Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar o modelo de câmara de difusão vertical ou VDC para investigar as interações bacterianas com uma invasão de células epiteliais intestinais. Isso é alcançado primeiramente utilizando um filtro especial com uma monocamada polarizada de células epiteliais intestinais Caco-2 para criar compartimentos apical e basal lateral separados na VDC. Na segunda etapa, o inóculo bacteriano de interesse é adicionado ao compartimento apical.

Em condições microaeróbias e de cultura celular, o meio é adicionado ao compartimento basolateral em condições aeróbias; em seguida, nos momentos desejados durante a cocultura, o filtro é removido e o número de bactérias interagentes ou intracelulares é contabilizado. Em última análise, pode-se observar um aumento no número de bactérias interagentes e intracelulares utilizando o modelo VDC em comparação com as condições padrão de cultura aeróbia. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os ensaios padrão de adesão e invasão em cultura de tecidos, é que, com esta técnica, a cocultura de bactérias e células epiteliais intestinais é realizada em condições in vitro que simulam mais fielmente as condições in vivo do intestino humano.

Quem demonstrará o procedimento será N Vida nas, estudante de doutorado do meu laboratório, e Dominic Mills, pós-doutorando que desenvolveu o modelo de câmara de difusão vertical como parte de seu doutorado no meu laboratório. Comece semeando quatro por 10 à quinta células epiteliais intestinais caco-2 por filtro de 0,4 mícron em meio de cultura, depois cultive as células até a polarização por 21 dias, trocando o meio a cada dois a três dias para confirmar o estado de polarização da monocamada. Utilize um medidor de resistência ôhmica e de voltagem para medir a resistência elétrica transepitelial.

24 horas antes de iniciar o ensaio de co-cultivo em VDC, incubar jejuni em uma placa fresca de ágar sangue sob condições microaeróbias em um incubador de atmosfera variável. Ao mesmo tempo, pré-incubar 30 mililitros de caldo Bruce sob as mesmas condições no dia do experimento, imergindo as meias câmaras do VDC, bem como as juntas e tampões, em solução esterilizante. Em seguida, usar uma seringa estéril de 20 mililitros para passar a solução pelos orifícios de entrada de gás em ambas as meias câmaras. Após uma hora, enxaguar os componentes do VDC com água estéril fresca usando outra seringa estéril de 20 mililitros para enxaguar os orifícios de entrada de gás.

Em seguida, colha metade do cultivo em ágar sangue CJ em um mililitro do caldo barella pré-incubado para obter aproximadamente 10 à 10ª UFC por mililitro. Meça a densidade óptica da suspensão bacteriana a 600 nanômetros para quantificar de forma semi-quantitativa as unidades formadoras de colônia bacteriana ou UFCs e, em seguida, ajuste a suspensão bacteriana ao nível desejado de inóculo em um volume total de quatro mililitros do caldo Bruce pré-incubado. Realize uma diluição seriada a partir dessa suspensão bacteriana final, plaque a diluição apropriada em placas de ágar sangue em triplicata e incube as placas no incubador de atmosfera variável por 48 horas.

Agora, coloque a câmara inferior do VDC plana sobre a bancada e encaixe um anel O na mesma. Em seguida, retire um filtro contendo as células epiteliais intestinais do suporte e lave-o três vezes com 400 microlitros de PBS estéril. Coloque o filtro sobre a câmara inferior, certificando-se de que o anel O permaneça no lugar, e depois abaixe suavemente a câmara superior até encaixá-la.

Uma vez que as duas câmaras semicirculares estejam montadas, prenda-as juntas usando grampos de anel e coloque o VDC horizontalmente sobre a bancada com as duas aberturas voltadas para cima. Adicione o inóculo bacteriano na câmara apical e, em seguida, adicione quatro mililitros de meio de cultura celular na câmara lateral basal. Insira as peças finais nas aberturas de ambas as câmaras semicirculares e, depois, coloque o VDC no incubador de atmosfera variável.

Em proximidade próxima ao coletor de gás, abra o regulador de suprimento de gás conectado ao coletor de gás. Conecte o tubo do coletor à entrada de gás na câmara basal lateral do VDC e, em seguida, conecte o tubo de saída de gás proveniente do incubador de atmosfera variável a uma das saídas na peça final da câmara basal lateral. Feche a outra saída na peça final da câmara basal lateral.

Em seguida, abra lentamente o fluxo de gás no coletor de gás para evitar pressão excessiva de gás e para obter um fluxo de gás de uma bolha a cada dois a cinco segundos após o período de cocultivo apropriado. Feche o regulador de suprimento de gás conectado ao coletor de gás. Em seguida, desligue o fluxo de gás no VDC no coletor e desconecte a entrada de gás, a saída de gás e a rolha do VDC.

Em seguida, remova o VDC do incubador com atmosfera variável. Depois, remova os sobrenadantes laterais apicais e basais e armazene-os a 80 graus negativos Celsius para análises posteriores. Remova as braçadeiras de anel e desmonte cuidadosamente o VDC.

Remova o filtro da câmara semiespessa e transfira-o para uma placa de cultura celular estéril de seis poços. Em seguida, lave o VDC com água estéril e armazene-o para a próxima rodada de experimentos para a enumeração do número total de bactérias interagentes. Lave as células epiteliais intestinais de três a cinco vezes com 400 microlitros de PBS estéril e, então, lise-as em 400 microlitros de PBS estéril contendo Triton X-100 durante 20 minutos à temperatura ambiente, realize uma diluição em série do lisado celular, seguida pelo plaqueamento das diluições apropriadas em placas de ágar sangue em triplicata.

Em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius no incubador de atmosfera variável por 48 horas para a enumeração do número total de bactérias invasoras. Incubar as células epiteliais intestinais com 400 microlitros de meio de cultura celular contendo 150 microgramas por mililitro de gentamicina por duas horas em um incubador padrão de cultura de tecidos para eliminar as bactérias extracelulares. Em seguida, quantificar as unidades formadoras de colônia após lise celular, diluição seriada e cultivo conforme acabado de demonstrar.

Os seguintes dados ilustram uma comparação entre o número de CJ jui interagindo com ou invadindo células Caco-2 após três, seis ou 24 horas de co-cultivo sob condições padrão de ensaio de cultura celular versus o uso do modelo VDC. Após 24 horas de co-cultivo, por exemplo, menos de 10⁷ UFCs de CJ juna podem ser observadas interagindo com células Caco-2 sob condições padrão de cultura celular. No entanto, após 24 horas de co-cultivo no modelo VDC, aproximadamente 10⁸ UFC de CJ jui podem ser observadas interagindo com células Caco-2, um aumento nas interações de CJ jui com células epiteliais intestinais de quase dez vezes.

Ao comparar o número de CJ jui invasores em condições de cultivo padrão versus condições de cultivo em VDC, aproximadamente 10 à quinta UFCs intracelulares de CGE jui podem ser isoladas de células CACO dois após 24 horas em condições padrão de cultivo celular. Já após 24 horas de co-cultivo no modelo VDC, aproximadamente 10 à sétima UFCs intracelulares podem ser isoladas das células CACO dois, com um aumento na CGE intracelular de quase 100 vezes. Ao realizar este procedimento, é importante monitorar o fluxo de gás na câmara basal lateral após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da patogênese de abuc investigassem tanto a base genética da interação bacteriana com células epiteliais intestinais quanto a resposta imune inata do hospedeiro à infecção bacteriana. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o modelo de câmara de difusão vertical para estudar as interações de outras bactérias entéricas com células epiteliais intestinais e as condições que representam mais fielmente aquelas presentes no intestino humano.