Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica
October 10th, 2013
Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.
O objetivo geral deste procedimento é analisar várias proteínas em amostras de saliva humana usando matrizes fluorescentes baseadas em microesferas. Primeiro, codifique as microesferas com diferentes quantidades de dois corantes fluorescentes. Acople os anticorpos de captura para diferentes proteínas nas microesferas codificadas.
Em seguida, monte o microarray de proteína multiplexado no feixe de fibra óptica usando os imunoensaios imprensados no ensaio de microarrays montados para várias proteínas nas amostras de saliva de teste. Em última análise, a análise por microscopia de fluorescência pode medir as respostas de sinal de diferentes proteínas nas amostras de saliva. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes como o de Eliza é que ela permite a análise simultânea de várias proteínas em biofluidos complexos.
Embora esse método possa fornecer informações sobre a análise da saliva humana, ele também pode ser aplicado a outras biogripes, como urina sérica e escarro. Pesar o TTA de ópio em um frasco de vidro âmbar e preparar uma solução estoque de 200 milimolares em tetra hidro Furina. Misture suavemente pipetando e verifique visualmente se o corante está completamente dissolvido.
Da mesma forma, prepare uma solução estoque de 12 milimolares de cumarina 30 misturada suavemente por pipetagem. Visualmente. Verifique se o D está completamente dissolvido em vórtice para suspensão de microesferas e, em seguida, transfira 60 microlitros para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para lavar as microesferas, adicione 600 microlitros de PBS misturados por pipetagem 20 vezes e centrifugue a 10.000 RPM por três minutos.
Após três lavagens com solução de tetra hidrofurina, remova o sobrenadante, ressuspenda o palato em 600 microlitros de solução de trabalho e transfira a mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Sele o tubo da microcentrífuga com filme e coloque-o em uma coqueteleira. Proteja-o da luz cobrindo com papel alumínio.
Adicione 200 microlitros de suspensão de microesferas codificadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com trava segura. De forma gota a gota, adicione 150 microlitros, uma solução EDC recém-preparada Adicione imediatamente 150 microlitros de solução de sulfa NHS. Misture bem pipetando e verifique se a suspensão é homogênea.
Tampe o tubo, sele-o com paraforma e coloque-o em um shaker. Proteja-o da luz cobrindo com papel alumínio. Após três lavagens de P-B-S-S-D-S buffer reus, suspenda o pellet em 200 microlitros de mistura de buffer P-B-S-S-D-S.
Em seguida, transfira a solução para 300 microlitros de tampão P-B-S-S-D-S contendo 60 microgramas de anticorpos de captura. Misture 50 microlitros de cada tipo de microesferas de captura de proteína em um novo tubo de microcentrífuga de autoclave. Centrifugue o pool de microesferas de estoque a 7.000 RPM por três minutos e remova todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante.
Agora corte à mão feixes de fibra óptica com aproximadamente cinco centímetros de comprimento, polir sequencialmente ambas as extremidades usando filmes de lapidação de diamante. Em seguida, sonicar o feixe polido em água deionizada por dois minutos. Para remover quaisquer partículas, coloque uma pequena barra de agitação magnética em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.
Adicione 400 microlitros de tampão PBS livre de proteína e mexa em uma placa de agitação magnética por 30 minutos. Para remover bolhas de ar, grave uma extremidade do feixe de fibras polidas em uma solução de cloreto de hidrogênio normal 0,025 por 150 segundos. Mergulhe e sonice imediatamente o N gravado em água deionizada por um minuto.
Em seguida, seque os feixes de fibras com ar comprimido, monte o feixe de fibras em um suporte de fibra e bloqueie a extremidade gravada no buffer PBS livre de proteína sem bolhas por uma hora, deposite um quadrilátero ALI de um microlitro da suspensão de microesferas armazenada na extremidade gravada do feixe de fibra óptica. Proteja a configuração da luz com uma caixa embrulhada com papel alumínio. Após 15 minutos, o volume da suspensão diminuirá por evaporação e forçará as microesferas para dentro dos micropoços gravados.
Use um cotonete saturado com sample solução para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. Para deixar o microarray de proteína pronto para uso, adicione 200 microlitros de solução de amostra em um tubo de microcentrífuga de autoclave de 0,5 mililitro. Mergulhe o microarray de proteínas carregado na fibra na solução e coloque em um shaker.
Proteja da luz cobrindo com papel alumínio. Em seguida, mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga de autoclave contendo 200 microlitros de tampão de lavagem e agite a 600 RPM por dois minutos. Agora incube o microarray em uma solução de 100 microlitros de um coquetel de anticorpos de detecção contendo anticorpos de detecção biotinilados e um tampão de bloqueio de PBS por 30 minutos.
À temperatura ambiente no escuro, limpe a extremidade distal do feixe de fibras com um cotonete saturado com etanol absoluto. Em seguida, seque ambas as extremidades da fibra com ar comprimido, monte a fibra em um microscópio epifluorescente e obtenha a imagem através da extremidade distal da fibra, adquira as imagens da microesfera correspondentes às intensidades de emissões fluorescentes do ópio TTAC 30 e SAP. As imagens de codificação de sete tipos de microesferas são mostradas aqui.
Dois níveis de intensidade são observados na imagem de codificação UTTA, que representam microesferas codificadas com diferentes quantidades de matriz UTTA Resultados semelhantes são observados na imagem de codificação C 30. A análise de imagem MATLAB permite o cálculo das intensidades de fluorescência de diferentes microesferas na imagem do sinal. Os resultados da decodificação são mostrados na figura 2D sete.
Diferentes microesferas são decodificadas com sucesso. As microesferas não mostram resposta quando incubadas com tampão de ensaio. Quando incubado com amostras de saliva humana, são observadas respostas fluorescentes significativas.
Para uma melhor comparação, os contrastes nessas duas figuras foram ajustados para o mesmo nível. Uma vez dominado, este método permite a análise reprodutível de diferentes proteínas nas amostras de saliva humana. Os resultados de três detecções independentes na mesma amostra são mostrados.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um microraio de proteína multiplex baseado em microesferas e usá-lo para análise de biofluidos complexos. Seguindo este procedimento. Outros biomarcadores proteicos em diferentes biofluidos complexos também podem ser analisados.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para o perfil de proteínas salivares usando matrizes de anticorpos multiplexadas baseadas em microesferas. O método permite a análise simultânea de múltiplas proteínas em amostras de saliva humana, melhorando as capacidades dos ensaios tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Proteômica
Fundamentos
- A saliva contém uma variedade de proteínas que podem fornecer insights sobre saúde e doença.
- Métodos tradicionais como ELISA são limitados à análise de uma proteína de cada vez.
- Ensaios multiplexados podem melhorar a eficiência e riqueza de dados.
- A tecnologia de microesferas fluorescentes oferece uma abordagem inovadora para detecção de proteínas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para analisar múltiplas proteínas na saliva simultaneamente.
- Aumentar a sensibilidade e especificidade da detecção de proteínas em biofluidos complexos.
- Fornecer uma alternativa mais eficiente aos ensaios de analito único existentes.
Métodos Utilizados
- Codificação de microesferas com corantes fluorescentes.
- Ligação covalente de anticorpos de captura às microesferas.
- Montagem de matrizes de proteínas multiplexadas em feixes de fibras ópticas.
- Uso de imunoensaios de sanduíche de fluorescência para detectar proteínas em amostras de saliva.
Principais Resultados
- O método detectou com sucesso múltiplas proteínas em amostras de saliva.
- A microscopia de fluorescência forneceu respostas de sinal claras para diferentes proteínas.
- A técnica demonstrou vantagens sobre os métodos tradicionais de ELISA.
- Os resultados indicam potenciais aplicações em diagnósticos clínicos.
Conclusões
- Esta abordagem multiplexada permite uma análise eficiente das proteínas salivares.
- O método poderia facilitar uma melhor compreensão de várias condições de saúde.
- Estudos futuros podem expandir a aplicação desta técnica em outros biofluidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
