Name: Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a medir atividade de exonuclease usando ensaio baseado em fluorescência com substratos de DNA marcados. Este método reprodutível e seguro permite analisar preferências de substrato e atividade enzimática de nucleases como DmWRNexo.

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Agradecemos ao Programa New Dynamics of Ageing pelo financiamento deste trabalho [ES/G037086/1] e ao Prof. Dave Sherratt (Departamento de Bioquímica, Universidade de Oxford) pelo acesso ao Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A determinação da atividade da exonuclease de proteínas purificadas requer a análise dos produtos de clivagem do DNA. A clivagem sequencial do DNA por exonucleases pode ser visualizada pela separação de produtos de clivagem marcados em géis de acrilamida. Historicamente, isso envolvia a marcação final do substrato de DNA com um radiomarcador (por exemplo, 32P ou 35S), mas com as desvantagens inerentes ao uso do radiomarcador (custo, questões de segurança e instabilidade ao longo do tempo). ...

As nucleases desempenham um papel vital nas células na remoção de DNA danificado, resolvendo estruturas não duplex, como junções de Holliday, e fornecendo capacidade de revisão durante a replicação do DNA, tanto intrínseca às DNA polimerases quanto extrínseca a elas1. As nucleases podem atuar degradando sequencialmente o DNA de extremidades livres (exonucleases) ou clivando ligações fosfodiéster internas dentro de uma molécula de DNA mais longa (endonucleases). A perda da atividade da nuclease pode resultar em fenótipos de instabilidade do genoma altamente específicos. Enquanto a mutação do BLM, membro da família RecQ helicase, resulta em taxas excessivamente altas de troca de cromátides irmãs e taxas de câncer globalmente elevadas (revisado por Payne e Hickson2), a mutação da proteína WRN altamente relacionada leva ao envelhecimento prematuro3; a principal diferença significativa entre esses dois membros da família é a presença de um domínio de exonuclease 3'-5' com WRN4. Evidências de um papel crítico da exonuclease WRN na manutenção da estabilidade do genoma se acumularam a partir da análise de genótipos em pacientes com WS5, juntamente com estudos de mutação pontual e deleção em células humanas, apoiados por estudos cristalográficos do domínio isolado da exonuclease6. No entanto, a cooperação e a conversa cruzada entre a atividade de exonuclease do WRN e sua atividade de helicase central7 tornam difícil separar a funcionalidade de cada um e suas contribuições relativas para a estabilidade do genoma. Em plantas e animais metazoários inferiores, a atividade da exonuclease WRN está presente em um único polipeptídeo sem atividade helicase8-10 (revisado em Cox e Boubriak11); foi demonstrado bioquimicamente em Arabidopsis que esta exonuclease atua de forma coordenada com o cognato WRN helicase, reconstituindo efetivamente as atividades enzimáticas combinadas observadas no vertebrado WRN9. Estudamos a exonuclease WRN em Drosophila, uma vez que as excelentes ferramentas genéticas permitem a análise do impacto da mutação da exonuclease (sem impactar na helicase cognata presuntiva) em todo o nível do organismo e ao longo do desenvolvimento10,12. Além disso, clonamos, expressamos e purificamos a exonuclease recombinante Drosophila WRN (DmWRNexo), permitindo uma análise bioquímica completa de suas propriedades enzimáticas13,14.
A análise de nuclease in vitro tem sido tradicionalmente conduzida usando oligonucleotídeos radiomarcados, avaliando a degradação procurando a escada de produtos em géis de acrilamida4,8,15. Embora sensíveis, esses ensaios não são quantitativamente reprodutíveis no dia-a-dia devido ao decaimento radioativo dos substratos marcados. Além disso, o manuseio e o descarte de reagentes radioativos representam problemas ambientais e de saúde significativos; O fornecimento de radiomarcadores também está se tornando cada vez mais problemático. Um método alternativo recente avalia a quantidade do produto final de degradação por espectrometria de massa16. No entanto, é demorado (leva vários dias), requer equipamento especializado e a leitura é a quantidade de produto final (nucleotídeo único), portanto, não é adequado para medição sensível de aspectos como processividade enzimática ou para determinar se alguns nucleotídeos, sequências ou modificações levam à pausa ou parada da nuclease. Para superar esses problemas, adaptamos os ensaios tradicionais baseados em gel para uso com substratos de oligonucleotídeos fluorescentes, gerando substratos marcados de forma estável que podem ser usados de forma reprodutível por longos períodos de tempo e, assim, permitir a comparação direta das atividades da nuclease sob diferentes condições.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos personalizados</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>É necessário obtê-los em alta pureza por exemplo com purificação PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Solução de acrilamida</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>CUIDADO: neurotoxina potente, portanto, luvas devem ser usadas o tempo todo</td></tr><tr><td>Colunas His-Trap (1 ml)</td> <td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Todos os outros reagentes</td><td>qualquer fornecedor</td><td></td> respeitável <td>Grau de biologia molecular é necessário (livre de DNase); tubos de microcentrífugas da mesma forma devem ser livres de DNase e RNase<</td></tr>td colspan="4">EquipmentHoefer SE400 aparelho de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo e fluorescência <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leitor</td> de imagens <td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar dmwrnexo, ortólogo da exonuclease wrn progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease está envolvida na resolução de danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA ou após a exposição a genotoxinas endógenas ou exógenas. É provável que desempenhe um papel na prevenção do acúmulo de intermediários recombinogênicos que, de outra forma, se acumulariam em garfos de replicação transitoriamente paralisados, consistente com um fenótipo hiper-recombinante de células sem WRN. Em humanos, o domínio exonuclease compreende uma porção N-terminal de uma proteína muito maior que também possui atividade helicase, juntamente com locais adicionais importantes para a interação DNA e proteína. Em contraste, em Drosophila, a atividade da exonuclease do WRN (DmWRNexo) é codificada por um locus genético distinto da helicase presuntiva, permitindo a dissecação bioquímica (e genética) do papel da atividade da exonuclease nos mecanismos de estabilidade do genoma. Aqui, demonstramos um método fluorescente para determinar a atividade da exonuclease WRN usando DmWRNexo recombinante purificado e oligonucleotídeos fluorescentes marcados com extremidade. Este sistema permite maior reprodutibilidade do que os ensaios radioativos, pois os oligonucleotídeos do substrato permanecem estáveis por meses e fornece um método mais seguro e relativamente rápido para análise detalhada da atividade da nuclease, permitindo a determinação da polaridade, processividade e preferências de substrato da nuclease.

Realizar a análise in vitro de atividade exonucleásica exige diversos passos preparatórios além da análise propriamente dita. Um resumo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.
Antes de realizar ensaios de exonuclease baseados em fluorescência, é fundamental otimizar a detecção do substrato oligonucleotídico marcado fluorescentemente após a separação em géis de uréia-acrilamida, utilizando um sistema de imagem fluorescente apropriado. A escolha do filtro é extremamen...

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Este experimento utiliza um ensaio baseado em fluorescência robusto e reprodutível para determinar a atividade exonucleásica. Incube a enzima purificada com o substrato de DNA fluorescente para permitir que a enzima degrade o DNA sequencialmente. Em seguida, resolva o DNA em um gel de acrilamida com ureia para separar os produtos de degradação por tamanho.Em seguida, utilize a imagem de fluorescência para identificar e quantificar o grau de atividade exonucleolítica. Os resultados analisados podem determinar as condições de reação preferenciais do substrato, bem como a atividade processiva e geral da enzima. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas baseadas em radioatividade é que os substratos de DNA são estáveis por longo período, permitindo excelente reprodutibilidade, redução de custos e maior segurança.Primeiro, ajuste o lisado bacteriano a 20 milimolar de ole, utilizando um volume apropriado de uma solução estoque de emit ole 2 molar. Em seguida, ajuste o volume para pelo menos um mililitro utilizando ole de lavagem 20 milimolar, uma coluna hist trap de um mililitro com 10 mililitros de água milli Q. Em seguida, equilibre a coluna com 10 mililitros de ole 20 milimolar.Em seguida, carregue o lisado na coluna; à medida que o lisado é carregado na coluna, pode-se observar uma pressão reversa significativa. Isso é perfeitamente normal. Não se sinta tentado a aplicar força excessiva à seringa e mantenha uma pressão constante e uniforme.É comum observar uma leve mudança de cor à medida que o lisado entra na coluna. Colete o fluxo que passa em um frasco estéril tipo biju com capacidade de sete mililitros e mantenha em gelo. Em seguida, lave a coluna com 10 mililitros de emitol a 20 milimolar.Agora, passe cinco mililitros de iole 40 milimolar pela coluna. Observe cuidadosamente o êmbolo da seringa para medir as frações de um mililitro que são coletadas em cada um dos tubos microfuga. De forma semelhante e sequencial, passe cinco mililitros de cada concentração de iole e colete cinco frações de um mililitro a cada vez.Analise as frações por dot blot e detecção com um anticorpo anti-hiss conjugado à HRP. Para identificar as frações de pico. Mantenha todos os reagentes a quatro graus Celsius, alíquota o mix mestre em tubos Microfuge estéreis, livres de DNA, de 0,5 mililitro; inclua também um controle sem enzima para visualizar o substrato inicial.Agora ajuste um bloco de aquecimento à temperatura apropriada para a atividade da enzima. Prepare um IDE contendo solução de parada e armazene-o em temperatura ambiente. Organize o espaço de trabalho próximo ao bloco de aquecimento, incluindo os reagentes finais a serem adicionados à reação.Misture uma pipeta de um a dez microlitros com ponteiras, um cronômetro, um suporte para criotubos ou um balde de gelo e a solução de parada. Inicie o cronômetro ao adicionar a enzima ao primeiro tubo e coloque o tubo no bloco térmico. Continue adicionando enzima aos demais tubos em intervalos de 15 segundos e coloque os tubos no bloco térmico conforme o cronômetro atingir o tempo correto.Adicione 10 microlitros de solução de parada à primeira amostra e homogeneíze por pipetagem. Coloque imediatamente no gelo. Continue interrompendo as reações nos intervalos de tempo apropriados e na mesma ordem em que foram preparadas, de modo que cada reação tenha exatamente o mesmo tempo de incubação. Carregue metade ou a totalidade de cada amostra em um gel de acrilamida. Adicione uma vez a solução de parada contendo corante em uma ou mais das pistas para verificar como o gel está sendo corrido.Após a eletroforese, remova os espaçadores e uma placa do gel. Enxágue e limpe cuidadosamente a placa do gel para remover vestígios de uréia precipitada. Posicione a placa com o gel voltado para baixo sobre o espaço de vidro do suporte do gel e coloque-o no leitor, se necessário.Observe as coordenadas do gel sobre o vidro. Abra o software apropriado e digitalize a região indicada da área de digitalização utilizando as condições detalhadas no protocolo do texto. Recorte a imagem e comprima os dados.Se necessário, salve e exporte como um arquivo para análise. A realização de análise in vitro da atividade exonucleásica exige uma série de etapas preparatórias. Além da análise propriamente dita para esses ensaios exonucleásicos baseados em fluorescência, é fundamental otimizar a detecção do sistema de imagem de fluorescência.Por exemplo, um substrato de oligonucleotídeo marcado com fluoresceína requer um filtro que permita a excitação em 470 nanômetros e a emissão em 520 nanômetros. Utilizando este filtro, é possível aumentar a capacidade de detectar baixas concentrações de substrato ou produto ajustando tanto a sensibilidade quanto a resolução do sistema de imagem. Observe que há alguma tolerância em relação à largura de banda do filtro.Como uma escolha subótima de filtro ainda permite a detecção parcial do substrato, embora com sensibilidade muito menor. Uma combinação apropriada da concentração do oligonucleotídeo marcado e das configurações do sistema de imagem pode resultar em detecção robusta do substrato. Isso é importante porque os produtos de degradação após incubação com uma exonuclease ativa estarão presentes em quantidades menores em cada banda, já que o substrato foi fragmentado sequencialmente.Um ensaio de exonuclease bem-sucedido causará degradação do substrato sequencialmente em direção à quatro, resultando em um padrão característico em escada de DNA no gel, representativo da degradação por exonuclease. Uma vez otimizado para detecção, o ensaio pode ser utilizado para detectar atividades diferenciais tanto qualitativa quanto quantitativamente.Por exemplo, pode-se determinar a presença ou ausência de atividade em mutantes de nucleases em comparação com a proteína do tipo selvagem. Diferentes substratos também podem ser testados quanto à sua capacidade de serem degradados pela nuclease. Em investigação.Este ensaio in vitro pode ser utilizado para testar a especificidade do substrato e o processo de uma nucleasse de interesse.

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Um Ensaio de Exonuclease Baseado em Fluorescência para Caracterizar DmWRNexo, Ortologo da Exonuclease WRN Progeróide Humana, e Sua Aplicação a Outras Nucleases

Estudos de genética em leveduras podem ser empregadas para investigar as funções de celular e molecular dos genes humanos no metabolismo do DNA celular. Métodos são descritos para a caracterização genética do ser...

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Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

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As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

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Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

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Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.

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Aprenda a medir atividade de exonuclease usando ensaio baseado em fluorescência com substratos de DNA marcados. Este método reprodutível e seguro permite analisar preferências de substrato e atividade enzimática de nucleases como DmWRNexo.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

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