Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

O objetivo geral deste procedimento é isolar tubos de células endoteliais da artéria epigástrica superior do camundongo ou SEA para estudar a dinâmica de sinalização intra e intercelular de um endotélio microvascular intacto nativo. Isso é feito isolando primeiro o SEA da parede do músculo esquelético abdominal do camundongo. Na segunda etapa, o vaso é digerido suave e somaticamente e, em seguida, cuidadosamente TATed para dissociar as células musculares lisas e a adventícia do tubo de células endoteliais.

Na etapa final, o tubo é fixado em uma câmara de fluxo e superfundido com uma solução salina fisiológica. Em última análise, a imagem confocal pode ser usada para visualizar a sinalização de cálcio no tubo endotelial microvascular intacto nativo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a cultura de células endoteliais, é que as células endoteliais que compõem o tubo mantêm sua morfologia nativa, expressão de proteínas e capacidade de resposta, O endotélio é parte integrante do controle do fluxo sanguíneo em todo o corpo.

A aplicação desta técnica nos permite investigar os eventos de sinalização célula a célula que medeiam o controle do fluxo sanguíneo e como eles podem dar errado durante a disfunção vascular. Para isolar o SEA primeiro, faça uma pequena incisão na pele logo acima da área da região púbica de um camundongo anestesiado, estenda a incisão lateralmente em cada direção até os respectivos membros posteriores e, em seguida, continue a incisão ao longo da linha média ventral até o topo da caixa torácica, estendendo ainda mais a incisão lateralmente em cada direção para os respectivos quatro membros. Agora levante suavemente a pele e corte o tecido conjuntivo que prende a pele ao músculo subjacente, expondo toda a superfície da musculatura abdominal.

Irrigue o músculo exposto com solução salina à temperatura ambiente. Em seguida, sob um microscópio estéreo, levante a almofada de gordura localizada na parte inferior do esterno. Faça uma incisão na almofada de gordura e ao longo da costela inferior.

O SEA agora deve estar visível, tomando cuidado para não danificar a artéria, irrigar o tecido exposto com mais temperatura ambiente, solução salina. Depois que a camada superior do músculo esquelético for retraída, observe o comprimento do SEA e, em seguida, excise cuidadosamente a fina camada muscular sob a artéria. Em seguida, use uma pinça angular para passar um comprimento de seis suturas de seda por baixo do SCA.

Em seguida, ligue a artéria e sua veia adjacente para mantê-la pressurizada e manter o sangue retido dentro do lúmen do vaso. Depois de ligar a SCA no lado contralateral, faça uma incisão ao longo da linha média dos músculos abdominais para separar os respectivos lados e, em seguida, estenda a incisão lateralmente em cada direção, como feito para a pele. Continue a incisão verticalmente ao longo da borda externa para separar completamente o músculo abdominal do corpo.

Em seguida, corte o SEA acima da ligadura para manter a vedação e coloque o músculo e a artéria isolados em um béquer de 50 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de dissecção de quatro graus Celsius. Depois de isolar o músculo do outro lado do abdômen, incube os tecidos em tampão de dissecção por 10 minutos. Agora, coloque o músculo abdominal contendo o SEA em uma placa de Petri de quatro graus Celsius revestida com uma camada de proteção cil e contendo tampão de dissecação Use pinos de insetos de 0,15 milímetro para esticar o SEA e o músculo para seus comprimentos aproximados in vivo previamente observados.

Prenda o SEA à proteção do cilindro, orientando o músculo de forma que a fina camada voltada para o peritônio fique no topo. Em seguida, trabalhando do local de ligadura a montante em direção à extremidade a jusante, limpe cerca de um a dois centímetros do SEA de sua veia emparelhada e do tecido circundante até o primeiro local de ramificação principal. Corte o SEA logo acima do local da filial e logo abaixo da ligadura.

Em seguida, use um pedaço de tubo elástico para conectar a extremidade traseira de uma pipeta a uma seringa de cinco mililitros contendo tampão de dissecação gelada. Prenda a ponta da pipeta de canulação dentro da câmara de dissecção e canule o SEA. Então, uma vez que todos os eritrócitos tenham sido eliminados, remova o SEA da pipeta de canulação e remova a pipeta da placa de dissecção para isolar os tubos endoteliais.

Primeiro, encha um tubo de cultura de vidro de 12 por 75 milímetros até a metade com tampão de dissecação gelado. Então, depois de cortar o SEA em pedaços de um a três milímetros, use uma pinça angular para transferir os pedaços arteriais para o tubo de cultura e coloque o tubo no gelo. Em seguida, combine as enzimas de digestão com o tampão de dissociação até um volume final de um mililitro em um tubo de cultura separado de 12 por 75 milímetros e pré-aqueça a solução enzimática a 37 graus Celsius com um bloco de aquecimento.

Remova o tubo de cultura contendo os pedaços arteriais de quatro graus Celsius e coloque-o em temperatura ambiente para aquecer enquanto a solução enzimática está aquecendo a 37 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o tampão de dissecção à temperatura ambiente do tubo de cultura, deixando um pequeno volume contendo os segmentos do vaso. Agora, adicione lentamente a temperatura ambiente, tampão de dissociação sem enzimas aos segmentos dos vasos, de modo que os pedaços arteriais permaneçam no fundo do tubo de cultura para lavar qualquer tampão de dissecção restante.

Quando a solução enzimática atingir 37 graus Celsius, aspire novamente o tampão de dissociação do tubo de cultura que contém os segmentos dos vasos, deixando um pequeno volume contendo os segmentos dos vasos. Agora transfira a solução enzimática a 37 graus para o tubo de cultura e incube o tubo de cultura no bloco de aquecimento por 30 minutos a 37 graus Celsius. Durante a incubação, prepare uma pipeta de literação preenchida com óleo mineral, marque a pipeta, faça uma quebra limpa, quebre a pipeta com fórceps de fogo, polir a ponta da pipeta e prenda-a em uma micro seringa montada em um micro manipulador.

Em seguida, retraia o êmbolo da microseringa para encher a pipeta com dois nanolitros de tampão de dissociação e posicione a ponta da pipeta sobre a câmara de fluxo no final da incubação. Depois de aspirar cuidadosamente o tampão conforme demonstrado, lave os segmentos arteriais com quatro mililitros de tampão de dissociação à temperatura ambiente. Em seguida, aspire suavemente um segmento de vaso com uma micropipeta de um mililitro e coloque o vaso em uma câmara de fluxo com um mililitro do tampão de dissociação.

Posicione a ponta da pipeta de tação perto de uma extremidade do segmento do vaso e, em seguida, aspire o segmento do vaso para dentro da pipeta de tação a cerca de 225 nanolitros por segundo, de modo a não causar tensão mecânica nas células endoteliais, ejete o vaso de volta para a câmara. Se a digestão for bem-sucedida, as células musculares lisas e a adventícia serão dissociadas do tubo endotelial. Afaste a adventícia do tubo endotelial o mais rápido possível para evitar que ela se enrosque no tubo e, em seguida, repita a tação como acabamos de demonstrar até que todas as células musculares lisas estejam dissociadas.

Após a iteração final, ASEE e colocou o tubo endotelial isolado no centro da câmara de fluxo, alinhado ao longo da direção do fluxo e removeu a pipeta de disparo. Prenda as pipetas de fixação em micromanipuladores montados em cada extremidade da câmara de fluxo e, em seguida, posicione suas pontas nas respectivas extremidades do tubo endotelial. Abaixe as pipetas de fixação, uma de cada vez, sobre as extremidades opostas do tubo, pressionando o tubo contra o fundo da câmara, a cerca de 50 micrômetros de cada extremidade do tubo.

Assim que a pipeta de pinos tocar o tubo, retraia-o lentamente ao longo do eixo do tubo, estendendo-o até seu comprimento aproximado in vivo. Pressione a pipeta contra o fundo da câmara para prender o tubo e, em seguida, inicie o fluxo da solução de superfusão usando uma bomba peristáltica para manter um fluxo constante da solução de superfusão através do tubo endotelial. Nesta imagem de contraste de interferência diferencial, um tubo de células endoteliais isolado de um SEA seguinte, uma superfusão de uma hora com tampão de superfusão a três mililitros por minuto à temperatura ambiente é mostrado.

Este filme demonstra as respostas de cálcio de um tubo de células endoteliais carregado com gripe em resposta a uma estimulação de acetilcolina de um micromolar. Essas imagens de fluorescência representativas foram coletadas em vários momentos após a estimulação do tubo endotelial com acetilcolina. Observe como o cálcio intracelular oscila ao longo do tempo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar danificar mecanicamente o tubo endotelial durante o posicionamento e fixação tri, pois as células endoteliais são extremamente delicadas e facilmente danificadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar os tubos endoteliais da artéria epigástrica superior do camundongo e, assim, estudar o endotélio microvascular intacto nativo.