Name: Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a sintetizar complexos metálicos anticâncer de titânio e vanádio e avaliar sua citotoxicidade em linhagens celulares humanas usando o ensaio MTT. Este método determina valores de IC50 para desenvolver fármacos metálicos eficazes.

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O financiamento foi recebido do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) / ERC acordo Grant não [239603]

<ol><li> Preparação do V (V) complexo (Figura 2); 18 conduta passos 1,1-1,4 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, pule para a alternativa passos 2 (2,1-2,6). <ol><li> Dissolve-se 0,42 mmol de os ligandos H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em THF. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo. </li><li> Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. Ir para o passo 3. </li></ol></li><li> Prepare o complexo V (V) utilizando uma linha Schlenk. <ol><li> Dissolve-se 0,42 mmol do ligando com H 2 L de THF seco, num balão de Schlenk seco com uma tampa de septo, se ligar a uma linha de Schlenk e aplicar ambientes de vácuo / gás inerte (N2 ou Ar) alternadas, recomenda-se a aplicação de três such rodadas e esperar 2-5 minutos sobre os estágios de vácuo. </li><li> Adicionar THF seco através de uma seringa através da tampa de septo. </li><li> Adicionar quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em uma solução de THF, o qual tinha sido preparado de modo semelhante ligando um balão de Schlenk seco adequado para a linha, a aplicação de um ambiente inerte e adicionando os reagentes através de uma seringa a partir da solução de vanádio ao do o ligando. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo e, se houver um problema de produtos instáveis, executar tipo Schlenk de destilação dos produtos voláteis sob uma atmosfera inerte; utilizar o fluxo de gás inerte, para fixar o material de vidro necessário que tinha sido pré-seca . </li><li> Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. </li></ol></li><li> Preparação do Ti (IV) (Figura 2), sendo que 28 </sup&gt; conduta passos 3,1-3,3 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, ajuste as etapas alternativas discutidas para o análogo de vanádio (passo 2) que empregam uma linha Schlenk vez. <ol><li> Dissolve-se 0,35 mmol do ligando com H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de Ti (O i Pr) 4 em THF. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Remover os voláteis sob vácuo para se obter um produto amarelo com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em Eppendorf frasco. </li></ol></li><li> Preparação de células HT-29 placa de 96 poços <ol><li> Cultura células HT-29 em de 75 cm 2 balão com meio RPMI-1640 que contém 1% de penicilina / estreptomicina antibióticos, 1% de L-glutamina, e 10% de soro fetal bovino (FBS), a 37 ° C com 5% de CO 2 . </li><li> Remova o meio quando as células HT-29 a confluência máxima (90-100%, a cada 3-4 dias sem subcultura). Lava-se com 1 mlsolução de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e removê-lo. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina (0,25%) de solução / EDTA (0,05%) e incubar durante 5 min. </li><li> Retire as células HT-29 do frasco e adicionar 10 ml do meio de desativar a atividade de tripsina. Transferir 5 ml da mistura de células para um tubo. </li><li> Usar uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura de células em câmara de contador. A câmara de contador inclui 5 x 5 quadrados. </li><li> Contar as células em 5 quadrados representativos utilizando um microscópio: as quatro quadrados nos cantos e aquele que está no meio. </li><li> Calcule a quantidade estimada de células presentes. Soma as células nos 5 quadrados representativos e dividir por 20. </li><li> Divida 0,6 pelo resultado do passo 4.7. O número recebido é a quantidade de mistura de células é necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 0,6 x 10 6 células (9000 células por poço). </li><li> Use pipeta para transferir a quantidade de mistura de células necessária por pfinal (como calculado na secção 4.8) e adicionar 13,2 mL de meio (200 ul por poço × 66 poços). </li><li> Adicionar a mistura a placa de 96 poços com uma pipeta de 11 canais (200 ul por poço, 6 linhas, 66 cavidades no total). Um bem de cada linha deve permanecer vazio para o controle em branco. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir que as células se fixem à placa. </li></ol></li><li> A inserção dos compostos <ol><li> Adicionar 200 mL (ou quantidade diferente de acordo com o intervalo de concentração desejada) de THF seco, a 8 mg de cada composto pesados, como descrito no passo 1.4 (ou 2,6) ou 3,3. Pesar 8 mg do ligando H 2 L, também. </li><li> Diluir cada solução composto ainda pela adição de 60 mL de THF em 9 tubos Eppendorf diferentes. </li><li> Com uma pipeta de 60 uL da mistura na secção 5.1 para o primeiro frasco de Eppendorf, e ressuspender a transferência de 60 uL para a próxima frasco, e assim por diante até 10 concentrações diferentes são obtained (incluindo a mistura de pai na seção 5.1). </li><li> Dilui-se 20 ul de cada concentração em THF com 180 ul de meio. </li><li> Prepara-se uma solução de controlo com apenas THF, 20 mL de THF, com 180 mL de meio em cada medição. </li><li> Adicionar 10 ml da solução resultante (incluindo o controlo de THF), a cada poço, que já contém 200 ul da solução de células no meio acima referido para dar as concentrações finais do composto de até 200 mg / L (a gama de concentração pode ser alterado de acordo com a atividade composto). </li><li> Pode observar alguma precipitação na maior concentração aplicada, dependendo da solubilidade do composto. </li><li> Repetir a cada medição das 3x compostos (3 linhas na placa do mesmo composto); cada linha contém: células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes, uma bem contendo células tratadas apenas com dissolvente para o controlo e um poço sem células para branco controle. </li><li> Incubar a placa carregada durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO2. </li></ol></li><li> Medição da citotoxicidade utilizando o teste de MTT <ol><li> Preparar a solução de MTT através da adição de 1 g de MTT em pó a uma solução de meio RPMI-1640 de 200 ml, sem vermelho de fenol. A solução-mãe pode ser dividido para tubos de 15 mL e armazenado em -20 ° C. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de MTT a cada poço utilizando uma pipeta de 11 canais (excepto aos poços de controlo em branco, sem as células do passo 4.10), e incuba-se a placa durante 3 horas adicionais. </li><li> Remover a solução de meio de cada poço. </li><li> Adicionar 200 mL de isopropanol a cada cavidade para dissolver o formazano. Agita-se a placa, durante 0,5 horas até que a homogeneidade é alcançada. </li><li> Medir a absorvância a 550 nm para 200 ul da solução acima referida por um espectrofotómetro leitor de microplacas. </li><li> Repita cada medida (que inclui 3 repetições, veja o passo 5.8) em 3 dias diferentes. </li><li> Calcule tele percentagem de viabilidade celular, deduzindo o valor de absorvência de controlo em branco a partir do valor medido, dividindo o resultado pela absorvância do valor de controlo de solvente THF e multiplicando por 100%. </li><li> Calcular os valores de IC50 utilizando o software GraphPad Prism (ou equivalente). </li><li> O IC 50 é reportado a média de todos os valores de IC 50 recolhidos em, pelo menos, três dias diferentes, e o valor de erro é o desvio padrão. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método descrito neste manuscrito combina a síntese química, com ensaio de viabilidade de células biológicas. Tal como acontece com todos os métodos biológicos em matéria de células viáveis, é fundamental para o trabalho em uma capa laminar, e manter condições estéreis, incluindo o uso de solventes orgânicos estéreis. Além disso, a preparação e armazenamento de medicamentos à base de metal hidroliticamente instável deve ser realizado sob condições inertes, para o qual devem ser utilizadas técnicas de caixa de luvas ou ...

A quimioterapia ainda é um dos principais cursos de tratamentos utilizados na clínica para várias doenças cancerosas, e, assim, grande quantidade de pesquisa é conduzida em todo o mundo com o objetivo de desenvolver novas e melhores drogas anticâncer. Tais estudos principalmente começar no nível químico, com a concepção e preparação de compostos, seguido de avaliação biológica das propriedades citotóxicas in vitro. A viabilidade celular pode ser avaliada por vários ensaios que fornecem informações sobre a actividade celular 1-2. A cisplatina é um exemplo de um complexo de platina que é largamente utilizado como um fármaco quimioterapêutico, que é considerado um tratamento eficaz principalmente para testiculares e ovarianos cancros 3-4. No entanto, a sua gama de atividade estreito e efeitos colaterais graves desencadear estudos de outros complexos de metais de transição potente 5-8. Entre outros, de titânio (IV) e vanádio (V) os complexos apresentaram resultados promissores de actividade elevada e reduzidatoxicidade 9-16. Ti (IV) foram os primeiros a entrar em ensaios clínicos após a cisplatina, devido a essas propriedades, no entanto, eles não conseguiram os ensaios devido a dificuldades de formulação e instabilidade hidrolítica. Há, portanto, uma necessidade atual para desenvolver melhores derivados destes complexos metálicos que podem combinar alta atividade anticâncer com resistência à água 15,17-21. Um desafio para a preparação de Ti (IV) e V (V) refere-se a complexos de a instabilidade hidrolítica dos reagentes precursores e, portanto, a atmosfera inerte deve ser mantida. A preparação de Ti (IV) e V (V) os compostos é realizado sob N 2 ou Ar condições em uma caixa de luvas ou usando técnicas de linha Schlenk. Um método comum para a avaliação da actividade anti-cancro baseia-se em MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-) ensaio. Este ensaio é um ensaio colorimétrico de viabilidade que foi apresentada, em 1983, por Mosmann22. É extremamente bem estudada e caracterizada, e considera-se altamente eficiente quando se avalia a eficácia de novos compostos citotóxicos devido à sua precisão, rapidez, e sua capacidade de ser aplicada em diversas linhas celulares. Este ensaio de viabilidade é baseado na mudança de cor da molécula MTT quando ele é exposto a células viáveis. A medição da absorbância, a qual é proporcional ao número de células viáveis ​​e, em comparação com controlos não tratados, permite a avaliação da capacidade de inibição do crescimento celular do composto testado. O teste colorimétrico de MTT é conduzido num formato de placa de 96 poços 23. As células podem exigir pré-incubação dos poços antes da adição da droga testada. Os tempos de pré-incubação pode variar de 0-24 horas de acordo com as propriedades da linha celular. As células são normalmente expostas ao fármaco durante 24-96 horas, dependendo da actividade do fármaco. Solução de MTT é então adicionado às células tratadas, em que o gritoow MTT é reduzido a formazano púrpura por uma variedade de enzimas mitocondriais e citosólicas que são operacionais em células viáveis ​​(Figura 1) 24. A molécula de MTT não é reduzido por células mortas e células vermelhas do sangue (células metabolicamente inactivas), as células de baço (células em repouso) e linfócitos estimulados com concanavalina A (células activadas) 22. Depois de 3-4 horas de incubação com MTT os precipitados formazana. A formação do formazano começa após 0,5 horas de incubação, mas para melhores resultados, é melhor para expor as células à MTT durante pelo menos 3 h 22. Consequentemente, o meio de cultura é removido e o formazano é dissolvido num solvente orgânico, de preferência isopropanol, 25, apesar de DMSO também pode ser usado 26. A eliminação do meio é crucial para a obtenção de resultados precisos desde vermelho de fenol, que é amplamente comum em meio de crescimento, e precipitando proteínas pode interferir com a medição de absorção 25. Quando a formasolução zan atinge homogénea, a absorvância da solução é medida utilizando um espectrofotómetro leitor de microplacas. A absorvância a 550 nm é directamente proporcional ao número de células na gama de 200-50,000 células por cavidade, e, assim, quantidades muito pequenas de células pode ser detectado 22. A absorvância indica a quantidade de células viáveis ​​que permaneceram após o tratamento com a droga, e é comparada com a absorvância de células de controle que não foram expostas ao fármaco. Análise dos resultados por software apropriado proporciona a IC50 (concentração de inibição, 50%) e os seus valores com base em erros estatísticos de várias repetições da medição. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade para a triagem de novos compostos anti-cancerígenos, devido a sua precisão e simplicidade relativa. No entanto, quando se utiliza o ensaio de MTT, que é dependia da reacção enzimática, deve-se considerar que os vários inibidores de enzimas pode afectar a redução de MTT umd levar a resultados falsos 27. Além disso, o ensaio de MTT não fornece qualquer informação sobre o mecanismo molecular da actividade citotóxica do fármaco 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexano AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Seco usando um sistema de secagem por solvente</td></tr><tr><td>Linha celular HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos penicilina/estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 com vermelho de fenol com L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI sem vermelho de fenol</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>seco usando um sistema de secagem por solvente</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>sensível à umidade</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>umidade sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>pipeta de 12 canais 30-300 &mu; l</td><td>Pipeta de</td> 12 canais Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Finnpipeta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 frasco</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços com tampa (fundo plano)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Pasta da incubadora</td><td></td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Câmara contrária</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Eppendorf</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de luvas</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capô de fluxo laminar</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas espectrofotômetro</td><td>Microscópio Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr> Nikon <tr><td></td><td></td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20-200 &mu; l</td><td>Pipeta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anticâncer metal complexos: síntese e avaliação de citotoxicidade pelo ensaio mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

De titânio (IV) e vanádio (V) são complexos de agentes anticancerígenos altamente potentes. Um desafio na sua síntese refere-se à sua instabilidade hidrolítica, pelo que a sua preparação deve ser conduzida sob uma atmosfera inerte. Avaliação da actividade anti-cancerígena destes complexos pode ser alcançado através do ensaio MTT. O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico baseado na viabilidade de redução enzimática da molécula de MTT para formazan, quando ele é exposto a células viáveis. O resultado da redução é uma mudança de cor da molécula de MTT. As medições de absorvância em relação a um controlo de determinar a percentagem de células cancerosas remanescentes viáveis ​​após o seu tratamento com diversas concentrações de um composto de ensaio, que é traduzido para a actividade anti-cancerígena composto e os seus valores de IC 50. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade devido à sua precisão, rapidez e simplicidade relativa. Aqui nós preenviado um protocolo detalhado para a síntese de medicamentos à base de ar de metal sensível e de medições de viabilidade de células, incluindo a preparação de placas celulares, a incubação dos compostos com as células, medições de viabilidade usando o ensaio de MTT, e determinação dos valores de IC 50.

Os complexos foram elaboradas com base em procedimentos estabelecidos 18,28 e sua pureza pode ser avaliada por análise de RMN e elementar. Os dados recebidos a partir do ensaio de MTT é analisada para avaliar a citotoxicidade do composto 18,21. Em primeiro lugar, a subtracção do valor de absorvência de controlo em branco a partir de todos os outros valores é realizada. Em segundo lugar, o valor de controlo de solvente THF é definida como 100% de viabilidade, como não fo...

Um método para a síntese de titânio e vanádio anticancerígenos agentes sensíveis ao ar é descrito, juntamente com a avaliação da sua actividade citotóxica no sentido de linha de células de cancro humano por o Ensaio MTT.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fármacos metálicos anti-câncer e avaliar sua citotoxicidade por meio do ensaio MTT. Isso é realizado primeiramente sintetizando compostos anti-câncer à base de metais. O segundo passo é preparar placas de 96 poços contendo células cancerígenas.Em seguida, os compostos anticancerígenos à base de metal são inseridos nas células cancerígenas. O passo final consiste em medir a viabilidade celular pelo ensaio MTT, no qual a redução do MTT por enzimas mitocondriais e citosólicas para formar formazan é medida, determinando-se, por fim, a atividade anticancerígena e a concentração inibitória máxima semielítica. Os valores de CI50 dos compostos são determinados.Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois se trata de um procedimento com múltiplas etapas que exige atenção total do profissional do laboratório e segue uma linha do tempo rigorosa. A demonstração visual deste método é essencial, já que o preparo da placa de células não é simples, pois o trabalho com células viáveis exige o cumprimento de diretrizes específicas. Trabalhando em uma caixa de luvas, prepare o complexo de vanádio cinco dissolvendo 0,42 milimol do

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

O MTT é um ensaio simples e reprodutível colorimétrico para avaliação de viabilidade celular com base na redução do MTT amarelo e produção de formazan insolúvel em água roxa. Aqui, a viabilidade de células MCF-7 sobre o tratamento de nanogenomedicine foi avaliada.

Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Este vídeo descreve o ensaio colorimétrico, ensaio de metil tiazol tetrazólio (MTT), para medir a citotoxicidade induzida por drogas em células cancerígenas e determinar sua atividade metabólica. Este ensaio é baseado na conversão metabólica de sais de tetrazólio em produtos coloridos, refletindo a atividade mitocondrial das células.

Ensaio de metil tiazolil tetrazólio ou MTT: um ensaio colorimétrico para medir a resistência a medicamentos por meio da determinação da atividade metabólica em células cancerígenas

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

Esta metodologia visa avaliar a citotoxicidade de biomateriais através da preparação de extratos solúveis, utilizando ensaios de viabilidade e análise fenotípica, incluindo citometria de fluxo, RT-PCR, imunocitoquímica e outras técnicas de biologia celular e molecular.

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Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Aprenda a sintetizar complexos metálicos anticâncer de titânio e vanádio e avaliar sua citotoxicidade em linhagens celulares humanas usando o ensaio MTT. Este método determina valores de IC50 para desenvolver fármacos metálicos eficazes.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

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