Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

O objetivo geral deste procedimento é isolar tubos de células endoteliais da artéria epigástrica superior de camundongo ou SEA para estudar a dinâmica de sinalização intra e intercelular de um endotélio microvascular nativo e intacto. Isso é realizado primeiramente isolando a SEA da parede muscular esquelética abdominal do camundongo. Na segunda etapa, o vaso é digerido suave e sistematicamente, e então cuidadosamente TATado para dissociar as células musculares lisas e a adventícia do tubo de células endoteliais.

No passo final, o tubo é fixado em uma câmara de fluxo e superfusionado com uma solução salina fisiológica. Por fim, a microscopia confocal pode ser utilizada para visualizar a sinalização de cálcio no tubo endotelial microvascular intacto e nativo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o cultivo de células endoteliais, é que as células endoteliais que compõem o tubo mantêm sua morfologia nativa, expressão proteica e capacidade de resposta. O endotélio é essencial para o controle do fluxo sanguíneo em todo o organismo.

A aplicação desta técnica permite-nos investigar os eventos de sinalização entre células que medeiam o controle do fluxo sanguíneo e como eles podem ser alterados durante a disfunção vascular. Para isolar inicialmente a SEA, faça uma pequena incisão na pele logo acima da região púbica de um camundongo anestesiado, estenda a incisão lateralmente em cada direção até os respectivos membros posteriores e, em seguida, continue a incisão rostralmente ao longo da linha média ventral até o topo da caixa torácica, estendendo ainda mais a incisão lateralmente em cada direção até os quatro membros. Agora, levante suavemente a pele e corte o tecido conjuntivo que a prende ao músculo subjacente, expondo toda a superfície da musculatura abdominal.

Irrije o músculo exposto com solução salina à temperatura ambiente. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, levante o coxim adiposo localizado na parte inferior do esterno. Faça uma incisão através do coxim adiposo e ao longo da última costela.

A SEA agora deve estar visível; tenha cuidado para não danificar a artéria e irrigue o tecido exposto com mais solução salina à temperatura ambiente. Após a camada superior do músculo esquelético ter sido retratada, observe o comprimento da SEA e, em seguida, excise cuidadosamente a fina camada muscular localizada sob a artéria. Em seguida, use pinças anguladas para passar um segmento de fio de seda 6-0 sob a ASA.

Em seguida, ligue a artéria e sua veia adjacente para mantê-las pressurizadas e reter o sangue dentro da luz do vaso. Após ligar a ASC no lado contralateral, faça uma incisão ao longo da linha média dos músculos abdominais para separar os lados correspondentes e, então, estenda a incisão lateralmente em cada direção, como feito para a pele. Continue a incisão verticalmente ao longo da borda externa para separar completamente o músculo abdominal do corpo.

Em seguida, corte a SEA acima da ligação para manter a selagem e coloque o músculo e a artéria isolados em um béquer de 50 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de dissecção a quatro graus Celsius. Após isolar o músculo do outro lado do abdômen, incube os tecidos no tampão de dissecção por 10 minutos. Agora, coloque o músculo abdominal contendo a SEA em uma placa de Petri a quatro graus Celsius revestida com uma camada de cyl guard e contendo tampão de dissecção. Use pinos de inseto de 0,15 milímetros para esticar a SEA e o músculo até seus comprimentos aproximados in vivo previamente anotados.

Fixe a AVE ao protetor cilíndrico, orientando o músculo de modo que a camada fina voltada para o peritônio fique voltada para cima. Em seguida, partindo do local de ligadura a montante em direção à extremidade a jusante, libere cerca de um a dois centímetros da AVE de sua veia pareada e dos tecidos circundantes até o primeiro sítio de ramificação principal. Corte a AVE logo acima do sítio de ramificação e logo abaixo da ligadura.

Em seguida, utilize um pedaço de tubo elástico para conectar a extremidade traseira de uma pipeta a uma seringa de cinco mililitros contendo tampão de dissecção gelado. Fixe a ponta da pipeta de cânula dentro da câmara de dissecção e cânule a SEA. Então, uma vez que todos os eritrócitos tiverem sido removidos, retire a SEA da pipeta de cânula e remova a pipeta da placa de dissecção para isolar os tubos endoteliais.

Primeiro, preencha pela metade um tubo de cultura de vidro de 12 por 75 milímetros com tampão de dissecção gelado. Em seguida, após cortar a SEA em pedaços de um a três milímetros, use pinças angulares para transferir os fragmentos arteriais para o tubo de cultura e coloque o tubo sobre gelo. A seguir, combine as enzimas de digestão com o tampão de dissociação até um volume final de um mililitro em um tubo de cultura separado de 12 por 75 milímetros e pré-aqueça a solução enzimática a 37 graus Celsius utilizando um bloco de aquecimento.

Retire o tubo de cultura contendo os fragmentos arteriais de quatro graus Celsius e coloque-o à temperatura ambiente para aquecer, enquanto a solução enzimática atinge 37 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o tampão de dissecção, agora à temperatura ambiente, do tubo de cultura, deixando um pequeno volume contendo os segmentos vasculares. Em seguida, adicione lentamente o tampão de dissociação sem enzimas, à temperatura ambiente, aos segmentos vasculares, de modo que os fragmentos arteriais permaneçam no fundo do tubo de cultura, para remover qualquer resíduo do tampão de dissecção.

Uma vez que a solução enzimática atinja 37 graus Celsius, aspire novamente o tampão de dissociação do tubo de cultura contendo os segmentos vasculares, deixando um pequeno volume contendo os segmentos vasculares. Agora transfira a solução enzimática a 37 graus para o tubo de cultura e incube o tubo de cultura no bloco de aquecimento por 30 minutos a 37 graus Celsius. Durante a incubação, prepare uma pipeta de litração pré-preenchida com óleo mineral, risque a pipeta, faça uma quebra limpa, quebre a pipeta com pinça aquecida, pola a ponta da pipeta e fixe-a em uma microsiringa montada em um micromanipulador.

Em seguida, recolha o êmbolo da microseringa para encher a pipeta com dois nanolitros de tampão de dissociação e posicione a ponta da pipeta sobre a câmara de fluxo ao final da incubação. Após aspirar cuidadosamente o tampão conforme demonstrado, lave os segmentos arteriais com quatro mililitros de tampão de dissociação à temperatura ambiente. Em seguida, aspire suavemente um segmento de vaso com uma micropipeta de um mililitro e coloque o vaso em uma câmara de fluxo contendo um mililitro do tampão de dissociação.

Posicione a ponta da pipeta de aspiração próxima a uma extremidade do segmento do vaso, e então aspire o segmento do vaso para dentro da pipeta de aspiração a cerca de 225 nanolitros por segundo, para não causar estresse mecânico às células endoteliais; em seguida, expulse o vaso de volta para a câmara. Se a digestão foi bem-sucedida, as células musculares lisas e a adventícia estarão dissociadas do tubo endotelial. Remova a adventícia do tubo endotelial o mais rapidamente possível para evitar que ela se enrosque no tubo, e então repita a aspiração conforme demonstrado anteriormente, até que todas as células musculares lisas tenham sido dissociadas.

Após a iteração final, ASEE posicionou o tubo endotelial isolado no centro da câmara de fluxo, alinhado ao longo da direção do fluxo, e removeu a pipeta de ativação. Fixe as pipetas de fixação em micromanipuladores montados em ambas as extremidades da câmara de fluxo e, em seguida, posicione suas pontas nas extremidades respectivas do tubo endotelial. Abaixe as pipetas de fixação, uma de cada vez, sobre as extremidades opostas do tubo, pressionando o tubo contra o fundo da câmara, a cerca de 50 micrômetros de cada extremidade do tubo.

No momento em que a pipeta de fixação toca o tubo, retire-a lentamente ao longo do eixo do tubo, estendendo-o até seu comprimento aproximado in vivo. Pressione a pipeta contra o fundo da câmara para fixar o tubo e, em seguida, inicie o fluxo da solução de superfusão utilizando uma bomba peristáltica para manter um fluxo constante da solução de superfusão sobre o tubo endotelial. Nesta imagem de contraste de interferência diferencial, é mostrado um tubo isolado de células endoteliais proveniente de uma SEA após uma hora de superfusão com tampão de superfusão a três mililitros por minuto à temperatura ambiente.

Este vídeo demonstra as respostas de cálcio em um tubo de células endoteliais carregado com fluo-4, em resposta a uma estimulação com acetilcolina de um micromolar. Essas imagens de fluorescência representativas foram coletadas em diferentes pontos temporais após a estimulação do tubo endotelial com acetilcolina. Observe como o cálcio intracelular oscila ao longo do tempo.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar danos mecânicos ao tubo endotelial durante o posicionamento e fixação, pois as células endoteliais são extremamente delicadas e facilmente danificadas. Após assistir a este vídeo, você terá uma boa noção de como isolar tubos endoteliais da artéria epigástrica superior do camundongo e, assim, estudar o endotélio microvascular nativo e intacto.