In vivo ¹⁹ F MRI para Rastreamento celular

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens e quantificar o número de células marcadas com 19 F in vivo usando 19 FMRI. Isso pode ser feito em um ambiente clínico ou pré-clínico. Isso é feito primeiro marcando as células com um agente 19 F adequado.

Na maioria das vezes, isso é feito ex vivo. O segundo passo é quantificar o conteúdo de 19 F por célula, o que pode ser feito usando 19 F e MR com uma referência conhecida. Presume-se que o teor de 19 F por célula permaneça constante durante o experimento, caso contrário, devem ser calculados fatores de correção.

Em seguida, o sujeito é fotografado in vivo usando um H e 19 FMRI para localizar as células marcadas transferidas. Uma referência conhecida e parâmetros de imagem apropriados são essenciais para a quantificação a partir dos dados da imagem. A etapa final é processar os dados da imagem para calcular o número de células.

A histologia ex vivo ou outras técnicas podem ser usadas para corroborar os dados sempre que possível. Em última análise, 19 FMRI para rastreamento celular in vivo pode ser usado para estudar as células transferidas em termos de sua localização e números ao longo do período de tempo relevante, dadas certas suposições, conforme descrito no texto. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um HMRI usando rótulos de células superparamagnéticas, é que não há sinal de fundo confuso e que o número de células pode ser determinado diretamente a partir dos dados da imagem.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapêutica celular, como onde estão as células e quantas estão presentes em vários momentos. Para iniciar este protocolo, primeiro adicione um rótulo de 19 F às células dendríticas imaturas a uma concentração de quatro miligramas por 1 milhão de células em dois mililitros de meio. Em seguida, gire suavemente para misturar.

Em seguida, incube as células dendríticas com o rótulo por três dias antes de amadurecer e colher. Em seguida, recolha as células e remova o excesso de etiqueta lavando pelo menos três vezes. Na contagem de PBS, as células resultantes ressuspendem em um pequeno volume de PBS para injeção ou testes adicionais.

Observe que o protocolo descrito aqui é relevante para essas células dendríticas específicas e rótulo. Portanto, um protocolo para outro tipo de célula precisará ser encontrado na literatura ou otimizado pelo pesquisador. Coloque um número conhecido de células marcadas em um tubo de RMN.

Em seguida, adicione 10 microlitros de 5% de tri Fluor ou ácido ácido, ou TFA. Se a frequência de ressonância do TFA for inadequada devido à sobreposição com o rótulo, use um composto solúvel alternativo. Coloque uma amostra em um espectrômetro de RMN e obtenha o espectro de flúor 19.

Em seguida, calcule as áreas relativas sob os picos da referência e da amostra ou do pico principal da amostra e, em seguida, calcule o número médio de flúor por célula na amostra. Observe que todo esse processo deve ser repetido em média para atingir significância estatística. Isso também pode ser feito usando espectroscopia diretamente no scanner de ressonância magnética.

Observe também que este procedimento revela apenas a carga média de flúor 19 para um grande número de células, não a variabilidade entre as células. A verificação da uniformidade da captação celular requer a presença de um componente fluorescente com o agente 19 F. Aqui, apenas o cenário três mostra a marcação homogênea das células, embora isso seja sempre assumido nos cálculos, isso pode ser verificado usando técnicas complementares, como microscopia configurada para imagens, colocando um camundongo totalmente anestesiado em um berço e imobilizando-o para evitar movimento durante a varredura.

Além disso, conecte o controle de temperatura e respiração para monitoramento fisiológico durante a varredura. Se necessário, posicione uma referência externa ao lado do animal, tanto a referência quanto a região de interesse devem estar no centro da bobina. Comece a aquisição com uma ressonância magnética de prótons convencional como referência anatômica para a imagem 19 F.

Em seguida, sintonize o sistema para a frequência de 19 F do marcador celular e realize uma varredura de 19 FMRI. Idealmente, a varredura de 19 FMRI terá o mesmo campo de visão e seleção de corte que uma ressonância magnética convencional, embora provavelmente com resolução mais baixa. Em seguida, determine o ganho de pulso de referência de 19 F usando a fórmula vista aqui e adquira um espectro de 19 FNMR para determinar a frequência de 19 F.

Estimar o fator C dependente da bobina de radiofrequência numa experiência in vitro separada. O uso de uma bobina de radiofrequência com um perfil B um homogêneo, como uma bobina de superfície, pode dificultar a quantificação de dados de 19 F. Uma vez que o sinal depende não apenas da concentração de 19 F, mas também da distância da bobina.

Portanto, adquira um mapa B um no canal H para corrigir retrospectivamente os dados 19 F. Isso requer que os perfis de uma bobina H e 19 F sejam idênticos, exceto pelo fator de proporcionalidade C, e que um sinal de fundo H suficiente seja fornecido em regiões de 19 F. Aqui vemos mapas de ângulo de inversão de tubos com TFA na água adquirida no canal H e 19 F. Para corrigir os dados de 19 F, primeiro adquira um mapa de ângulo de inversão de um H com o método de dois ângulos de inversão.

Use uma varredura de eco gradiente com um TR muito longo sendo mais de três vezes para um HT, um com um ângulo de inversão estimado de pouco menos de 90 graus perto da bobina. Em seguida, adquira uma segunda varredura de eco gradiente com o dobro do ângulo de inversão da primeira varredura. Calcule o ângulo de inversão de um H alfa em vle X, Y, Z através do sinal e sens da primeira e segunda varreduras ECHO gradiente.

O ângulo de inversão de 19 F será idêntico, exceto pelo fator um C devido ao perfil proporcional de B um, a atenuação da intensidade do sinal de 19 F de uma sequência de spin echo com excitação flip angle alfa refocando o ângulo de flip dois alfa durante a recepção do sinal é visto na tela aqui. A atenuação devido à excitação imperfeita é vista aqui. Em seguida, a atenuação geral pode ser calculada.

Observe que ele é normalizado para um no caso de um ângulo de inversão de refocalização de excitação de 90 graus e 180 graus, as intensidades de sinal de imagem de 19 F corrigidas por B são calculadas por meio desta fórmula para criar imagens de sobreposição de um H e 19 F. Exporte os dados da imagem e abra os arquivos em um programa de processamento de imagem, como a imagem J, aplique os ajustes de imagem conforme necessário, certificando-se de manter os ajustes iguais para todas as imagens. Em seguida, renderize as imagens 19 F em cores falsas e, em seguida, sobreponha-as às imagens H correspondentes.

Para localizar o sinal, selecione a imagem de magnitude 19 F com as células relevantes e a referência visível desenhe ROIs sobre as células relevantes, a referência e uma região fora do assunto para o valor de ruído conforme mostrado na amostra. Observe que aqui, a varredura anatômica H é mostrada para maior clareza. A proporcionalidade simples e o valor de 19 F por célula podem ser usados para estimar o número de células no ROI.

Essas imagens são de resultados típicos de um protocolo envolvendo a transferência de células marcadas com 19 F para um linfonodo de drenagem. Aqui vemos um espectro de 19 FNMR de 1 milhão de células marcadas usando uma referência TFA, e aqui vemos uma imagem processada representativa para a imagem in vivo. Uma referência que consiste em um recipiente lacrado com o mesmo rótulo usado para as células foi colocada entre os pés do camundongo.

Ao aplicar o protocolo descrito, calculamos um número de células de aproximadamente 1,2 milhão com base na imagem bruta de magnitude 19 F. A imagem 19 F é sobreposta em cores falsas sobre a escala de cinza, imagem anatômica de prótons. Ao configurar um novo experimento, é importante validar o flúor.

Resultados de ressonância magnética com histologia, imagem óptica ou outros métodos. Por exemplo, é importante observar que a marcação de flúor pode permanecer no tecido quando as células morrem e levar a um sinal falso positivo.