Transformação e Clonagem de Leveduras

Levedura ou Saccharomyces cerevisiae, é um organismo modelo eucariótico simples generalizado usado no estudo da genética e biologia celular que pode dar insights sobre os processos celulares humanos. Este vídeo discute a transformação - a absorção de DNA estranho pela célula de levedura. Ele introduzirá plasmídeos de levedura, como preparar células de levedura para transformação, um procedimento de transformação passo a passo, e fornecerá algumas aplicações dessa técnica fundamental.

Antes de falarmos sobre a transformação da levedura, vamos primeiro discutir um tipo de DNA usado na transformação: o plasmídeo. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de dois fios que pode superar para que possa facilmente passar por poros em uma membrana celular.

Plasmids contêm um local de clonagem múltipla ou MCS onde endonucleases de restrição, também conhecidos como "enzimas de restrição", podem cortar DNA. Fragmentos de DNA de corte de juros com as mesmas enzimas podem então ser ligados ao MCS. Plasmids também contêm uma origem de replicação ou ORI que sinaliza para a célula onde a replicação deve começar. Além disso, os plasmídeos possuem um marcador selecionável, que permite que as células de levedura que contêm o plasmídeo cresçam em condições ambientais específicas. Leveduras que não incorporarem com sucesso o plasmídeo não sobreviverão em mídia contendo o marcador selecionável. Os marcadores selecionáveis podem codificar genes que permitem resistência a drogas ou genes que codificam enzimas que permitem que uma cepa de levedura sintetize aminoácidos que de outra forma não podem produzir.

Vetores de transporte são plasmídeos que podem se replicar em mais de uma espécie hospedeira. Por exemplo, um plasmídeo de E. Coli pode crescer em levedura. Os plasmídeos de levedura podem ser não-integradores ou integradores, significa que o plasmídeo se combina com o DNA genômico ou permanece independente.

Existem cinco tipos gerais diferentes de plasmídeos ou vetores que são usados em leveduras. Os dois que são usados mais frequentemente na transformação da levedura são o plasmídeo epismídeo de levedura ou YEp e o plasmídeo centromético de levedura ou YCp. Ambos os tipos de vetores contêm uma sequência de replicação autônoma ou ARS. O ARS contém a origem da replicação e permite a replicação extracromossômica na levedura.

Existem vários procedimentos diferentes que podem ser usados para transformar leveduras que incluem o método de esferoplasto, eletroporação e transformação mediada por acetato de lítio. Para este vídeo vamos focar no procedimento de acetato de lítio.

Neste método de transformação, as cáções de lítio carregadas positivamente neutralizam as cargas na membrana celular e no DNA plasmídeo Um único dna - adicionado à mistura de transformação - se liga à parede celular da levedura e deixa o DNA plasmídeo disponível para absorção pelas células de levedura . A exposição a um aumento repentino na temperatura, ou choque térmico cria uma diferença de pressão entre o interior e o exterior da célula criando poros que o DNA plasmídeo pode passar. Quando a temperatura é reduzida, a parede celular da levedura se reformará e a transformação estará completa.

Vamos começar com um procedimento passo a passo de como preparar leveduras para a transformação. As células de levedura devem ser preparadas primeiro escolhendo uma colônia de uma placa de ágar e amplificando a colônia em fermento extrato peptone dextrose médio, abreviado YPD - um meio completo para o crescimento da levedura.

Depois que a colônia é colhida a partir de um prato e colocada em meio YPD, a cultura é incubada durante a noite a 30 °C com agitação em um agitador ou aparelho de rolo, como você vê aqui. As células de levedura são pelotas por centrifugação e o supernante é removido. As células pelleted são resuspend com o tampão desejado ou água estéril. Essas células de levedura preparadas competentes serão utilizadas no procedimento de transformação.

Uma vez preparadas as células de levedura, a transformação pode ser realizada primeiro preparando a mistura de transformação.

Esta mistura de reagente deve incluir: água destilada estéril; uma solução de 50% de polietileno glicol ou PEG, acetato de lítio 1M, solução de 10 mg/ml de DNA mono stranded, DNA plasmídeo e células competentes de levedura. As proporções exatas de cada solução devem ser calculadas antes de iniciar o experimento consultando o protocolo padrão do seu laboratório para a transformação da levedura.

A mistura é então incubada a 30 °C por 30 minutos com agitação. A solução deve ser misturada, não vórtice, para garantir que as células de levedura não se separem.

As células ficam chocadas com o calor em um banho de água de 42 °C por 15 minutos seguido de resfriamento no gelo por 2 minutos. As células são então colhidas por centrifugação.

As células são resuspended em água duplamente destilada e são banhadas em placas de ágar que selecionarão para os transformadores desejados. As placas de transformação são então incubadas a 30 °C por dois a quatro dias até que as colônias se formem.

Os procedimentos de transformação devem sempre incluir placas de controle positivas e negativas até que sejam otimizadas. O controle positivo deve ser uma suspensão celular de levedura com DNA plasmídeo em uma placa YPD que não contenha nenhum marcador selecionável. Isso mostra que as células são saudáveis após o procedimento de transformação. A placa de controle negativa deve ser uma suspensão de célula de levedura em uma placa de seleção apropriada, como uma que contenha antibióticos. A placa não deve ter colônias e mostra que não há contaminação.

Há uma miríade de diferentes aplicações para a transformação da levedura. Uma aplicação de levedura transformada é usar um sistema híbrido de levedura dois para identificar proteínas que interagem com sua proteína de interesse, ou a proteína da isca. Quando um plasmídeo de uma biblioteca de parceiros de vinculação de candidatos, ou proteínas de presas, são transformados e há uma interação, um fator de transcrição é liberado que ativará um gene repórter, como Beta-galactosidase. O gene repórter transformará colônias que têm uma interação azul quando em placas que contêm X-gal - um substrato para beta-galadosidase.

Múltiplas exclusões podem ser projetadas em levedura através de uma técnica usando ciclismo sexual. Células haploides que contêm um repórter e locus excluídos são combinadas em uma célula através de variedade aleatória ou recombinação meiotic. Os marcadores selecionáveis são usados para selecionar para leveduras que incorporaram com sucesso as exclusões. Neste caso, a citometria de fluxo é usada para selecionar células que expressam GFP.

A levedura pode ser transformada com proteínas que são rotuladas fluorescentemente para ver o efeito de mutações nas interações proteína-proteína. Este artigo em vídeo utilizou microscopia fluorescente para estudar os efeitos de diferentes mutações nas interações proteína-proteína essenciais para a endocitose.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVEs sobre a transformação da levedura. Agora você deve entender os aspectos básicos de um plasmídeo, como preparar células de levedura para a transformação e como realizar o procedimento de transformação. Como sempre, obrigado por assistir!