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O objetivo geral deste procedimento é estudar a resposta de células imunes humanas à infecção pelo vírus respiratório sincicial ou infecção por VRS. Isso é realizado primeiramente cultivando uma estirpe infecciosa de VRS em células HELo. Na segunda etapa, a estirpe de VRS cultivada é purificada por ultracentrifugação.

A seguir, as células imunes sanguíneas humanas primárias são isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. Na etapa final, as células imunes isoladas são estimuladas com o vírus. Em última análise, a resposta imune celular à infecção por RSV pode ser avaliada por ELIZA qPCR ou citometria de fluxo.

Essa técnica é um valioso complemento para o estudo de infecções virais respiratórias in situ. O VSR é altamente adaptado aos humanos. Por isso, é importante utilizar células imunes humanas para estudar as vias inflamatórias envolvidas na patogênese do vírus.

Embora o vírus utilizado neste vídeo seja o VSR, este método também pode ser facilmente adaptado para estudar outros vírus, como o vírus da influenza ou o rinovírus. Comece aquecendo um frasco de estoque de VSR humano em um banho-maria a 37 graus Celsius. Quando o vírus estiver descongelado, dilua o estoque em alíquotas de quatro mililitros de meio de infecção por frasco.

Mantendo a MOI em 0,1 ou abaixo, adicione o vírus às células heli com o menor volume total possível, sem causar desidratação das células. Em seguida, incube as culturas por duas a quatro horas a 37 graus Celsius e 5%CO2, agitando o frasco a cada 15 minutos para redistribuir o meio. Em seguida, remova o inóculo e lave as células uma vez com PBS.

Em seguida, adicione 15 mililitros de meio de cultura aos frascos e incube-os por três a cinco dias nas mesmas condições de cultura. Observe as células uma vez por dia, diariamente, em microscopia de campo claro comum, em busca de alterações citopatológicas induzidas pelo vírus. Quando essas alterações forem observadas, raspe as células para colher o VSR e, então, colete a suspensão em um tubo estéril de 50 mililitros, transfira as células para o tubo, e em seguida centrifugue por 10 minutos a 1800 Gs e temperatura ambiente para obter o pellet de debris celulares.

O VSR não forma pellet nesta velocidade, e portanto o sobrenadante pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius como estoque de semente em um mililitro. Aliquotas para uso futuro devem sempre ser congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para prevenir a perda de partículas virais infecciosas. Para purificar o VSR, comece colocando um tubo de centrífuga estéril em cada balde de uma ultracentrífuga.

Em seguida, adicione cinco mililitros de solução de sacarose recém-preparada e esterilizada por filtração ao fundo de cada tubo. Depois, muito lentamente, adicione 30 mililitros da solução de VSR sobre a solução de sacarose, tomando cuidado para não perturbar a solução de sacarose e manter as camadas distintas. Então, em uma cabine de fluxo para manter a esterilidade, equilibre cuidadosamente os seis baldes de ultracentrifugação com PBS estéril, de modo que a diferença entre eles seja de até 0,1 grama, incluindo as tampas. Centrifugue o vírus por 1,5 hora a 20.000 RCF e 4 graus Celsius.

Em seguida, ao finalizar a centrifugação, utilize uma pinça estéril para remover cuidadosamente os tubos de centrífuga dos suportes. As partículas virais terão atravessado a camada de sacarose, formando um precipitado. Incline os tubos de centrífuga sobre um frasco de resíduo viral e deixe-os escorrer com a abertura voltada para baixo sobre uma superfície estéril.

Não deixe o pellet secar completamente. Em seguida, deixe cuidadosamente um mililitro de HPSS escorrer sobre o pellet e incline o tubo de centrífuga novamente para drenar o HPSS. Em seguida, vire o tubo de cabeça para baixo novamente, tomando cuidado para evitar que o pellet seque.

Agora, pipete o pellet 40 vezes em mais um mililitro de HBSS, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas, pois isso pode destruir o vírus. Em seguida, congele rapidamente alíquotas do vírus em nitrogênio líquido. Armazene o vírus a menos 80 graus Celsius até a quantificação e uso posterior. Após obter sangue em tubos de 10 mililitros com EDTA de voluntários saudáveis, dilua o sangue com PBS à temperatura ambiente até duas vezes, até um máximo de 35 mililitros de sangue diluído em um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, acople uma agulha estéril com trava de segurança a uma seringa estéril de 50 mililitros e aspire o meio de gradiente de densidade para dentro da seringa. Coloque a agulha no fundo do tubo contendo o sangue diluído e pipete cuidadosamente 15 mililitros do meio de gradiente de densidade sob o sangue, mantendo uma distinção clara entre o gradiente de densidade e o sangue. Agora, separe as células por 20 minutos a 800 ×g, em temperatura ambiente, com aceleração máxima e freio desligado. Após a separação, os eritrócitos são encontrados no pellet no fundo do tubo, com uma camada esbranquiçada de neutrófilos na parte superior.

A camada clara acima do pellet contém o meio de gradiente de densidade e a camada fina entre o meio de gradiente de densidade e a camada de plasma sanguíneo na parte superior contém os pbmc. Utilize uma pipeta Pasteur para cuidadosamente coletar os pbmc e, em seguida, transfira as células para um novo tubo de 50 mililitros sobre gelo. Adicione PBS gelado até um volume de 50 mililitros e pelote as células após a conclusão da centrifugação.

Aspire o sobrenadante e lave o pellet em 50 mililitros de PBS gelado duas vezes; após a segunda lavagem, adicione um mililitro de meio gelado ao pellet, conte as células e ajuste a concentração celular para cinco vezes 10 à sexta pbmc por mililitro. Para estimular os pbmc com RSV vivo primeiro, adicione 100 microlitros de pbmc a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de dois estímulos recém-diluídos a cada um.

Incube bem a placa por 24 horas a 37 graus Celsius e 5%CO2, em seguida centrifugue a placa e colete o sobrenadante para análise posterior por ELISA. Os PBMC estimulados no pellet podem ser analisados por QPCR ou corados para citometria de fluxo. Ao realizar o experimento de estimulação A-P-B-M-C, sugere-se o método de fração de estímulos com este procedimento.

As condições são divididas em condições de estímulos padrão, como RPMI ou VSR humano, e condições com frações de teste, como mial, dipeptídeo ou LPS. Importante ressaltar que um controle negativo, como RPMI isolado, e um controle positivo, como LPS, são sempre incluídos em cada experimento. Após 24 horas de estimulação com VSR, diferentes populações de PBMC exibem uma taxa de infecção dependente da dose e uma diferença na eficiência de infecção pelo VSR. Após 24 horas de estimulação com o vírus, a análise por qPCR do RNA dos PBMCs para a expressão de TNF alfa ou interferon gama demonstra que o VSR induz uma forte upregulação da transcrição desses dois citocinas inflamatórias. Por outro lado, a estimulação com miam, dipeptídeo ou LPS resulta apenas em uma expressão fraca de mRNA.

Quando os BMCs de P são estimulados com o VSR e o dipeptídeo MIAL juntos, observa-se uma forte upregulação sinérgica. Os pbmc estimulados também foram analisados quanto à produção de TNF alfa ou interferon gama por ELIZA. Em contraste com as observações ao nível transcricional, o VSR é um indutor fraco da secreção proteica de TNF alfa e interferon gama, e a estimulação de BMCs p com o dipeptídeo MIAM resulta na produção de pequenas quantidades de TNF alfa e nenhuma de interferon gama.

De forma semelhante às análises transcricionais, tanto o TNF alfa quanto o interferon gama exibem uma upregulação sinérgica quando coestimulados com VSR e o dipeptídeo MIAM como controle, a fim de verificar se a indução de citocinas depende da replicação do VSR. As PBMCs foram estimuladas com VSR vivo ou inativado por beta-propanolactona, conforme ilustrado nos gráficos; tanto o VSR vivo quanto o inativado induziram a produção de citocinas pró-inflamatórias. Não se esqueça de que experimentos com VSR devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica, em laboratório de nível de biossegurança 2.

Além disso, ao tentar este método, é fundamental lembrar-se de utilizar reagentes e materiais livres de endotoxinas durante todo o procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimular PBMCs humanos com RSV e de vários ensaios que podem ser utilizados para analisar a resposta imune.