto a leucemia e tumores sólidos, e são alvos terapêuticos druggable atraentes. Aqui, descrevemos uma estratégia de quatro etapas eficiente para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase (nilotinibe e dasatinibe) no tratamento de leucemia aguda. Inicialmente, a análise de transferência de Western é usado para confirmar a inibição alvo em células de leucemia em cultura. A actividade funcional é então avaliada utilizando ensaios clonogénicos em metilcelulose ou culturas de agar mole. Os compostos experimentais que demonstram a actividade em ensaios de cultura de células são avaliados in vivo utilizando NOD-SCID-gama (NSG) ratinhos transplantados ortotopicamente com linhas de células de leucemia humana. Estudos in vivo farmacodinâmicos iniciais avaliar a inibição alvo em blastos de leucemia isoladas a partir da medula óssea. Esta abordagem é utilizada para determinar a dose e esquema de administração requerida para inibição alvo eficazião. Estudos subsequentes avaliar a eficácia do TKI in vivo utilizando células de leucemia que expressam a luciferase, permitindo assim a monitorização bioluminescente não-invasivo de carga da leucemia e de avaliação da resposta terapêutica usando um sistema in vivo de imagem de bioluminescência. Esta estratégia tem sido útil para a avaliação de inibidores da tirosina quinase, in vitro e in vivo, e pode ser aplicado para a identificação de agentes molecularmente-alvo com potencial terapêutico, ou para comparação directa e prioridades de vários compostos.

Os ensaios aqui apresentados avaliar os efeitos bioquímicos e funcionais mediados por TKI e pode ser utilizado para classificar novos compostos com base no grau de inibição alvo in vitro e in vivo, redução da formação de colónias, e atraso na leucemogênese em ratinhos NSG transplantado com luciferase etiquetado células de leucemia. A análise por imunotransferência foi utilizado para determinar a inibição da forma fosforilada activa da proteína alvo em células de leucemia após o trat...

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

O objetivo geral deste procedimento é a avaliação pré-clínica eficiente de inibidores da tirosina quinase para o tratamento da leucemia aguda. Isso é realizado primeiramente mediante análise sanguínea ocidental para confirmar a inibição do alvo em células leucêmicas cultivadas. O segundo passo consiste em avaliar a atividade funcional utilizando um ensaio clonogênico em metilcelulose ou soft agar.Em seguida, estudos farmacodinâmicos são utilizados para avaliar a inibição do alvo em blastos leucêmicos na medula óssea de camundongos transplantados com uma leucemia humana. Os dados resultantes são usados para determinar a dose e o esquema de administração necessários para uma inibição eficaz do alvo in vivo. Em última análise, essa estratégia é empregada para avaliar a eficácia terapêutica dos inibidores da tirosina quinase (TKIs) in vivo por meio de imagem bioluminescente.Esta estratégia foi projetada para identificar o melhor inibidor de tirosina quinase candidato para avanço ao ambiente clínico. Os procedimentos descritos neste vídeo podem ser utilizados para avaliar efetivamente inibidores de tirosina quinase in vitro e in vivo, a fim de identificar agentes direcionados com potenc

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.

Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

Aqui, apresentamos um protocolo para matrizes de anticorpos identificar alterações nas vias de sinalização em vários modelos de celulares. Estas mudanças, causadas por drogas/hipóxia/ultra-violet luz/radiação ou superexpressão/downregulation/nocautes, são importantes para vários modelos da doença e podem indicar se uma terapia será eficaz ou pode identificar mecanismos de drogas resistência.

Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Este protocolo descreve um método eficaz para quantificar a diferença no dano ao DNA induzido por inibidores do tipo I e tipo II em células mutantes FLT3 por meio da aplicação do ensaio cometa.

Ensaio cometa para quantificar danos ao DNA em células 32D que expressam mutantes FLT3 após exposição a inibidores de FLT3 tipo I e tipo II

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

O objetivo desta técnica é avaliar a função da serotonina neurotransmissora (5-HT) no animal vivo e respirando sem a ressonância magnética farmacológica (phMRI) e um desafio intravenoso com um inibidor seletivo da recaptação da serotonina (ISRS), a fluoxetina.

O Uso de desafio-Farmacológicas fMRI em pesquisa pré-clínica: aplicação ao sistema 5-HT

Estabelecer um modelo de tumor de bexiga ortotópico para avaliar os efeitos antitumorais de sarna intravesical entregue e acompanhamento do crescimento tumoral por ultra-som e de imagem de bioluminescência.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Aprenda a avaliar inibidores de tirosina quinase para leucemia aguda em modelos pré-clínicos. Este método utiliza Western blot, ensaios clonogênicos e imagem bioluminescente para confirmar inibição do alvo e eficácia terapêutica in vivo.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

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