Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica
10 de outubro de 2013
Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.
O objetivo geral deste procedimento é analisar várias proteínas em amostras de saliva humana usando matrizes fluorescentes baseadas em microesferas. Primeiro, codifique as microesferas com diferentes quantidades de dois corantes fluorescentes. Acople os anticorpos de captura para diferentes proteínas nas microesferas codificadas.
Em seguida, monte o microarray de proteína multiplexado no feixe de fibra óptica usando os imunoensaios imprensados no ensaio de microarrays montados para várias proteínas nas amostras de saliva de teste. Em última análise, a análise por microscopia de fluorescência pode medir as respostas de sinal de diferentes proteínas nas amostras de saliva. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes como o de Eliza é que ela permite a análise simultânea de várias proteínas em biofluidos complexos.
Embora esse método possa fornecer informações sobre a análise da saliva humana, ele também pode ser aplicado a outras biogripes, como urina sérica e escarro. Pesar o TTA de ópio em um frasco de vidro âmbar e preparar uma solução estoque de 200 milimolares em tetra hidro Furina. Misture suavemente pipetando e verifique visualmente se o corante está completamente dissolvido.
Da mesma forma, prepare uma solução estoque de 12 milimolares de cumarina 30 misturada suavemente por pipetagem. Visualmente. Verifique se o D está completamente dissolvido em vórtice para suspensão de microesferas e, em seguida, transfira 60 microlitros para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para lavar as microesferas, adicione 600 microlitros de PBS misturados por pipetagem 20 vezes e centrifugue a 10.000 RPM por três minutos.
Após três lavagens com solução de tetra hidrofurina, remova o sobrenadante, ressuspenda o palato em 600 microlitros de solução de trabalho e transfira a mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Sele o tubo da microcentrífuga com filme e coloque-o em uma coqueteleira. Proteja-o da luz cobrindo com papel alumínio.
Adicione 200 microlitros de suspensão de microesferas codificadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com trava segura. De forma gota a gota, adicione 150 microlitros, uma solução EDC recém-preparada Adicione imediatamente 150 microlitros de solução de sulfa NHS. Misture bem pipetando e verifique se a suspensão é homogênea.
Tampe o tubo, sele-o com paraforma e coloque-o em um shaker. Proteja-o da luz cobrindo com papel alumínio. Após três lavagens de P-B-S-S-D-S buffer reus, suspenda o pellet em 200 microlitros de mistura de buffer P-B-S-S-D-S.
Em seguida, transfira a solução para 300 microlitros de tampão P-B-S-S-D-S contendo 60 microgramas de anticorpos de captura. Misture 50 microlitros de cada tipo de microesferas de captura de proteína em um novo tubo de microcentrífuga de autoclave. Centrifugue o pool de microesferas de estoque a 7.000 RPM por três minutos e remova todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante.
Agora corte à mão feixes de fibra óptica com aproximadamente cinco centímetros de comprimento, polir sequencialmente ambas as extremidades usando filmes de lapidação de diamante. Em seguida, sonicar o feixe polido em água deionizada por dois minutos. Para remover quaisquer partículas, coloque uma pequena barra de agitação magnética em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.
Adicione 400 microlitros de tampão PBS livre de proteína e mexa em uma placa de agitação magnética por 30 minutos. Para remover bolhas de ar, grave uma extremidade do feixe de fibras polidas em uma solução de cloreto de hidrogênio normal 0,025 por 150 segundos. Mergulhe e sonice imediatamente o N gravado em água deionizada por um minuto.
Em seguida, seque os feixes de fibras com ar comprimido, monte o feixe de fibras em um suporte de fibra e bloqueie a extremidade gravada no buffer PBS livre de proteína sem bolhas por uma hora, deposite um quadrilátero ALI de um microlitro da suspensão de microesferas armazenada na extremidade gravada do feixe de fibra óptica. Proteja a configuração da luz com uma caixa embrulhada com papel alumínio. Após 15 minutos, o volume da suspensão diminuirá por evaporação e forçará as microesferas para dentro dos micropoços gravados.
Use um cotonete saturado com sample solução para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. Para deixar o microarray de proteína pronto para uso, adicione 200 microlitros de solução de amostra em um tubo de microcentrífuga de autoclave de 0,5 mililitro. Mergulhe o microarray de proteínas carregado na fibra na solução e coloque em um shaker.
Proteja da luz cobrindo com papel alumínio. Em seguida, mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga de autoclave contendo 200 microlitros de tampão de lavagem e agite a 600 RPM por dois minutos. Agora incube o microarray em uma solução de 100 microlitros de um coquetel de anticorpos de detecção contendo anticorpos de detecção biotinilados e um tampão de bloqueio de PBS por 30 minutos.
À temperatura ambiente no escuro, limpe a extremidade distal do feixe de fibras com um cotonete saturado com etanol absoluto. Em seguida, seque ambas as extremidades da fibra com ar comprimido, monte a fibra em um microscópio epifluorescente e obtenha a imagem através da extremidade distal da fibra, adquira as imagens da microesfera correspondentes às intensidades de emissões fluorescentes do ópio TTAC 30 e SAP. As imagens de codificação de sete tipos de microesferas são mostradas aqui.
Dois níveis de intensidade são observados na imagem de codificação UTTA, que representam microesferas codificadas com diferentes quantidades de matriz UTTA Resultados semelhantes são observados na imagem de codificação C 30. A análise de imagem MATLAB permite o cálculo das intensidades de fluorescência de diferentes microesferas na imagem do sinal. Os resultados da decodificação são mostrados na figura 2D sete.
Diferentes microesferas são decodificadas com sucesso. As microesferas não mostram resposta quando incubadas com tampão de ensaio. Quando incubado com amostras de saliva humana, são observadas respostas fluorescentes significativas.
Para uma melhor comparação, os contrastes nessas duas figuras foram ajustados para o mesmo nível. Uma vez dominado, este método permite a análise reprodutível de diferentes proteínas nas amostras de saliva humana. Os resultados de três detecções independentes na mesma amostra são mostrados.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um microraio de proteína multiplex baseado em microesferas e usá-lo para análise de biofluidos complexos. Seguindo este procedimento. Outros biomarcadores proteicos em diferentes biofluidos complexos também podem ser analisados.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para análise de proteínas salivares utilizando arranjos de anticorpos baseados em microesferas multiplexadas. O método permite a análise simultânea de múltiplas proteínas em amostras de saliva humana, ampliando as capacidades dos ensaios tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Proteômica
Contexto
- A saliva contém uma variedade de proteínas que podem fornecer informações sobre saúde e doença.
- Métodos tradicionais como ELISA são limitados à análise de uma única proteína por vez.
- Ensaios multiplexados podem melhorar a eficiência e a riqueza dos dados.
- A tecnologia de microesferas fluorescentes oferece uma abordagem inovadora para a detecção de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para analisar múltiplas proteínas na saliva simultaneamente.
- Ampliar a sensibilidade e especificidade da detecção de proteínas em biofluidos complexos.
- Fornecer uma alternativa mais eficiente aos ensaios existentes de analito único.
Métodos Utilizados
- Codificação de microesferas com corantes fluorescentes.
- Ligação covalente de anticorpos de captura às microesferas.
- Montagem de microarranjos proteicos multiplex em feixes de fibras ópticas.
- Uso de imunoensaios fluorescentes em sanduíche para detectar proteínas em amostras de saliva.
Resultados Principais
- O método detectou com sucesso múltiplas proteínas em amostras de saliva.
- A microscopia de fluorescência forneceu respostas de sinal claras para diferentes proteínas.
- A técnica demonstrou vantagens em relação aos métodos tradicionais de ELISA.
- Os resultados indicam aplicações potenciais em diagnósticos clínicos.
Conclusões
- Essa abordagem multiplexada permite a análise eficiente de proteínas salivares.
- O método pode facilitar uma melhor compreensão de diversas condições de saúde.
- Estudos futuros podem expandir a aplicação dessa técnica em outros biofluidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise multiplexada de proteínas em biofluidos complexos, como a saliva, aborda um gargalo crítico na descoberta de biomarcadores, onde ensaios tradicionais de plexo único limitam a produtividade e aumentam o consumo de amostras. Esta matriz de microesferas baseada em fibra óptica permite a quantificação simultânea de múltiplas proteínas salivares, melhorando a eficiência do ensaio e apoiando a validação precoce de alvos na pesquisa de doenças neurodegenerativas e inflamatórias. Ao fornecer leituras quantitativas e reprodutíveis a partir de amostras clínicas limitadas, o método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos promissores e nos fluxos de trabalho de desvio de riscos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição simultânea de múltiplos biomarcadores proteicos salivares em amostras relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Reduz os requisitos de volume de amostra e os prazos dos ensaios por meio da detecção paralela de proteínas em um único fluxo de trabalho.
- Valor Preditivo: Apoia o desenvolvimento de painéis de biomarcadores e a validação funcional de alvos ao correlacionar respostas multianalíticas com desfechos fenotípicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras padronizadas e quantitativas de fluorescência para seis proteínas utilizando microesferas codificadas, permitindo desempenho reprodutível do ensaio entre diferentes execuções.
- Valor Operacional: Facilita a padronização do ensaio por meio da imobilização em feixe de fibras ópticas e algoritmos automatizados de decodificação, reduzindo a variabilidade dependente do operador.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma para outros fluidos biológicos (soro, urina, escarro), conforme mencionado na transcrição, ampliando sua utilidade além da saliva.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas e fluxos de trabalho pré-clínicos ao fornecer dados clinicamente relevantes sobre proteínas salivares que podem informar modelos mecanicistas.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite análise em nível de vias por meio da detecção multiplexada, reduzindo ambiguidades nas avaliações do engajamento do alvo e da resposta biológica.
- Confiabilidade Preditiva: Oferece respostas de sinal quantitativas baseadas em fluorescência que apoiam decisões de avanço ou interrupção no estágio inicial de desenvolvimento pré-clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até o desenvolvimento de ensaios e estudos mecanicistas pré-clínicos, especialmente para programas orientados por biomarcadores nas áreas de neurologia e inflamação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a medição simultânea de múltiplas proteínas salivares associadas a estados patológicos.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da codificação padronizada de microesferas, montagem de matriz de fibra óptica e quantificação baseada em fluorescência compatível com imagem de alto conteúdo.
- Análise: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (intensidade de fluorescência por tipo de microesfera) que permitem comparação entre condições experimentais e grupos de amostras.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de biomarcadores salivares relevantes para doenças que refletem processos fisiopatológicos sistêmicos ou locais.
- Reutilização Corporativa: Codifica uma plataforma adaptável baseada em microesferas aplicável a múltiplos biofluidos complexos, apoiando a padronização entre projetos e o compartilhamento de reagentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio da detecção multiplexada e quantitativa de proteínas em biofluidos nativos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio da imobilização em fibra óptica e decodificação algorítmica, reduzindo o ruído técnico.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao maximizar o rendimento de dados por amostra e permitir o reuso em diferentes programas de biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer perfis multianalíticos que orientam decisões relacionadas a mecanismos e segurança.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em codificação de microesferas, conjugação de anticorpos e microscopia de fluorescência para configuração e otimização bem-sucedidas do ensaio.
- Depende de infraestrutura de microscopia de fluorescência e análise de imagens baseada em MATLAB para aquisição de sinais e decodificação.
- Necessita padronização entre equipes dos procedimentos de preparação de microesferas, manuseio de fibras ópticas e protocolos de ensaio para garantir reprodutibilidade entre diferentes locais.
- A adaptação a outros sistemas modelo (por exemplo, soro, urina) exige nova validação da estabilidade da codificação e do desempenho dos anticorpos em matrizes diferentes.
- Limitações práticas incluem possível vazamento de microesferas dos micropoços e variabilidade de sinal devido à lavagem incompleta ou evaporação durante a montagem do arranjo.
