Name: Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a analisar múltiplas proteínas na saliva humana usando microesferas fluorescentes e imunoensaios sanduíche em feixes de fibra óptica. Este método multiplexado oferece maior eficiência que ELISA tradicional.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 08UDE017788-05). EBP também reconhece o apoio da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT). Os autores agradecem a Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti para a leitura crítica do manuscrito.

<img alt="Figura 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figura 1. . Fluxo de trabalho para aplicar matriz anticorpo microesfera de fibra óptica para a saliva de perfis (1) As microesferas são internamente codificado com dois corantes fluorescentes, (2) as microesferas codificados são externamente modificada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína, (3) as microesferas multiplexados são misturados, e (4) depositado aleatoriamente em micropoços gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas, (5) as proteínas salivares são capturados por microesferas através de imunoensaio de sanduíche, e (6) quantificados por microscopia de fluorescência. 1. Microesferas Encoding <ol><li> Pesar európio de sódio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 200 mM em tetra-hidrofurano (THF). Misture delicadamente por pipetagem; verificar visualmenteo corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 12 mM em THF. Misturar suavemente por pipetagem; visualmente verificar o corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Prepare a 700 ul de solução de trabalho para cada tipo de microesfera utilizando as soluções de reserva e de THF para atingir uma concentração final na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de microsferas (10% w / v) são bem suspensas por vórtice, e depois transferir a suspensão de 60 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 600 mL PBS a suspensão de microesferas e misture pipetando 20x. Centrifuga-se o tubo a 10.000 rpm durante 3 min e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repetir este processo mais 2x para lavar as microsferas. </li><li> Lava-se a pelete 3x com microesferas de THF utilizando um procedimento semelhante ao passo 1.5. </li><li> Centrifugar a suspensão de microsferas / THF a 10.000 rpm, durante 3 min, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento em 600 ulSolução de trabalho de listados na Tabela 1. Transferir a mistura para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. </li><li> Selar o tubo de microcentrífuga com Parafilm e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 3.000 rpm e incubar por 24 horas, proteger da luz, cobrindo a instalação usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete. </li><li> Remover a solução de corante sobrenadante, lavar as microesferas 6X com 600 ul de metanol e em seguida com 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20, um outro 6x, tal como descrito na etapa 1.5. </li><li> Armazenar as microesferas codificadas em 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20 a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do tipo de microesfera: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (mM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. As concentrações de Eu-TTA e C30 soluções de trabalho. 2. Preparação de microesferas de captura de Proteína <ol><li> Preparar tampão MES [2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES) 0,1 M, NaCl a 0,9%, SDS a 0,01%, pH 5,7] e tampão PBS / SDS (fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS a 0,01%, pH 7,4) com antecedência à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 200 mL de suspensão de microesferas codificadas (contendo ~ 2 mg de microesferas) em um Safe-Lock 1,5 ml tubo de microcentrífuga. É importante a utilização deste tipo de tubo de microcentrífuga para evitar o derrame durante a incubação no passo 2.6. </li> &lt;li&gt; Lavar as microesferas com 600 ul de tampão MES 3x como descrito na etapa 1.5. Adicionar 700 ul de MES para o pellet de microsferas e misturar bem por pipetagem. </li><li> Prepare a 0,105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, MW = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxissulf (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluções em tampão MES em tubos separados. </li><li> Adicionar 150 ul de solução recém-preparada de EDC, gota a gota, à suspensão de microesferas. O EDC hidrolisa muito rapidamente, pelo que é essencial para utilizar feita recentemente solução para assegurar a eficiência de imobilização. Imediatamente após a adição de EDC, adicionar 150 ul de solução de sulfo-NHS para as microesferas, misturar bem por pipetagem e verificar se a suspensão homogénea. </li><li> Tampe o tubo, selá-lo com Parafilm, e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 1.500 rpm, durante 4 horas, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar as suspens microesferasion a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul de PBS / SDS 3x tampão como descrito no passo 1.5. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão PBS / SDS ao precipitado, as microesferas misturar bem e transferir a solução para 300 ul de tampão PBS / SDS contendo 60 ug de anticorpos de captura. É importante para suspender o sedimento de microsferas primeiro e, em seguida, adicionar a suspensão de microesferas para a solução de anticorpo. </li><li> Incubar a mistura de anticorpos-microesferas agitando a 1.500 rpm, durante 4 horas em um shaker, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul StartingBlock (TBS) bloqueando 3x tampão, como descrito no passo 1.5. </li><li> Misturar microesferas com 1 ml de TBS tampão de bloqueio e incubar microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora, num agitador, proteger da luz usando um enseada caixavermelho com folha de alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Lava-se a pelete 3x com 500 ul de TBS tampão de bloqueio, como descrito no passo 1.5. </li><li> Centrifugar a solução de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Adicionar 500 mL de TBS tampão de bloqueio e misture por pipetagem. </li><li> Armazenar a suspensão de microesferas modificadas a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li><li> Repita este procedimento para fazer outros tipos de microesferas utilizando anticorpos correspondentes. </li></ol> 3. Assembléia Microarray de fibra óptica <ol><li> Misturar 50 ul de cada tipo de micro-esferas de captura de proteína para um novo tubo de microcentrifugação esterilizado. Centrifugue as microesferas imagens reunir a 7.000 rpm, durante 3 min, e remover o sobrenadante, de modo que o volume remanescente é de aproximadamente 100 ul. </li><li> Feixes de fibra óptica cortados à mão a cerca de 5 cm de comprimento esequencialmente polir ambas as extremidades de uma máquina de polimento, utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, e 0,05 mM de diamante de tamanho de polimento filmes. Sonicar o pacote polido em água deionizada por 2 min para remover quaisquer partículas. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação magnética para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, adicionar 400 mL de PBS isento de proteína padrão e agite sobre uma placa de agitação magnética durante 30 min para remover as bolhas de ar. </li><li> Etch uma das extremidades do feixe de fibras polido em uma solução 0,025 N de HCl durante 150 segundos 10,16. Imediatamente submergir e sonicate final gravado em água deionizada por 1 min. Secam-se os feixes de fibras, com ar comprimido. </li><li> Montagem do feixe de fibras sobre um suporte de fibra e bloquear a extremidade gravadas no, tampão PBS livre de proteína livre de bolhas durante 1 hora. </li><li> Depósito 1 ul alíquota da suspensão de microesferas armazenado na extremidade entalhada do feixe de fibras ópticas. Proteja a instalação da luz com uma caixa com papel alumínio e aguarde 15 min. O volume da suspensão serádiminuir por evaporação e forçar as microesferas para os micropoços gravadas. Repetir esta etapa de carregamento mais uma vez. </li><li> Utilize um cotonete saturado com solução de amostra para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. O microarray proteína já está pronto para usar. Vá imediatamente para o passo 4.1 para a análise de saliva. </li></ol> 4. Análise Saliva Amostra Utilizando Microesferas Microarray <ol><li> Adicionar solução de amostra de 200 ul (100 ul de sobrenadante de saliva diluída com igual volume de StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio. Do protocolo de recolha de saliva sobrenadante foi publicada previamente 10). para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml autoclavado. Mergulhar o microarray de proteína carregada sobre a fibra para dentro da solução e incubar num agitador a 600 rpm durante 2 h, protegido da luz utilizando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Preparar 20 ml de tampão de lavagem através da adição de 200 ul de solução de BSA a 10% e 200 ul de 10% de Tween-20 em 19,6 ml de PBS, mix bem agitando suavemente. </li><li> Mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga autoclavada contendo 200 tampão de lavagem e agitar a 600 rpm por 2 min. Repita esta lavagem 3x. </li><li> Incubar o microarray em solução de 100 mL de um cocktail de anticorpos de detecção que contém 5 ug / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, FEG, MMP-9, anticorpos de detecção de IL-1β biotinilados em StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio durante 30 min à temperatura ambiente no agitador a 600 rpm, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lavar 3x com tampão de lavagem de microarray, tal como descrito na etapa 4.3. </li><li> Incubar o microarray em 200 ul de ug / ml de conjugado de R-ficoeritrina estreptavidina (SAPE) solução a 20 em PBS, a 600 rpm no agitador durante 10 minutos, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lava-se a 5x com tampão de lavagem de microarray como descrito na etapa 4.3. </li><li> Limpar a extremidade distal da fibra (isto é, na extremidade opostaa partir das microesferas) junte com um cotonete saturado com etanol absoluto. </li><li> Seca-se ambas as extremidades da fibra com o ar comprimido. Montar a fibra num microscópio de epifluorescência e imagem através da extremidade distal da fibra. </li><li> Adquirir imagens de microesferas correspondentes ao Eu-TTA, C30 e Sapé intensidades de emissão de fluorescência. Filtros ópticos configuração e tempo de exposição para imagens de fluorescência de Eu-TTA, C30 e SAPE estão representados na Tabela 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Canal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Excitador </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Refletor </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emitter </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Tempo de exposição </td><td> 1 seg</td><td> 0,3 seg </td><td> 1 seg </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros para as três imagens fluorescentes de microarray.

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarray%22">Protein Microarray</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).</li>
<li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1%2FTh2+cytokines+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li>
<li>de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li>
<li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li>
<li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+drool+for%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li>
<li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies%2C+proteomics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li>
<li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics%3A+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dent.+Educ%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li>
<li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li>
<li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+nanowell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarrays%22">Protein Microarrays</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).</li>
<li>Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As microesferas codificada...

Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica 1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio 2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados 11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo 14 e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores 15. . Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis ​​também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis ​​para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Eu-TTA corante</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro âmbar</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>Cumarina 30 corante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas</td><td>Bangslabs</td><td>PC05N / 6698</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES tampão salino</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaOH SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga com trava segura</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura de VEGF humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos de captura IP-10 humanos</td><td>R& D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura de IL-8 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos de captura EGF humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura MMP-9 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB936</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-1&beta; anticorpo de captura</td><td>R& D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 anticorpo de controle de isotipo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock (TBS) tampão</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>HCl solução padrão 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tampão livre de proteína (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano recombinante 165</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>R & IP-10 humano recombinante</td><td> D Systems</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta humano recombinante;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador BSA em PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de VEGF biotinilado</td><td>R & D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção IP-10 biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de IL-8 biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de EGF biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção MMP-9 biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF911</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de IL-1&beta; biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, R-ficoeritrina</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 provas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplexado fluorescente microarray para análise de proteína salivar humana usando polymer microesferas e pacotes de fibra óptica

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados ​​por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.

As imagens de fluorescência a partir de três canais, mostrando uma pequena parte do feixe de fibras ópticas, são mostrados nas Figuras 2A-C. Estas imagens foram analisadas utilizando um algoritmo escrito em Matlab (como descrito em mais detalhe na secção Discussão). A análise utiliza tanto a informação de codificação de imagem do Eu-ATT (Figura 2A) e da imagem de codificação C30 (Figura 2B) para descodificar as microesferas, e as intensidades de fluorescência de diferen...

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar múltiplas proteínas em amostras de saliva humana utilizando matrizes fluorescentes baseadas em microesferas. Primeiro, marque as microesferas com diferentes quantidades de dois corantes fluorescentes. Conjugue os anticorpos de captura para diferentes proteínas nas microesferas codificadas.Em seguida, monte o microarranjo proteico multiplexado no feixe de fibras ópticas utilizando os imunoensaios em sanduíche nos microarranjos montados para detectar múltiplas proteínas nas amostras de saliva em teste. Em última análise, a análise por microscopia de fluorescência pode medir as respostas de sinal de diferentes proteínas nas amostras de saliva. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ELISA, é que ela permite a análise simultânea de múltiplas proteínas em biofluidos complexos.Embora este método possa fornecer informações sobre a análise da saliva humana, ele também pode ser aplicado a outros fluidos biológicos, como soro, urina e escarro. Pese o TTA de ópio em um frasco de vidro âmbar e prepare uma solução estoque de 200 milimolar em tetra-hidrofuran. Misture suavemente por pipetagem e verifique visualment

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Uma descrição da formação de um polímero de microarray utilizando uma técnica de fotopolimerização on-chip. A caracterização de superfície de alto rendimento utilizando a microscopia de força atómica, as medições do ângulo de contacto da água, raios-X e espectroscopia de fotoelectrões de tempo de voo de espectrometria de massa de iões secundários e um ensaio de ligação celular é também descrito.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Este vídeo demonstra uma técnica de imunoensaio multiplex baseada em esferas para detectar simultaneamente anticorpos para vários patógenos ambientais na saliva humana. Grânulos fluorescentes foram acoplados a antígenos de diferentes patógenos, que foram capturados usando anticorpos na amostra de saliva humana. Ao marcar os anticorpos usando um repórter fluorescente, as esferas foram analisadas usando citometria de fluxo para avaliar a presença de diferentes anticorpos específicos do patógeno...

Um imunoensaio multiplex baseado em esferas para identificar anticorpos específicos de patógenos na saliva

Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.

Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

A detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotículas normalmente envolve sistemas de detecção baseados em microscópio de epifluorescência volumosos e complexos. Aqui descrevemos um esquema de detecção multicolorido compacto e modular que utiliza uma matriz de fibras ópticas para codificar temporariamente dados multicoloridos coletados por um único fotodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Aprenda a analisar múltiplas proteínas na saliva humana usando microesferas fluorescentes e imunoensaios sanduíche em feixes de fibra óptica. Este método multiplexado oferece maior eficiência que ELISA tradicional.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica (Vídeo) | JoVE Journal

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