Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

O objetivo geral deste procedimento é preparar metalofármacos anticancerígenos e avaliar sua citotoxicidade pelo ensaio MTT. Isso é feito primeiro sintetizando compostos anticancerígenos à base de metal. O segundo passo é preparar placas de 96 poços de células cancerígenas.

Em seguida, os compostos anticancerígenos à base de metal são inseridos nas células cancerígenas. A etapa final é medir a viabilidade celular pelo ensaio de MTT, onde a redução de MTT por enzimas mitocondriais e citosólicas para formar zen é medida em última análise, a atividade anticancerígena e a metade da concentração inibitória máxima. Ou vejo que 50 valores dos compostos são determinados.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque é um procedimento de várias etapas que requer toda a atenção do trabalhador do laboratório e é colocado em um cronograma estrito. A demonstração visual desse método é fundamental, pois a preparação da placa celular não é simples porque trabalhar com células viáveis requer seguir diretrizes específicas. Trabalhando em um porta-luvas, prepare o complexo de vanádio cinco dissolvendo 0,42 milimole do precursor do ligante em THF seco.

Em seguida, adicione-o a uma solução agitadora de quantidades equivalentes de vanádio ou óxido de tris isop em THF. Mexa a mistura de reação em temperatura ambiente por 15 minutos antes de remover os voláteis sob vácuo. Em seguida, adicione um hexano frio e remova-o a vácuo.

Um pó roxo escuro deve ser obtido em um rendimento quantitativo. Pesar oito miligramas do composto obtido num frasco para injetáveis epiorph. Para preparar o complexo de titânio quatro, dissolva 0,35 milimol do precursor do ligante em THF seco e adicione-o a uma solução agitadora equivalente a quantidades de óxido tetra isop de titânio em THF.

Mexa a mistura de reação em temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, remova os voláteis sob vácuo para obter um produto amarelo com rendimento quantitativo. Pesar oito miligramas do composto obtido em um frasco de eph para preparar células HT 29 em uma primeira cultura de 96 poços.

As células em um frasco de 75 centímetros quadrados, conforme descrito no protocolo de texto, removem o meio quando as células HT 29 atingem a fluência máxima de co. Depois de lavar as células em um mililitro de solução de tripsina EDTA, adicione um mililitro da mesma solução e incube por cinco minutos. Retire as células HT 29 do frasco e adicione 10 mililitros do meio para desativar a atividade da tripsina.

Transfira cinco mililitros da mistura de células para um tubo. Use uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura de células para uma câmara de balcão. A câmara do contador inclui duas partes de cinco por cinco quadrados.

Conte as células em cinco quadrados representativos de cada parte usando um microscópio. Quatro quadrados nos cantos e um quadrado no meio. Calcule a quantidade estimada de células presentes.

Some as células nos cinco quadrados representativos de cada parte. Calcule a soma média das duas partes e divida por 20. Em seguida, divida 0,6 pelo quociente.

O número recebido é a quantidade de mistura de células necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 9.000 células por poço. Usando uma pipeta, combine a quantidade da mistura de células necessária por placa com 13,2 mililitros do meio.

Adicione a mistura a uma placa de 96 poços. Usando uma pipeta de 11 canais a 200 microlitros por poço em seis linhas contendo 66 poços no total. Um poço de cada linha deve permanecer vazio para o controle em branco.

Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que as células se liguem à placa para inserir os compostos primeiro, adicione 200 microlitros de THF seco a oito miligramas do composto de peso. Dilua ainda mais a solução composta adicionando primeiro 60 microlitros de THF em nove limas einor diferentes. Para cada solução, use uma pipeta para transferir 60 microlitros da solução composta para o primeiro arquivo einor.

Em seguida, ressus, suspenda e transfira 60 microlitros para o próximo frasco e assim por diante até que 10 concentrações diferentes sejam obtidas. Prossiga para diluir 20 microlitros de cada concentração em THF com 180 microlitros de meio. Além disso, prepare uma solução de controle somente solvente adicionando 20 microlitros de THF a 180 microlitros de meio.

Em seguida, adicione 10 microlitros de cada solução resultante a cada poço. Isso já contém 200 microlitros da solução de células acima mencionada no meio para dar concentrações finais do composto de até 200 miligramas por litro. Cada linha contém células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes.

Um, poço de controle contendo células tratadas apenas com solvente e um poço sem células Para o controle em branco, configure as linhas para repetir cada medição do composto três vezes. Incube a placa carregada por três dias a 37 graus Celsius em atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Preparar a solução MTT conforme descrito no protocolo de texto utilizando uma pipeta de 11 canais.

Adicione 20 microlitros de solução de MTT a cada poço, exceto os poços de controle em branco. Incube a placa por mais três horas após a incubação. Remova a solução média de cada poço e adicione 200 microlitros de isopropanol a cada poço.

Para dissolver a forma, agite a placa por 30 minutos até ficar homogênea. Meça a absorbância a 550 nanômetros para 200 microlitros da solução homogênea por um leitor de microplacas, espectrofotômetro repetindo cada medição em três dias diferentes. Em seguida, calcule a porcentagem de viabilidade celular deduzindo o valor de absorbância de controle em branco do valor medido, dividindo o resultado pela absorbância do valor de controle do solvente THF e multiplicando por 100% Calcule os valores de concentração inibitória máxima pela metade usando um software gráfico.

O IC 50 relatado é a média de todos os valores do IC 50 coletados em pelo menos três dias diferentes, e o valor do erro é o desvio padrão. Os dados recebidos do ensaio MTT são analisados para avaliar a citotoxicidade do composto. As medições devem ser realizadas em uma faixa de concentrações que produzirá um gráfico exibindo uma distribuição de pontos pares de pelo menos três pontos em cada platô e três pontos para definir a inclinação.

Medições insuficientes em altas ou baixas concentrações prejudicarão o ajuste de regressão não linear da curva necessária para a determinação dos valores de IC 50 e, como resultado, diminuirão sua precisão. Os valores relativos de IC 50, conforme determinado pelo ajuste de regressão não linear, correspondem às concentrações que levam a 50% da inibição do crescimento celular possível pelo composto testado. Isso é calculado como o ponto médio entre a viabilidade celular máxima e mínima medida, que não são necessariamente 100% e 0%, respectivamente.

Ao inspecionar os resultados dos experimentos descritos no protocolo. É claro que a cisplatina, bem como os complexos de titânio e vanádio, são altamente ativos. Também é perceptível que quanto mais próximo o valor máximo de inibição de um determinado composto estiver de 100%, mais próximo o valor relativo de IC 50 estará do absoluto ao comparar os valores de IC 50 entre os diferentes compostos.

O complexo de titânio quatro tem a maior citotoxicidade e seus valores de IC 50 são menores que os da cisplatina e do complexo Vanádio cinco. No entanto, o ligante livre exibe atividade marcadamente reduzida desde a adição do ligante em diferentes concentrações. A viabilidade celular não cai tão significativamente quanto para seus complexos.

Isso garante que a alta atividade anticancerígena dos complexos dependa dos centros de metal ao tentar este procedimento. É importante manter condições estéreis o tempo todo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a citotoxicidade de seus compostos anticancerígenos pelo MTSA.