Name: Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a sintetizar complexos metálicos anticâncer de titânio e vanádio e avaliar sua citotoxicidade em linhagens celulares humanas usando o ensaio MTT. Este método determina valores de IC50 para desenvolver fármacos metálicos eficazes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O financiamento foi recebido do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) / ERC acordo Grant não [239603]

<ol><li> Preparação do V (V) complexo (Figura 2); 18 conduta passos 1,1-1,4 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, pule para a alternativa passos 2 (2,1-2,6). <ol><li> Dissolve-se 0,42 mmol de os ligandos H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em THF. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo. </li><li> Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. Ir para o passo 3. </li></ol></li><li> Prepare o complexo V (V) utilizando uma linha Schlenk. <ol><li> Dissolve-se 0,42 mmol do ligando com H 2 L de THF seco, num balão de Schlenk seco com uma tampa de septo, se ligar a uma linha de Schlenk e aplicar ambientes de vácuo / gás inerte (N2 ou Ar) alternadas, recomenda-se a aplicação de três such rodadas e esperar 2-5 minutos sobre os estágios de vácuo. </li><li> Adicionar THF seco através de uma seringa através da tampa de septo. </li><li> Adicionar quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em uma solução de THF, o qual tinha sido preparado de modo semelhante ligando um balão de Schlenk seco adequado para a linha, a aplicação de um ambiente inerte e adicionando os reagentes através de uma seringa a partir da solução de vanádio ao do o ligando. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo e, se houver um problema de produtos instáveis, executar tipo Schlenk de destilação dos produtos voláteis sob uma atmosfera inerte; utilizar o fluxo de gás inerte, para fixar o material de vidro necessário que tinha sido pré-seca . </li><li> Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. </li></ol></li><li> Preparação do Ti (IV) (Figura 2), sendo que 28 </sup&gt; conduta passos 3,1-3,3 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, ajuste as etapas alternativas discutidas para o análogo de vanádio (passo 2) que empregam uma linha Schlenk vez. <ol><li> Dissolve-se 0,35 mmol do ligando com H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de Ti (O i Pr) 4 em THF. </li><li> Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Remover os voláteis sob vácuo para se obter um produto amarelo com um rendimento quantitativo. </li><li> Pesar 8 mg do composto obtido em Eppendorf frasco. </li></ol></li><li> Preparação de células HT-29 placa de 96 poços <ol><li> Cultura células HT-29 em de 75 cm 2 balão com meio RPMI-1640 que contém 1% de penicilina / estreptomicina antibióticos, 1% de L-glutamina, e 10% de soro fetal bovino (FBS), a 37 ° C com 5% de CO 2 . </li><li> Remova o meio quando as células HT-29 a confluência máxima (90-100%, a cada 3-4 dias sem subcultura). Lava-se com 1 mlsolução de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e removê-lo. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina (0,25%) de solução / EDTA (0,05%) e incubar durante 5 min. </li><li> Retire as células HT-29 do frasco e adicionar 10 ml do meio de desativar a atividade de tripsina. Transferir 5 ml da mistura de células para um tubo. </li><li> Usar uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura de células em câmara de contador. A câmara de contador inclui 5 x 5 quadrados. </li><li> Contar as células em 5 quadrados representativos utilizando um microscópio: as quatro quadrados nos cantos e aquele que está no meio. </li><li> Calcule a quantidade estimada de células presentes. Soma as células nos 5 quadrados representativos e dividir por 20. </li><li> Divida 0,6 pelo resultado do passo 4.7. O número recebido é a quantidade de mistura de células é necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 0,6 x 10 6 células (9000 células por poço). </li><li> Use pipeta para transferir a quantidade de mistura de células necessária por pfinal (como calculado na secção 4.8) e adicionar 13,2 mL de meio (200 ul por poço × 66 poços). </li><li> Adicionar a mistura a placa de 96 poços com uma pipeta de 11 canais (200 ul por poço, 6 linhas, 66 cavidades no total). Um bem de cada linha deve permanecer vazio para o controle em branco. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir que as células se fixem à placa. </li></ol></li><li> A inserção dos compostos <ol><li> Adicionar 200 mL (ou quantidade diferente de acordo com o intervalo de concentração desejada) de THF seco, a 8 mg de cada composto pesados, como descrito no passo 1.4 (ou 2,6) ou 3,3. Pesar 8 mg do ligando H 2 L, também. </li><li> Diluir cada solução composto ainda pela adição de 60 mL de THF em 9 tubos Eppendorf diferentes. </li><li> Com uma pipeta de 60 uL da mistura na secção 5.1 para o primeiro frasco de Eppendorf, e ressuspender a transferência de 60 uL para a próxima frasco, e assim por diante até 10 concentrações diferentes são obtained (incluindo a mistura de pai na seção 5.1). </li><li> Dilui-se 20 ul de cada concentração em THF com 180 ul de meio. </li><li> Prepara-se uma solução de controlo com apenas THF, 20 mL de THF, com 180 mL de meio em cada medição. </li><li> Adicionar 10 ml da solução resultante (incluindo o controlo de THF), a cada poço, que já contém 200 ul da solução de células no meio acima referido para dar as concentrações finais do composto de até 200 mg / L (a gama de concentração pode ser alterado de acordo com a atividade composto). </li><li> Pode observar alguma precipitação na maior concentração aplicada, dependendo da solubilidade do composto. </li><li> Repetir a cada medição das 3x compostos (3 linhas na placa do mesmo composto); cada linha contém: células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes, uma bem contendo células tratadas apenas com dissolvente para o controlo e um poço sem células para branco controle. </li><li> Incubar a placa carregada durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO2. </li></ol></li><li> Medição da citotoxicidade utilizando o teste de MTT <ol><li> Preparar a solução de MTT através da adição de 1 g de MTT em pó a uma solução de meio RPMI-1640 de 200 ml, sem vermelho de fenol. A solução-mãe pode ser dividido para tubos de 15 mL e armazenado em -20 ° C. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de MTT a cada poço utilizando uma pipeta de 11 canais (excepto aos poços de controlo em branco, sem as células do passo 4.10), e incuba-se a placa durante 3 horas adicionais. </li><li> Remover a solução de meio de cada poço. </li><li> Adicionar 200 mL de isopropanol a cada cavidade para dissolver o formazano. Agita-se a placa, durante 0,5 horas até que a homogeneidade é alcançada. </li><li> Medir a absorvância a 550 nm para 200 ul da solução acima referida por um espectrofotómetro leitor de microplacas. </li><li> Repita cada medida (que inclui 3 repetições, veja o passo 5.8) em 3 dias diferentes. </li><li> Calcule tele percentagem de viabilidade celular, deduzindo o valor de absorvência de controlo em branco a partir do valor medido, dividindo o resultado pela absorvância do valor de controlo de solvente THF e multiplicando por 100%. </li><li> Calcular os valores de IC50 utilizando o software GraphPad Prism (ou equivalente). </li><li> O IC 50 é reportado a média de todos os valores de IC 50 recolhidos em, pelo menos, três dias diferentes, e o valor de erro é o desvio padrão. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método descrito neste manuscrito combina a síntese química, com ensaio de viabilidade de células biológicas. Tal como acontece com todos os métodos biológicos em matéria de células viáveis, é fundamental para o trabalho em uma capa laminar, e manter condições estéreis, incluindo o uso de solventes orgânicos estéreis. Além disso, a preparação e armazenamento de medicamentos à base de metal hidroliticamente instável deve ser realizado sob condições inertes, para o qual devem ser utilizadas técnicas de caixa de luvas ou ...

A quimioterapia ainda é um dos principais cursos de tratamentos utilizados na clínica para várias doenças cancerosas, e, assim, grande quantidade de pesquisa é conduzida em todo o mundo com o objetivo de desenvolver novas e melhores drogas anticâncer. Tais estudos principalmente começar no nível químico, com a concepção e preparação de compostos, seguido de avaliação biológica das propriedades citotóxicas in vitro. A viabilidade celular pode ser avaliada por vários ensaios que fornecem informações sobre a actividade celular 1-2. A cisplatina é um exemplo de um complexo de platina que é largamente utilizado como um fármaco quimioterapêutico, que é considerado um tratamento eficaz principalmente para testiculares e ovarianos cancros 3-4. No entanto, a sua gama de atividade estreito e efeitos colaterais graves desencadear estudos de outros complexos de metais de transição potente 5-8. Entre outros, de titânio (IV) e vanádio (V) os complexos apresentaram resultados promissores de actividade elevada e reduzidatoxicidade 9-16. Ti (IV) foram os primeiros a entrar em ensaios clínicos após a cisplatina, devido a essas propriedades, no entanto, eles não conseguiram os ensaios devido a dificuldades de formulação e instabilidade hidrolítica. Há, portanto, uma necessidade atual para desenvolver melhores derivados destes complexos metálicos que podem combinar alta atividade anticâncer com resistência à água 15,17-21. Um desafio para a preparação de Ti (IV) e V (V) refere-se a complexos de a instabilidade hidrolítica dos reagentes precursores e, portanto, a atmosfera inerte deve ser mantida. A preparação de Ti (IV) e V (V) os compostos é realizado sob N 2 ou Ar condições em uma caixa de luvas ou usando técnicas de linha Schlenk. Um método comum para a avaliação da actividade anti-cancro baseia-se em MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-) ensaio. Este ensaio é um ensaio colorimétrico de viabilidade que foi apresentada, em 1983, por Mosmann22. É extremamente bem estudada e caracterizada, e considera-se altamente eficiente quando se avalia a eficácia de novos compostos citotóxicos devido à sua precisão, rapidez, e sua capacidade de ser aplicada em diversas linhas celulares. Este ensaio de viabilidade é baseado na mudança de cor da molécula MTT quando ele é exposto a células viáveis. A medição da absorbância, a qual é proporcional ao número de células viáveis ​​e, em comparação com controlos não tratados, permite a avaliação da capacidade de inibição do crescimento celular do composto testado. O teste colorimétrico de MTT é conduzido num formato de placa de 96 poços 23. As células podem exigir pré-incubação dos poços antes da adição da droga testada. Os tempos de pré-incubação pode variar de 0-24 horas de acordo com as propriedades da linha celular. As células são normalmente expostas ao fármaco durante 24-96 horas, dependendo da actividade do fármaco. Solução de MTT é então adicionado às células tratadas, em que o gritoow MTT é reduzido a formazano púrpura por uma variedade de enzimas mitocondriais e citosólicas que são operacionais em células viáveis ​​(Figura 1) 24. A molécula de MTT não é reduzido por células mortas e células vermelhas do sangue (células metabolicamente inactivas), as células de baço (células em repouso) e linfócitos estimulados com concanavalina A (células activadas) 22. Depois de 3-4 horas de incubação com MTT os precipitados formazana. A formação do formazano começa após 0,5 horas de incubação, mas para melhores resultados, é melhor para expor as células à MTT durante pelo menos 3 h 22. Consequentemente, o meio de cultura é removido e o formazano é dissolvido num solvente orgânico, de preferência isopropanol, 25, apesar de DMSO também pode ser usado 26. A eliminação do meio é crucial para a obtenção de resultados precisos desde vermelho de fenol, que é amplamente comum em meio de crescimento, e precipitando proteínas pode interferir com a medição de absorção 25. Quando a formasolução zan atinge homogénea, a absorvância da solução é medida utilizando um espectrofotómetro leitor de microplacas. A absorvância a 550 nm é directamente proporcional ao número de células na gama de 200-50,000 células por cavidade, e, assim, quantidades muito pequenas de células pode ser detectado 22. A absorvância indica a quantidade de células viáveis ​​que permaneceram após o tratamento com a droga, e é comparada com a absorvância de células de controle que não foram expostas ao fármaco. Análise dos resultados por software apropriado proporciona a IC50 (concentração de inibição, 50%) e os seus valores com base em erros estatísticos de várias repetições da medição. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade para a triagem de novos compostos anti-cancerígenos, devido a sua precisão e simplicidade relativa. No entanto, quando se utiliza o ensaio de MTT, que é dependia da reacção enzimática, deve-se considerar que os vários inibidores de enzimas pode afectar a redução de MTT umd levar a resultados falsos 27. Além disso, o ensaio de MTT não fornece qualquer informação sobre o mecanismo molecular da actividade citotóxica do fármaco 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexano AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Seco usando um sistema de secagem por solvente</td></tr><tr><td>Linha celular HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos penicilina/estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 com vermelho de fenol com L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI sem vermelho de fenol</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>seco usando um sistema de secagem por solvente</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>sensível à umidade</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>umidade sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>pipeta de 12 canais 30-300 &mu; l</td><td>Pipeta de</td> 12 canais Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Finnpipeta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 frasco</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços com tampa (fundo plano)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Pasta da incubadora</td><td></td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Câmara contrária</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Eppendorf</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de luvas</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capô de fluxo laminar</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas espectrofotômetro</td><td>Microscópio Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr> Nikon <tr><td></td><td></td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20-200 &mu; l</td><td>Pipeta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anticâncer metal complexos: síntese e avaliação de citotoxicidade pelo ensaio mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

De titânio (IV) e vanádio (V) são complexos de agentes anticancerígenos altamente potentes. Um desafio na sua síntese refere-se à sua instabilidade hidrolítica, pelo que a sua preparação deve ser conduzida sob uma atmosfera inerte. Avaliação da actividade anti-cancerígena destes complexos pode ser alcançado através do ensaio MTT. O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico baseado na viabilidade de redução enzimática da molécula de MTT para formazan, quando ele é exposto a células viáveis. O resultado da redução é uma mudança de cor da molécula de MTT. As medições de absorvância em relação a um controlo de determinar a percentagem de células cancerosas remanescentes viáveis ​​após o seu tratamento com diversas concentrações de um composto de ensaio, que é traduzido para a actividade anti-cancerígena composto e os seus valores de IC 50. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade devido à sua precisão, rapidez e simplicidade relativa. Aqui nós preenviado um protocolo detalhado para a síntese de medicamentos à base de ar de metal sensível e de medições de viabilidade de células, incluindo a preparação de placas celulares, a incubação dos compostos com as células, medições de viabilidade usando o ensaio de MTT, e determinação dos valores de IC 50.

Os complexos foram elaboradas com base em procedimentos estabelecidos 18,28 e sua pureza pode ser avaliada por análise de RMN e elementar. Os dados recebidos a partir do ensaio de MTT é analisada para avaliar a citotoxicidade do composto 18,21. Em primeiro lugar, a subtracção do valor de absorvência de controlo em branco a partir de todos os outros valores é realizada. Em segundo lugar, o valor de controlo de solvente THF é definida como 100% de viabilidade, como não fo...

Um método para a síntese de titânio e vanádio anticancerígenos agentes sensíveis ao ar é descrito, juntamente com a avaliação da sua actividade citotóxica no sentido de linha de células de cancro humano por o Ensaio MTT.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fármacos metálicos anti-câncer e avaliar sua citotoxicidade por meio do ensaio MTT. Isso é realizado primeiramente sintetizando compostos anti-câncer à base de metais. O segundo passo é preparar placas de 96 poços contendo células cancerígenas.Em seguida, os compostos anticancerígenos à base de metal são inseridos nas células cancerígenas. O passo final consiste em medir a viabilidade celular pelo ensaio MTT, no qual a redução do MTT por enzimas mitocondriais e citosólicas para formar formazan é medida, determinando-se, por fim, a atividade anticancerígena e a concentração inibitória máxima semielítica. Os valores de CI50 dos compostos são determinados.Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois se trata de um procedimento com múltiplas etapas que exige atenção total do profissional do laboratório e segue uma linha do tempo rigorosa. A demonstração visual deste método é essencial, já que o preparo da placa de células não é simples, pois o trabalho com células viáveis exige o cumprimento de diretrizes específicas. Trabalhando em uma caixa de luvas, prepare o complexo de vanádio cinco dissolvendo 0,42 milimol do precursor do ligante em THF seco.Em seguida, adicione-o a uma solução sob agitação contendo quantidades equivalentes de óxido de vanádio ou tris isopóxido em THF. Agite a mistura reacional à temperatura ambiente durante 15 minutos antes de remover os voláteis sob vácuo. A seguir, adicione hexano frio e remova-o sob vácuo.Deve-se obter um pó roxo escuro com rendimento quantitativo. Pese oito miligramas do composto obtido em um frasco tipo epi ou orph. Para preparar o complexo de titânio quatro, dissolva 0,35 milimol do precursor do ligante em THF seco e adicione-o a uma solução sob agitação contendo quantidades equivalentes de tetraisopropóxido de titânio em THF.Agite a mistura reacional à temperatura ambiente durante duas horas. Em seguida, remova os voláteis sob vácuo para obter um produto amarelo com rendimento quantitativo. Pese oito miligramas do composto obtido em um frasco de eppendorf para preparar as células HT 29 em uma placa de 96 poços para cultura inicial.As células em um frasco de 75 centímetros quadrados conforme descrito no protocolo no texto, remova o meio quando as células HT 29 atingirem confluência máxima. Após lavar as células com um mililitro de solução de tripsina-EDTA, adicione um mililitro da mesma solução e incube por cinco minutos. Detaque as células HT 29 do frasco e adicione 10 mililitros do meio para inativar a atividade da tripsina.Transfira cinco mililitros da mistura celular para um tubo. Use uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura celular para uma câmara de contagem. A câmara de contagem possui duas partes com quadrados de cinco por cinco.Conte as células em cinco quadrados representativos de cada parte usando um microscópio. Quatro quadrados nos cantos e um quadrado no centro. Calcule a quantidade estimada de células presentes.Somar as células nos cinco quadrados representativos de cada parte. Calcular a soma média das duas partes e dividir por 20. Em seguida, dividir 0,6 pelo quociente.O número recebido é a quantidade de mistura celular necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 9.000 células por poço. Usando uma pipeta, combine a quantidade de mistura celular necessária por placa com 13,2 mililitros do meio.Adicione a mistura a uma placa de 96 poços. Utilizando uma pipeta de 11 canais com 200 microlitros por poço em seis linhas contendo 66 poços no total. Um poço de cada linha deve permanecer vazio para a controle em branco.Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que as células adiram à placa. Para adicionar os compostos primeiro, adicione 200 microlitros de THF seco a oito miligramas do composto pesado. Dilua a solução do composto adicionalmente, adicionando primeiro 60 microlitros de THF em nove diferentes tubos Eppendorf. Para cada solução, use uma pipeta para transferir 60 microlitros da solução do composto para o primeiro tubo Eppendorf.Em seguida, reconstitua e transfira 60 microlitros para o próximo frasco e assim por diante até obter 10 concentrações diferentes. Prossiga diluindo 20 microlitros de cada concentração em THF com 180 microlitros de meio. Além disso, prepare uma solução controle contendo apenas o solvente, adicionando 20 microlitros de THF a 180 microlitros de meio.Em seguida, adicione 10 microlitros de cada solução resultante em cada poço. Isso já contém 200 microlitros da solução mencionada anteriormente de células no meio, para obter concentrações finais do composto de até 200 miligramas por litro. Cada linha contém células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes.Um poço controle contendo células tratadas apenas com solvente e um poço sem células para o controle em branco; prepare as linhas para repetir cada medição do composto três vezes. Incube a placa carregada por três dias a 37 graus Celsius em atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Prepare a solução de MTT conforme descrito no protocolo do texto, utilizando uma pipeta de 11 canais.Adicione 20 microlitros de solução de MTT a cada poço, exceto aos poços de controle em branco. Incube a placa por mais três horas após a incubação. Remova a solução do meio de cada poço e adicione 200 microlitros de isopropanol a cada poço.Para dissolver a formina, agite a placa por 30 minutos até ficar homogênea. Meça a absorbância a 550 nanômetros para 200 microlitros da solução homogênea utilizando um leitor de microplacas ou espectrofotômetro, repetindo cada medição em três dias diferentes. Em seguida, calcule a porcentagem de viabilidade celular subtraindo o valor de absorbância do controle em branco do valor medido, dividindo o resultado pelo valor de absorbância do controle com solvente THF e multiplicando por 100%. Calcule os valores da concentração inibitória máxima semielítica utilizando software de análise gráfica.A IC50 relatada é a média de todos os valores de IC50 coletados em pelo menos três dias diferentes, e o valor de erro é o desvio padrão. Os dados obtidos no ensaio de MTT são analisados para avaliar a citotoxicidade do composto. As medições devem ser realizadas em uma faixa de concentrações que produzirá um gráfico exibindo uma distribuição uniforme de pontos, com pelo menos três pontos em cada platô e três pontos para definir a inclinação.Medições insuficientes em altas ou baixas concentrações prejudicarão o ajuste da regressão não linear da curva necessária para a determinação dos valores de IC50, diminuindo, consequentemente, sua precisão. Os valores relativos de IC50 determinados pelo ajuste de regressão não linear correspondem às concentrações que levam à inibição de 50% do crescimento celular possível com o composto testado. Isso é calculado como o ponto médio entre a viabilidade celular máxima e mínima medida, que não são necessariamente 100% e 0%, respectivamente.Ao analisar os resultados dos experimentos descritos no protocolo, é evidente que o cisplatina, bem como os complexos de titânio e vanádio, são altamente ativos. Também é perceptível que quanto mais próximo o valor máximo de inibição de um determinado composto estiver de 100%, mais próximo o valor relativo de IC 50 estará do valor absoluto ao comparar os valores de IC 50 entre os diferentes compostos.O complexo de titânio quatro apresenta a maior citotoxicidade, e seus valores de CI50 são menores do que os do cisplatina e do complexo de vanádio cinco. No entanto, o ligante livre exibe atividade acentuadamente reduzida, uma vez que, após a adição do ligante em diferentes concentrações, a viabilidade celular não diminui de forma tão acentuada quanto ocorre com seus complexos.Isso garante que a alta atividade anti-câncer dos complexos dependa dos centros metálicos enquanto se realiza este procedimento. É importante manter condições estéreis em todos os momentos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a citotoxicidade de seus compostos anti-câncer pelo ensaio M-T-T-S-A.

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

O MTT é um ensaio simples e reprodutível colorimétrico para avaliação de viabilidade celular com base na redução do MTT amarelo e produção de formazan insolúvel em água roxa. Aqui, a viabilidade de células MCF-7 sobre o tratamento de nanogenomedicine foi avaliada.

Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Este vídeo descreve o ensaio colorimétrico, ensaio de metil tiazol tetrazólio (MTT), para medir a citotoxicidade induzida por drogas em células cancerígenas e determinar sua atividade metabólica. Este ensaio é baseado na conversão metabólica de sais de tetrazólio em produtos coloridos, refletindo a atividade mitocondrial das células.

Ensaio de metil tiazolil tetrazólio ou MTT: um ensaio colorimétrico para medir a resistência a medicamentos por meio da determinação da atividade metabólica em células cancerígenas

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

Esta metodologia visa avaliar a citotoxicidade de biomateriais através da preparação de extratos solúveis, utilizando ensaios de viabilidade e análise fenotípica, incluindo citometria de fluxo, RT-PCR, imunocitoquímica e outras técnicas de biologia celular e molecular.

Acessando a Citotoxicidade e a Resposta Celular a Biomateriais

Aqui, descrevemos um bioensaio usando brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para testar oximas espirocíclicos previamente sintetizados.

Síntese Espirocíclica Funcionalizada de Heterociclos e Ensaio de Citotoxicidade

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

O direcionamento farmacológico dos canais iônicos é uma abordagem promissora para o tratamento de tumores sólidos. Protocolos detalhados são fornecidos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e avaliar os efeitos de moduladores de canais iônicos na viabilidade do câncer.

Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Aprenda a sintetizar complexos metálicos anticâncer de titânio e vanádio e avaliar sua citotoxicidade em linhagens celulares humanas usando o ensaio MTT. Este método determina valores de IC50 para desenvolver fármacos metálicos eficazes.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Explorar mais vídeos