Name: In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a rastrear células marcadas com 19F em camundongos usando ressonância magnética in vivo. Este protocolo permite quantificar células em tempo real para estudos de terapia celular.

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Gostaríamos de reconhecer Nadine Henn e Arend Heerschap por sua valiosa ajuda. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Holandês de Medicina Regenerativa (NIRM, FES0908), o ENCITE programa FP7 da União Europeia (HEALTH-F5-2008-201842) e TargetBraIn (HEALTH-F2-2012-279017), uma bolsa da Fundação Volkswagen ( I/83 443), a Organização Holandesa para Pesquisa Científica (VENI 700.10.409 e Vidi 917.76.363), ERC (Advanced Grant 269019) e Radboud University Nijmegen Medical Centre (AGIKO-2008-2-4).

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<li>Boehm-Sturm, P., Mengler, L., Wecker, S., Hoehn, M., Kallur, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+human+neural+stem+cells+with+19F+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of human neural stem cells with 19F magnetic resonance imaging.</a> PLoS One. 6, e29040(2011).</li>
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<li>Scheffler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pictorial+description+of+steady-states+in+rapid+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+Magn.+Res%22%5BJournal%5D)">A pictorial description of steady-states in rapid magnetic resonance imaging.</a> Concepts Magn. Res. 11, 291-304 (1999).</li>
<li>Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+two+methods+for+measuring+the+signal+to+noise+ratio+on+MR+images%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images.</a> Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar.

O protocolo descrito aqui descreve o procedimento geral para a in vivo 19 de rastreamento de células F ressonância magnética. Apesar do método de co-incubação descritas, existem vários protocolos diferentes para a marcação das células com um agente de F 19. No entanto, a co-incubação é mais frequentemente utilizado e pode ser optimizado adicional, por exemplo, por adição de agentes de transfecção 6. O protocolo de marcação celular real dependerá do tipo de célula. Apena...

Em rastreamento celular vivo é essencial para a otimização e monitoramento de terapias celulares 1. Devido à sua natureza não-invasiva, a imagem oferece excelentes oportunidades para monitorar as células in vivo. Imagem por Ressonância Magnética (MRI) é independente da radiação ionizante e permite uma resolução de imagem superior e contraste intrínseco dos tecidos moles. Rastreamento de células baseado em MRI já foi utilizada clinicamente para seguir as células dendríticas em pacientes com melanoma, 2. IRM clínica convencional é realizada sobre o núcleo 1 H, presentes na água celular em tecidos. Também é possível realizar a RM em outros núcleos activos, tais como 13 C, 19 F e 23 de Na. No entanto, apenas 19 F RM tem sido aplicado com sucesso no rastreamento de células in vivo, uma vez que oferece a mais alta sensibilidade após 1 H. A ausência de MRI-detectável endógena 19 M nos tecidos permite alta seletividade sinal para odetecção de agentes de contraste exógenos, 19 F e permite a quantificação da concentração de flúor directamente a partir dos dados de imagem. Para uma discussão detalhada em 19 de F MRI, consulte 3-5. Uma questão fundamental com 19 M MRI é a necessidade de desenvolver e otimizar os rótulos de células 19 f adequado, apesar de vários rótulos foram desenvolvidos, com uma tendência para os agentes multimodais 6. O protocolo aqui descrito é baseado em estudos realizados por nossos grupos de 7-9, incluindo os primeiros artigos que descreviam in vivo quantitativa 19 célula baseada em ressonância magnética F rastreamento 10,11. O procedimento geral de rastreamento de células utilizando 19F MRI está sumariado na Figura 1. Nós descrevemos um protocolo geral para a rotulagem e de imagem de células dendríticas (DCs), utilizando um agente de contraste perfluorocarbono custom-made 8. O protocolo de imagem é geralmente aplicável a diferentes tipos de células, as etiquetas e os modelos animais. Otipo de célula animal e modelo descrito aqui só deve ser tomada como um exemplo, e, portanto, nós não fornecemos detalhes sobre o isolamento de células e rotulagem, mas sim concentrar-se no protocolo de imagem. Modificações serão necessárias para cada rótulo, tipo de célula, o modelo animal, e configuração de imagem, e estes podem ser encontrados na literatura ou podem precisar de ser otimizada pelos pesquisadores. Algumas modificações comuns estão incluídas na discussão.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00131855</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr><tr><td>Oftosana </td><td>Produlab Pharma</td><td>2702</td><td>pomada para os olhos</td></tr><tr><td colspan="4">Nome do material </td></tr><tr><td>scanner de ressonância magnética</td><td>Espectrômetro Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 19 f mri para rastreamento celular

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI permite o acompanhamento quantitativo de células sem o uso de radiação ionizante. É uma técnica não-invasiva, que pode ser aplicado aos seres humanos. Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para marcação celular, imagem e processamento de imagem. A técnica é aplicável a vários tipos de células e modelos animais, embora aqui nos concentramos em um modelo típico do mouse para rastrear células do sistema imunológico murino. As questões mais importantes para a rotulagem de células são descritos, uma vez que estes são relevantes para todos os modelos. Do mesmo modo, os principais parâmetros de imagem são listados, embora os pormenores irão variar dependendo do sistema de ressonância magnética e a configuração do indivíduo. Finalmente, incluímos um protocolo de processamento de imagem para quantificação. Variações para esta e outras partes do protocolo, são avaliados na seção Discussão. Com base no procedimento detalhado descrito aqui, o usuário terá de adaptar o protocolo para cada tipo específico de célula, etiqueta de pilha, modelo animal, e configuração de imagem. Note-se que o protocolo também pode ser adaptado para uso humano, desde que sejam satisfeitas as restrições clínicos.

Aqui mostramos os resultados típicos para um protocolo que envolve a transferência de 19 células marcadas F-homing a um nodo de drenagem linfática. Figura 2 mostra um espectro de RMN de 19F de 10 6 células marcadas, utilizando uma referência de TFA. A estrutura de imagem foi realizada como descrito no protocolo (Figura 3). Para a imagem in vivo em, utilizou-se uma referência que consiste de um cilindro selado da mesma etiqueta utilizada para as ...

Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens e quantificar o número de células marcadas com 19 F in vivo usando 19 FMRI. Isso pode ser feito em um ambiente clínico ou pré-clínico. Isso é feito primeiro marcando as células com um agente 19 F adequado.Na maioria das vezes, isso é feito ex vivo. O segundo passo é quantificar o conteúdo de 19 F por célula, o que pode ser feito usando 19 F e MR com uma referência conhecida. Presume-se que o teor de 19 F por célula permaneça constante durante o experimento, caso contrário, devem ser calculados fatores de correção.Em seguida, o sujeito é fotografado in vivo usando um H e 19 FMRI para localizar as células marcadas transferidas. Uma referência conhecida e parâmetros de imagem apropriados são essenciais para a quantificação a partir dos dados da imagem. A etapa final é processar os dados da imagem para calcular o número de células.A histologia ex vivo ou outras técnicas podem ser usadas para corroborar os dados sempre que possível. Em última análise, 19 FMRI para rastreamento celular in vivo pode ser usado para estudar as células transferidas em termos de sua localização e números ao longo do período de tempo relevante, dadas certas suposições, conforme descrito no texto. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um HMRI usando rótulos de células superparamagnéticas, é que não há sinal de fundo confuso e que o número de células pode ser determinado diretamente a partir dos dados da imagem.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapêutica celular, como onde estão as células e quantas estão presentes em vários momentos. Para iniciar este protocolo, primeiro adicione um rótulo de 19 F às células dendríticas imaturas a uma concentração de quatro miligramas por 1 milhão de células em dois mililitros de meio. Em seguida, gire suavemente para misturar.Em seguida, incube as células dendríticas com o rótulo por três dias antes de amadurecer e colher. Em seguida, recolha as células e remova o excesso de etiqueta lavando pelo menos três vezes. Na contagem de PBS, as células resultantes ressuspendem em um pequeno volume de PBS para injeção ou testes adicionais.Observe que o protocolo descrito aqui é relevante para essas células dendríticas específicas e rótulo. Portanto, um protocolo para outro tipo de célula precisará ser encontrado na literatura ou otimizado pelo pesquisador. Coloque um número conhecido de células marcadas em um tubo de RMN.Em seguida, adicione 10 microlitros de 5% de tri Fluor ou ácido ácido, ou TFA. Se a frequência de ressonância do TFA for inadequada devido à sobreposição com o rótulo, use um composto solúvel alternativo. Coloque uma amostra em um espectrômetro de RMN e obtenha o espectro de flúor 19.Em seguida, calcule as áreas relativas sob os picos da referência e da amostra ou do pico principal da amostra e, em seguida, calcule o número médio de flúor por célula na amostra. Observe que todo esse processo deve ser repetido em média para atingir significância estatística. Isso também pode ser feito usando espectroscopia diretamente no scanner de ressonância magnética.Observe também que este procedimento revela apenas a carga média de flúor 19 para um grande número de células, não a variabilidade entre as células. A verificação da uniformidade da captação celular requer a presença de um componente fluorescente com o agente 19 F. Aqui, apenas o cenário três mostra a marcação homogênea das células, embora isso seja sempre assumido nos cálculos, isso pode ser verificado usando técnicas complementares, como microscopia configurada para imagens, colocando um camundongo totalmente anestesiado em um berço e imobilizando-o para evitar movimento durante a varredura.Além disso, conecte o controle de temperatura e respiração para monitoramento fisiológico durante a varredura. Se necessário, posicione uma referência externa ao lado do animal, tanto a referência quanto a região de interesse devem estar no centro da bobina. Comece a aquisição com uma ressonância magnética de prótons convencional como referência anatômica para a imagem 19 F.Em seguida, sintonize o sistema para a frequência de 19 F do marcador celular e realize uma varredura de 19 FMRI. Idealmente, a varredura de 19 FMRI terá o mesmo campo de visão e seleção de corte que uma ressonância magnética convencional, embora provavelmente com resolução mais baixa. Em seguida, determine o ganho de pulso de referência de 19 F usando a fórmula vista aqui e adquira um espectro de 19 FNMR para determinar a frequência de 19 F.Estimar o fator C dependente da bobina de radiofrequência numa experiência in vitro separada. O uso de uma bobina de radiofrequência com um perfil B um homogêneo, como uma bobina de superfície, pode dificultar a quantificação de dados de 19 F. Uma vez que o sinal depende não apenas da concentração de 19 F, mas também da distância da bobina.Portanto, adquira um mapa B um no canal H para corrigir retrospectivamente os dados 19 F. Isso requer que os perfis de uma bobina H e 19 F sejam idênticos, exceto pelo fator de proporcionalidade C, e que um sinal de fundo H suficiente seja fornecido em regiões de 19 F. Aqui vemos mapas de ângulo de inversão de tubos com TFA na água adquirida no canal H e 19 F. Para corrigir os dados de 19 F, primeiro adquira um mapa de ângulo de inversão de um H com o método de dois ângulos de inversão.Use uma varredura de eco gradiente com um TR muito longo sendo mais de três vezes para um HT, um com um ângulo de inversão estimado de pouco menos de 90 graus perto da bobina. Em seguida, adquira uma segunda varredura de eco gradiente com o dobro do ângulo de inversão da primeira varredura. Calcule o ângulo de inversão de um H alfa em vle X, Y, Z através do sinal e sens da primeira e segunda varreduras ECHO gradiente.O ângulo de inversão de 19 F será idêntico, exceto pelo fator um C devido ao perfil proporcional de B um, a atenuação da intensidade do sinal de 19 F de uma sequência de spin echo com excitação flip angle alfa refocando o ângulo de flip dois alfa durante a recepção do sinal é visto na tela aqui. A atenuação devido à excitação imperfeita é vista aqui. Em seguida, a atenuação geral pode ser calculada.Observe que ele é normalizado para um no caso de um ângulo de inversão de refocalização de excitação de 90 graus e 180 graus, as intensidades de sinal de imagem de 19 F corrigidas por B são calculadas por meio desta fórmula para criar imagens de sobreposição de um H e 19 F. Exporte os dados da imagem e abra os arquivos em um programa de processamento de imagem, como a imagem J, aplique os ajustes de imagem conforme necessário, certificando-se de manter os ajustes iguais para todas as imagens. Em seguida, renderize as imagens 19 F em cores falsas e, em seguida, sobreponha-as às imagens H correspondentes.Para localizar o sinal, selecione a imagem de magnitude 19 F com as células relevantes e a referência visível desenhe ROIs sobre as células relevantes, a referência e uma região fora do assunto para o valor de ruído conforme mostrado na amostra. Observe que aqui, a varredura anatômica H é mostrada para maior clareza. A proporcionalidade simples e o valor de 19 F por célula podem ser usados para estimar o número de células no ROI.Essas imagens são de resultados típicos de um protocolo envolvendo a transferência de células marcadas com 19 F para um linfonodo de drenagem. Aqui vemos um espectro de 19 FNMR de 1 milhão de células marcadas usando uma referência TFA, e aqui vemos uma imagem processada representativa para a imagem in vivo. Uma referência que consiste em um recipiente lacrado com o mesmo rótulo usado para as células foi colocada entre os pés do camundongo.Ao aplicar o protocolo descrito, calculamos um número de células de aproximadamente 1,2 milhão com base na imagem bruta de magnitude 19 F. A imagem 19 F é sobreposta em cores falsas sobre a escala de cinza, imagem anatômica de prótons. Ao configurar um novo experimento, é importante validar o flúor.Resultados de ressonância magnética com histologia, imagem óptica ou outros métodos. Por exemplo, é importante observar que a marcação de flúor pode permanecer no tecido quando as células morrem e levar a um sinal falso positivo.

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