Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar rapidamente a suscetibilidade das bactérias aos antibióticos de interesse. Isso é conseguido pela primeira imobilização de bactérias da fase logarítmica no fundo de um canal microfluídico. Na segunda etapa, o meio contendo o antibiótico e uma mancha fluorescente morta viva é então empurrado através do canal em uma alta taxa de fluxo, estressando as bactérias e ativando suas vias bioquímicas direcionadas ao antibiótico.

As imagens de contraste e fluorescência da próxima fase são coletadas automaticamente a cada dois minutos por uma hora para monitorar a viabilidade bacteriana, as porcentagens normalizadas de morte bacteriana são calculadas a partir das imagens adquiridas em cada ponto de tempo do experimento. Em última análise, o fenótipo de suscetibilidade a antibióticos da bactéria é determinado a partir de um aumento na porcentagem de morte celular normalizada ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos de teste de suscetibilidade fenotípica existentes, como caldo, diluição ou microcultura, é que nosso método não requer o monitoramento da divisão bacteriana.

Em vez disso, podemos acessar seu perfil de suscetibilidade diretamente da pequena população existente. As implicações desta técnica se estendem para o diagnóstico de infecções bacterianas resistentes, pois o método é rápido, pode ser facilmente multiplexado e automatizado Para criar a camada PDMS, comece desgaseificando uma mistura viscosa PDMS recém-preparada em uma câmara de vácuo à temperatura ambiente após uma hora, use uma escala para preencher o molde de alumínio com uma massa predefinida de mistura DGAs PDMS. Despeje o PDMS lentamente sobre o centro do molde, tomando cuidado para manter o molde nivelado e os pinos descobertos.

Cure o PDMS durante a noite em um forno a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, solte a placa superior do molde e remova cuidadosamente o PDMS curado do molde para montar a célula de fluxo. Primeiro, coloque a janela de vidro no bolso da célula de fluxo.

Em seguida, coloque uma lâmina de vidro revestida sobre a janela de vidro dentro do bolso da célula de fluxo com o lado ativo para cima. A camada PDMS recém-criada com os canais voltados para baixo em cima dela, de modo que as entradas do canal se alinhem com os orifícios passantes na placa de metal. Empurre suavemente o ar para fora entre as camadas e, em seguida, vire o conjunto deslizante de vidro PDMS para que o PDMS fique voltado para a janela de vidro.

Sobreponha as entradas do canal PDMS com os orifícios passantes na placa de metal e, em seguida, coloque a placa de pressão na parte superior e aperte os parafusos. Agora coloque a célula de fluxo montada sob o microscópio, defina a ampliação do microscópio para 60 x e pré-alinhe as posições do canal para preparar as bactérias da fase logarítmica para carregar na célula de fluxo misturada 50 microlitros da colônia bacteriana cultivada durante a noite de interesse em 50 mililitros de caldo MH dois fresco. Incubar por três horas agitando a 250 RPM e 37 graus Celsius após a subcultura, centrifugar 10 mililitros da cultura por dois minutos a 1.650 vezes G e temperatura ambiente.

Em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de MH dois meios frescos. Em seguida, conecte um pequeno pedaço de tubo a uma seringa de um mililitro e lave o tubo com um mililitro de meio, deixando uma pequena quantidade de meio no tubo para evitar bolhas de ar ao aspirar a suspensão bacteriana. Em seguida, carregue 0,7 mililitros da bactéria na seringa e preencha dois canais da célula de fluxo com a cultura de células bacterianas.

A transparência do canal muda à medida que é preenchido com as bactérias. Em seguida, incube a célula de fluxo por 45 minutos a 37 graus Celsius para permitir que as bactérias se fixem na superfície da lâmina. Preparar as soluções para o experimento.

Primeiro, encha duas seringas de 60 mililitros com solução de controle recém-preparada e duas seringas de 60 mililitros com solução antibiótica recém-preparada. Agite as seringas para remover quaisquer bolhas de ar e, em seguida, conecte o tubo de entrada empurrando as respectivas soluções pela extremidade do tubo. Mantenha as soluções envoltas em papel alumínio para evitar a degradação induzida pela luz dos reagentes.

Agora monte as seringas com solução experimental na bomba, uma de cada vez. Aperte seus êmbolos conforme necessário para encaixá-los na bomba. Trave as seringas no lugar com a seringa segurando a barra transversal.

Defina a velocidade da bomba para um mililitro por minuto e o volume da bomba para 60 mililitros e lave a bomba até que um fluxo constante de líquido seja visto em todas as seringas. Agora inicie o experimento removendo a célula de fluxo da incubadora e montando-a no estágio de microscópio pré-desalinhado. Em seguida, conecte um tubo de entrada proveniente de uma seringa e um tubo de saída que vai para um frasco de resíduos a cada um dos canais da célula de fluxo.

Neste ponto, o experimento está totalmente configurado e pronto para começar. Defina o tempo de aquisição do contraste de fase para 10 milissegundos e o tempo de aquisição de fluorescência para 1600 milissegundos e, em seguida, obtenha imagens de contraste de fase e fluorescência para cada posição antes de iniciar o fluxo. Observe que, antes do início da imagem de fluxo, o foco na parte inferior do canal pode ser inatingível devido à alta densidade de bactérias carregadas dentro do canal.

Agora inicie o fluxo de líquido. Verifique imediatamente se o microscópio está focado na parte inferior dos canais. Em seguida, tire imagens de contraste de fase e fluorescência das áreas-alvo no primeiro minuto de fluxo.

Adquira imagens a cada dois minutos após o primeiro conjunto de imagens até que 60 minutos de fluxo tenham ocorrido. Reorientando conforme necessário para garantir que o experimento esteja ocorrendo corretamente, pode-se examinar os dados de contraste de fase e fluorescência adquiridos. Nesta amostra de dados, uma cepa suscetível foi carregada nos canais um e dois, enquanto uma cepa de resistência estava nos canais três e quatro.

No final do experimento, execute um ciclo de limpeza com aplicação sequencial de água sanitária e água. Encha quatro seringas de 20 mililitros com 10 mililitros de uma solução de alvejante a 10% e quatro seringas de 60 mililitros com água. Depois de borbulhar, conecte as seringas cheias de alvejante à célula de fluxo e ajuste a velocidade da bomba para um mililitro por minuto e o volume da bomba para três mililitros.

Ligue a bomba por três minutos, monitore a limpeza do canal na tela. Após três minutos, substitua as seringas de alvejante por seringas de água e deixe funcionar por 30 minutos a um mililitro por minuto. Finalmente, conte o número de bactérias em cada imagem usando um software de processamento de imagem.

Calcule a porcentagem de morte celular bacteriana normalizada em função do tempo usando esta fórmula em que NF é igual ao número de bactérias mortas contadas na contagem de imagens de fluorescência. E NP é igual ao número total de bactérias, conforme determinado a partir da imagem de contraste de fase. As imagens mostradas aqui ilustram a resposta dependente do tempo de uma cepa suscetível de Staphylococcus aria à oxacilina dentro de uma célula de fluxo microfluídico.

Esses quadrantes mostram imagens de contraste de fase adquiridas um minuto após o início do experimento e em uma hora com as imagens de fluorescência correspondentes mostradas aqui. Um aumento significativo no número de bactérias fluorescentes é observado ao final do experimento, indicando morte celular dentro do canal e a suscetibilidade da cepa ao antibiótico devido à não uniformidade estocástica de lâminas individuais revestidas com epóxi. Pode haver perda de células bacterianas ao longo do experimento sob estresse absoluto sustentado para explicar essa variação, cada imagem de fluorescência de uma população de células mortas é normalizada com a imagem de contraste de fase coadquirida dando a população total de células dentro de um segundo do mesmo ponto de tempo.

Essas ampliações demonstram que o algoritmo de contagem é mais bem-sucedido na contagem precisa de bactérias individuais em imagens de fluorescência do que em imagens de contraste de fase densamente povoadas. A coloração de células mortas fornece um alto contraste de fluorescência para bactérias mortas individuais. Como o número de bactérias fluorescentes raramente ultrapassa 5% do número total, cada bactéria é muito brilhante em comparação com o fundo.

Portanto, as bactérias fluorescentes podem ser facilmente contadas com um alto grau de precisão. Por exemplo, neste experimento do total de 5.828 bactérias detectadas, destacadas em vermelho, 174 foram determinadas como mortas aqui. Os dados normalizados de MSSA e Mr.RSA para três experimentos diferentes são ilustrados como esperado para cepas resistentes, a morte celular normalizada é baixa em magnitude inferior a 0,5% e não muda ao longo do experimento.

As cepas suscetíveis, no entanto, mostram um aumento constante na morte celular e um valor maior que 1% ao final do experimento. O início da morte celular para cepas suscetíveis varia ligeiramente entre os experimentos, mas geralmente ocorre entre 10 e 30 minutos. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos resistentes a antibióticos pode ser extremamente perigoso, e precauções como uma técnica séptica devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

Essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores explorarem como as bactérias respondem ao estresse e afetará o desenvolvimento de novos diagnósticos rápidos e a descoberta de novos medicamentos.