Name: In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda a reprogramação in vivo de hepatócitos adultos para pluripotência usando injeção hidrodinâmica de plasmídeos com Fatores de Yamanaka. Este método validado oferece eficiência e segurança para pesquisa em medicina regenerativa.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC, Swindon, Reino Unido) e pela Comissão Europeia Programas FP-7 NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) e ANTICARB (HEALTH-2008-20157). A AY foi apoiada por uma bolsa de doutorado em tempo integral do Ministério da Educação (Turquia) e a IL reconhece o apoio parcial do British Council e da Fundação CAIXA (Espanha). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

1. Reprogramação in vivo do tecido hepático pela administração de pDNA pelo HTV
<ol>
	<li>Permita que camundongos Balb/C fêmeas, com 6 semanas de idade, se aclimatem ao biotério por uma semana antes de qualquer procedimento ser realizado.</li>
	<li>Prepare solução salina a 0,9% em água destilada e filtre através de microfiltro de 0,22 μm.</li>
	<li>Preparar uma solução com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de ADN plasmidial pCX-cMyc em 1,5 ml de solução salina a 0,9% por ratinho. nota: O volume total da injeção deve estar entre 8-10% do peso corporal total. 
	Nota: antes da injeção, mantenha os ratinhos numa câmara de aquecimento a 37 °C até que as veias da cauda possam ser facilmente visualizadas e apareçam dilatadas.</li>
	<li>Induza a anestesia com isoflurano antes (na câmara de aquecimento) e durante a injeção (com máscara anestésica).</li>
	<li>Administre a solução de pDNA ou controle salino com uma seringa de 27 G por injeção de HTV. Nota: para que a transfecção seja bem-sucedida, o volume total deve ser injetado em não mais do que 5-7 segundos.</li>
	<li>Monitore se os animais se recuperam adequadamente da injeção.</li>
</ol>
2. Perfusão hepática e isolamento de hepactócitos primários para estudos de qRT-PCR
<ol>
	<li>Em diferentes momentos, incluindo 2, 4, 8, 12 e 24 dias após a injeção de HTV, induza anestesia profunda com isoflurano.</li>
	<li>Pulverize etanol 70% no abdômen do animal, faça uma incisão através da pele na linha média ventral com tesoura cirúrgica e disseque a camada muscular abdominal para expor as vísceras.</li>
	<li>Corte o diafragma para expor a cavidade torácica com uma tesoura e prenda a veia cava com uma pinça de travamento.</li>
	<li>Desloque as vísceras para a direita e os lobos do fígado para que tanto a cava inferior quanto a veia porta sejam facilmente acessíveis.</li>
	<li>Canule a veia cava inferior com um cateter 22 G e corte a veia porta para evitar excesso de pressão.</li>
	<li>Iniciar a perfusão com 10 ml de tampão HBSS (livre de Ca2+ e Mg2+, com bicarbonato), pré-aquecido a 37 °C. Perfundir o tampão lentamente com uma seringa de 10 ml, até o fígado embranquecer (3 min).</li>
	<li>Continue a perfusão com Liver Digest Medium, pré-aquecido a 37 ° C, a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min (por 15 min) até que o fígado fique inchado e solto. nota: A digestão e a perfusão excessivas podem danificar os hepatócitos ou células reprogramadas.</li>
	<li>Continuar a experiência a 4 °C.</li>
	<li>Remova o fígado com uma pinça após cortar os ligamentos falciforme e coronário e lave-o com Hepatocyte Wash Medium, enquanto o passa por um filtro de células de 100 μm para obter uma suspensão celular.</li>
	<li>Recolha a suspensão celular em tubos de 50 ml e ajuste o volume para 15 ml com Hepatocyte Wash Medium.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão celular a 50 g durante 4 min. Mantenha a temperatura a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante (que contém células de Kupffer e epiteliais) e ressuspender o sedimento celular (contendo os hepatócitos) em 10 ml de Hepatoil Wash. nota: O pellet celular deve ser ressuspenso com muito cuidado, os hepatócitos são células muito frágeis.</li>
	<li>Repita o procedimento de centrifugação por um total de três vezes e ressuspenda o pellet final em 10 ml de Hepatocyte Wash Medium.</li>
	<li>Estime o número de células usando um microscópio óptico e um hemocitômetro.</li>
	<li>Preparar alíquotas de 2 x 106 células, centrifugar a 300 x g para recuperar todas as células e rejeitar o sobrenadante.</li>
	<li>Neste ponto, o pellet celular pode ser congelado e mantido a -20 °C até processamento adicional ou usado imediatamente para a extração de RNA.</li>
</ol>
3. Estudo da Expressão Gênica de Hepatócitos Isolados para Regulação Positiva de Genes Pluripotentes
<ol>
	<li>Extraia RNA de 2 x 106 células com um kit de coluna giratória seguindo as instruções do fornecedor.</li>
	<li>Use 1 μg do RNA extraído para realizar qRT-PCR em duas etapas seguindo as instruções do fornecedor.</li>
	<li>Use os hepatócitos dos animais injetados com solução salina como controle para corrigir a expressão gênica relativa de reprogramação, pluripotência e marcadores de hepatócitos.</li>
</ol>
4. Análise de citometria de fluxo de pluripotência aprimorada no nível da proteína
<ol>
	<li>Nos dias 1 e 4 após a injeção, realize a perfusão hepática e isole os hepatócitos primários conforme indicado acima.</li>
	<li>Ajustar a densidade celular para 1 x 107 células/ml e preparar alíquotas de 100 μl.</li>
	<li>Fixe as células com tampão de fixação BD Cytofix e permeabilize com 1x tampão BD Perm/Wash.</li>
	<li>Incube as células com anti-mouse OCT4-PerCP-Cy5.5 ou anti-mouse Nanog-PE por 30 min.</li>
	<li>Inclua controles negativos e isotipos.</li>
	<li>Analise as células coradas pelo citômetro de fluxo de pesquisa de alto desempenho CyAn ADP.</li>
</ol>
5. Imunocoloração de Cortes Hepáticos para Marcadores de Pluripotência
<ol>
	<li>Quatro dias após a injeção, perfundir o fígado conforme indicado acima, mas apenas com tampão HBSS para remover o sangue do tecido hepático.</li>
	<li>Corte um pedaço de tecido hepático e mergulhe-o em 2-metilbutano (pré-resfriado em nitrogênio líquido) para continuar com a criossecção.</li>
	<li>Os tecidos congelados podem ser mantidos a -80 °C ou cortados diretamente em seções de 14 μm de espessura usando um criostato.</li>
	<li>Seque ao ar as seções de tecido por 1 hora em temperatura ambiente e pós-correção com metanol, pré-resfriado a -20 ° C por 10 min. Seque ao ar por 15 min e depois lave as seções duas vezes com PBS (5 min cada).</li>
	<li>Incube as seções em tampão de bloqueio (5% de soro de cabra-0,1% Triton em PBS pH 7,3) em temperatura ambiente por 1 hora, seguido de duas etapas de lavagem com tampão de lavagem (1% BSA-0,1% Triton em PBS, pH 7,3).</li>
	<li>Incube as seções de tecido durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog.</li>
	<li>No dia seguinte, lave as seções 3x (5 min cada) com tampão de lavagem e incube-as por 1,5 hora em temperatura ambiente com o anticorpo secundário.</li>
	<li>Lave as seções de fígado com PBS (3x, 5 min cada) e monte-as em meio contendo DAPI e antifade.</li>
	<li>Visualize as lâminas sob um microscópio de epifluorescência.</li>
</ol>
6. Coloração de fosfatase alcalina (ALP) de seções de tecido hepático
<ol>
	<li>Obtenha seções de tecido hepático conforme descrito anteriormente.</li>
	<li>Aqueça as seções de tecido em temperatura ambiente por 15 min antes de realizar a coloração.</li>
	<li>Fixe com paraformaldeído a 4% por 2 min. Nota: o tempo de fixação excessivo pode diminuir a atividade da ALP.</li>
	<li>Seque as seções ao ar por 30 min e, em seguida, incube com substrato líquido BCIP/NBT a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Lave as lâminas com água destilada e monte com meios de montagem aquosos.</li>
	<li>Capture imagens aleatórias por microscopia de luz.</li>
</ol>
7. Quantificação dos níveis de albumina e enzimas hepáticas no soro para avaliar a toxicidade hepática
<ol>
	<li>Nos dias 4, 8, 12 e 120 após a transfecção, colete 300 μl de sangue diretamente do ventrículo cardíaco.</li>
	<li>Mantenha o sangue no gelo enquanto as diferentes amostras são coletadas para evitar a coagulação.</li>
	<li>Quando todas as amostras estiverem prontas, incubar durante 30 min a 37 °C até coagular o sangue.</li>
	<li>Centrifugue as amostras a 2.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Pipetar cuidadosamente o soro (no sobrenadante) para um novo tubo Eppendorf e congelar a -80 °C até ao processamento das amostras.</li>
	<li>Analise os níveis séricos de albumina, ALT, AST, ALP e GLDH.</li>
</ol>
8. Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS) de seções hepáticas para avaliar a toxicidade hepática
<ol>
	<li>Em diferentes momentos, incluindo 2, 4, 8, 12, 24, 50 e 120 dias após a injeção de HTV; realize a perfusão hepática com tampão HBSS apenas conforme descrito anteriormente.</li>
	<li>Corte um pedaço de tecido hepático e fixe em paraformaldeído a 4%.</li>
	<li>Incorpore o tecido hepático em blocos de parafina, corte e core com coloração H & E ou PAS.</li>
	<li>Capture imagens aleatórias por microscopia de luz.</li>
</ol>

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
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<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este estudo fornece evidências de prova de princípio da reprogramação celular in vivo em direção à pluripotência após a transferência eficiente e superexpressão dos fatores OKSM para o fígado de camundongo adulto. Com o auxílio de diferentes técnicas, como qRT-PCR, citometria de fluxo, IHQ ou análise sérica, o tecido alvo foi investigado para observar a reprogramação celular in vivo . Muito rapidamente a partir da indução da superexpressão do fator OKSM no tecido, os marcadores de pluripotência foram regulados positivamente nos níveis de mRNA e proteína (dentro de 48 horas). Ao longo desses experimentos, entre 5-15% das células extraídas do tecido mostraram-se Nanog e Oct3/4 positivas. Além disso, não foram observadas anormalidades estruturais ou funcionais no fígado ao longo de 120 dias. A expressão de transgenes por injeção de DNA plasmidial por HTV em outros tecidos além do fígado (pulmão, baço, rim e coração) foi relatada anteriormente, porém os níveis de expressão gênica foram pelo menos 3 ordens de magnitude menores do que os dos hepatócitos30. Os dados deste estudo indicam que a reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente in vivo é segura, rápida e eficiente. Tendo em vista a maioria das metodologias de reprogramação celular in vitro existentes que geralmente atingem a geração de células pluripotentes (iPS) em 3 semanas com menos de 1% de eficiência32, a reprogramação in vivo para pluripotência pode oferecer alternativas muito interessantes. Nossa hipótese é que o conceito de reprogramação in vivo para pluripotência poderia ser aplicado a vários tipos de células somáticas com alta eficiência (dependendo do vetor utilizado), no entanto, o nível de pluripotência funcional alcançado nas células reprogramadas in vivo precisará ser determinado. Além disso, com o desenvolvimento de protocolos e tecnologias aprimorados, células reprogramadas in vivo podem ser extraídas e utilizadas para fins de medicina regenerativa.
Existem alguns passos críticos a serem seguidos para reprogramar células somáticas adultas in vivo com alta eficiência. Atingir altos níveis de expressão gênica no tecido-alvo é um pré-requisito. Neste estudo, isso foi ilustrado pela utilização da transferência eficiente e expressão de DNA plasmidial para hepatócitos usando injeção de HTV. Os fatores mais importantes para a injeção de HTV são o volume, que deve estar entre 8-10% do peso corporal total do animal, e a velocidade da injeção, que deve ser realizada dentro de 5-7 segundos. Camundongos com menos de 6 semanas de idade não devem ser usados, pois a injeção de HTV pode causar mais danos aos tecidos do fígado, o que pode afetar a eficiência da reprogramação celular. O background genético dos animais não teve impacto na determinação da eficiência da reprogramação in vivo , pois relatamos anteriormente níveis semelhantes de reprogramação em camundongos Balb/C e TNG-A, sendo este último uma cepa transgênica que carrega o repórter eGFP inserido no locus Nanog e é reproduzida no fundo Sv12929.
Especulamos que a reprogramação celular in vivo para um estado pluripotente (que precisará ser determinado) pode ser aplicada a outros tipos de tecido, desde que os fatores OKSM sejam entregues de forma eficiente às células-alvo, permitindo altos níveis de expressão gênica. Uma variedade de vetores de entrega de genes não virais e virais foi estudada em ensaios pré-clínicos e clínicos para atingir diferentes tipos de células e tecidos33. Por exemplo, para tecidos neurais ou oculares, os vírus adeno-associados têm sido a escolha preferida do vetor para transferência eficiente de genes in vivo 34-37, enquanto no tecido muscular as injeções de DNA de plasmídeo nu demonstraram resultar em níveis relativamente altos de expressão gênica38,39. Portanto, o método de vetor de transferência de genes deve ser cuidadosamente selecionado, dependendo do tipo de tecido, a fim de obter uma reprogramação celular in vivo eficiente e rápida em direção a um estado pluripotente.

As preocupações éticas sobre o uso de células-tronco embrionárias têm sido uma das limitações no desenvolvimento da pesquisa com células-tronco. No entanto, a descoberta de Yamanaka e colegas de que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição (a saber: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) poderia levar à reprogramação in vitro de células somáticas em células pluripotentes, denominadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), abriu novas oportunidades. A transferência de genes virais1-5 e não virais6-10, a translocação citoplasmática de proteínas11,12 e a transfecção de miRNA13-16 estão entre os vários métodos usados hoje para gerar células iPS. No entanto, tais metodologias de reprogramação sofrem de vários problemas que estão restringindo sua tradução para a clínica, tais como: a) severas limitações na eficiência da reprogramação celular; b) o uso predominante de vetores virais; c) protocolos de condições de cultivo de longa duração e várias etapas; e d) o risco de tumorigenicidade pela implantação das células iPS geradas in vitro 17-20.
A transferência de genes de fatores de transcrição definidos3-5 por retrovírus é o método mais comumente usado para reprogramar células somáticas. No entanto, contém os riscos da possibilidade de mutagênese insercional, transdução estável e expressão proto-oncogênica de longo prazo21,22. Vetores de transferência de genes não virais, como DNA de plasmídeo6,7,23 ou entrega de RNA10 usando lipossomas ou eletroporação, também foram explorados. Embora mais seguros em comparação com os vírus, esses vetores oferecem eficiência de transdução e reprogramação significativamente limitada24,25.
Um dos dogmas centrais desse campo emergente é que a implantação in vivo de células iPS levará à sua diferenciação descontrolada e à formação de uma massa tumoral (teratoma), composta por vários tecidos das três diferentes camadas germinativas. Portanto, o conceito de reprogramação para pluripotência tem se concentrado principalmente em manipulações in vitro de células somáticas extraídas primárias (mais comumente fibroblastos). No entanto, como descrito acima, esse princípio sofre de protocolos de cultura celular longos e complexos, incluindo várias rodadas de tratamento (transferência de genes, fatores de crescimento, antibióticos, antioxidantes) que podem aumentar os riscos de formação de teratoma ou outras formas de tumorigênese após a implantação das células24-28.
Propomos que a reprogramação de células somáticas adultas in vivo pela superexpressão transitória dos fatores de transcrição OKSM não leva à formação subsequente de teratomas29. O método para conseguir isso dependerá da obtenção de altos níveis de expressão do fator de transcrição dentro do tecido-alvo da maneira mais segura possível. Neste estudo, selecionamos uma tecnologia estabelecida de transferência de genes livres de vírus que demonstrou atingir eficientemente o fígado, a fim de reprogramar as células para a pluripotência in vivo. Essa tecnologia envolve injeção rápida e hidrodinâmica de DNA de plasmídeo DNA 30,31 em grande volume e hidrodinâmica da veia da cauda30,31. Altos níveis de expressão de genes transfectados podem ser alcançados em hepatócitos adultos seguindo este método de transferência de genes não virais. Além disso, essa tecnologia minimiza os riscos potenciais do uso de vetores virais (por exemplo, inserção genômica permanente, mutagênese insercional).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Obtido de Addgene como facada bacteriana, produção de plasmídeo realizada na Fábrica de Plasmídeos (Alemanha)</td></tr> <tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Obtido de Addgene como facada bacteriana, produção de plasmídeo realizada na Fábrica de Plasmídeos (Alemanha)</td></tr> <tr><td>0,22 &mu; m filtro</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ e Mg2+ livre, com bicarbonato</td></tr><tr><td>Fígado Digestão Média</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Hepatócito Lavagem Média</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 & Mu; filtro de células m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleospin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit para isolamento de RNA de células e tecidos</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 primer direto</td><td>Sequência Sigma</td><td>dada nos comentários</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 primer reverso</td><td>Sequência Sigma</td><td>dada nos comentários</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2 forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence dada nos comentários</td><td>GGTTACCTCTTCCTCCCCTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence dada nos comentários</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence dado nos comentários</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence dado nos comentários</td><td>TGTGGCCCTGAAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb forward primer</td><td>Sigma</td><td>seqüência dada nos comentários</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb reverse primer</td><td>Sigma</td><td>seqüência dada nos comentários</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat forward primer</td><td>Seqüência Sigma dada nos comentários</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>Aat reverse primer</td><td>Sigma</td><td>seqüência dada nos comentários</td><td>ATGGACAGTCTGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequência fornecida nos comentários</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B Actin forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B actin reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix fixation buffer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x BD Perm/Wash buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td><td>de cabra Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>pAb de coelho anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Use a uma concentração de 3 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de pAb de coelho anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Use na concentração de 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de pAb de coelho anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Use na concentração de 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de camundongo mAb anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Use na concentração de 20 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de pAb de cabra anti-coelho IgG marcado com Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>Use a uma concentração de 1/250</td></tr><tr><td>de IgG anti-camundongo pAb de cabra marcado com Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Use a uma concentração de 1/250</td></tr><tr><td>VECTASHIELD meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT sistema de substrato líquido</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>A solução de estoque é de 16%, use-a a 4%</td></tr> <tr><td>de hematoxilina e eosina</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>coloração PAS</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de fatores de yamanaka

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) que resultam da reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente por expressão forçada de fatores definidos estão oferecendo novas oportunidades para a medicina regenerativa. Tais aplicações clínicas de células iPS têm sido limitadas até o momento, principalmente devido à baixa eficiência das metodologias de reprogramação existentes e ao risco das células iPS geradas formarem tumores após a implantação.
Nossa hipótese é que a reprogramação de células somáticas em direção à pluripotência poderia ser alcançada in vivo pela transferência de genes de fatores de reprogramação. Para reprogramar eficientemente as células in vivo, altos níveis dos fatores de transcrição Yamanaka (OKSM) precisam ser expressos no tecido-alvo. Isso pode ser alcançado usando diferentes vetores genéticos virais ou não virais, dependendo do tecido-alvo. Neste estudo em particular, a injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda (HTV) foi usada para entregar os fatores OKSM aos hepatócitos de camundongos. Isso forneceu prova de evidência de reprogramação in vivo de células somáticas adultas em direção a um estado pluripotente com alta eficiência e cinética rápida. Além disso, não foi observada formação de tumor ou teratoma in situ.
Pode-se concluir que a reprogramação de células somáticas in vivo pode oferecer uma abordagem potencial para induzir pluripotência aprimorada de forma rápida, eficiente e segura em comparação com protocolos realizados in vitro e pode ser aplicada a diferentes tipos de tecidos no futuro.

Figura 1 mostra a visão geral do procedimento que envolve a transferência gênica de plasmídeos que codificam OKSM para o fígado de camundongos e as diferentes técnicas realizadas para observar a reprogramação celular in vivo. Após a injeção por HTV dos plasmídeos, observou-se um aumento significativo na expressão gênica dos fatores de reprogramação transfectados (Oct3/4, Sox2, Klf4 e cMyc) ao nível de mRNA no dia 2 após a injeção. A expressão desses fatores diminui ao longo do tempo após a injeção, conforme mostrado na Figura 2a. Em relação à expressão de marcadores endógenos de pluripotência (Nanog, Ecat1 e Rex1), seus níveis foram significativamente aumentados em comparação com os de hepatócitos de animais injetados com solução salina nos dias 2 e 4 após a injeção, e retornaram aos níveis basais a partir do dia 8 (Figura 2b). Ao mesmo tempo, a desdiferenciação da população de hepatócitos foi confirmada pela redução na expressão de genes específicos de hepatócitos (Alb, Aat e Trf), que foi estatisticamente significativa no dia 4 e atingiu os níveis basais a partir do dia 8 (Figura 2d).
A expressão de Oct3/4 e Nanog ao nível proteico foi investigada por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 2c, apenas Oct3/4 é expresso no dia 1 após a injeção de HTV, enquanto para a expressão do marcador endógeno de pluripotência Nanog foi necessário aguardar até o dia 4.
A ocorrência de reprogramação celular in vivo foi ainda confirmada por meio de análise imunohistoquímica de tecidos hepáticos com anticorpos anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog e por coloração específica para atividade de FAL. Células positivas para todos os marcadores e para atividade enzimática são encontradas de forma reprodutível nos tecidos hepáticos de animais injetados com OKSM, mas não nos controles injetados com solução salina (Figura 3).
Os possíveis efeitos colaterais tóxicos e a formação de teratomas decorrentes da reprogramação celular in vivo por injeção de pDNA via HTV foram investigados mediante quantificação dos níveis de enzimas hepáticas no soro, bem como coloração com H&amp;E e PAS de cortes de tecido hepático ao longo de um período de 120 dias. Foram observados sinais transitórios e não graves de dano tecidual até o dia 2, mas não além disso. Nenhuma formação de teratomas ou qualquer sinal de displasia ou alterações morfológicas foi observado durante o período do estudo (Figura 4). Não houve anormalidades estruturais ou funcionais hepáticas ao longo do estudo em nenhum dos animais, conforme confirmado pelos níveis de albumina e enzimas hepáticas e pela coloração de glicogênio em cortes de tecido (Figuras 4b e c).
<img alt="Injeção de fatores de reprogramação in vivo, diagrama de camundongo, plasmídeo, análise de tecido, PCR, citometria." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Visão esquemática do procedimento de reprogramação in vivo e sua análise. O protocolo envolve duas etapas principais: (i) administração de fatores de reprogramação in vivo e (ii) extração do tecido e análise das amostras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Análise de expressão gênica; gráficos de barras com dados de expressão relativa ao longo dos dias; figuras a-d; resultados científicos." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Superexpressão in vivo dos fatores de transcrição Yamanaka no fígado de camundongos adultos. Camundongos Balb/C foram injetados por HTV com apenas 0,9% de solução salina, ou com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em 0,9% de solução salina, e em dias 2, 4, 8, 12, 24, foi realizada análise por RT-qPCR de hepatócitos para determinar a expressão gênica relativa de: (a) fatores de transcrição transfectados (OKSM) e (b) marcadores endógenos de pluripotência; (c) análise por citometria de fluxo de células positivas para OCT3/4 e positivas para Nanog; (d) expressão gênica relativa de marcadores de hepatócitos determinada por RT-qPCR. Todos os níveis de expressão gênica foram normalizados ao grupo injetado com solução salina por HTV. (* p&lt;0,05 indica diferença estatisticamente significativa em comparação com os grupos injetados com solução salina por HTV, obtida pela análise de variância e comparação pareada de Tukey). Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Comparação por microscopia de imunofluorescência de OCT4, SOX2, NANOG em células tratadas com salina versus OKSM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Reprogramação celular in vivo em tecido hepático de camundongo adulto por imunohistoquímica. Camundongos Balb/C injetados por HTV apenas com salina a 0,9% ou com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em salina a 0,9%. No dia 4, os fígados foram coletados e cortes congelados do tecido foram corados com anticorpos anti-OCT4, anti-SOX2 ou anti-Nanog para avaliar a imunorreatividade, ou com BCIP/NBT para determinar a atividade de fosfatase alcalina no tecido (40X). As barras de escala representam 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Histologia hepática, níveis de enzimas e albumina no tratamento com salina versus OKSM, resultados do experimento." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. O efeito da reprogramação celular in vivo sobre a funcionalidade hepática e a histopatologia. Camundongos Balb/C foram injetados por HTV com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em salina 0,9% ou apenas salina 0,9%. Nos dias 2, 4, 8, 12, 50 e 120, tecidos hepáticos e soros foram isolados e processados para: (a) coloração com H&amp;E; (b) níveis de enzimas hepáticas; (c) níveis de albumina; (d) coloração com PAS. Imagens representativas foram obtidas por microscopia óptica (10X). As barras de escala representam 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.

Este estudo demonstra a reprogramação de células somáticas para pluripotência in vivo sem a geração de teratomas. Usamos injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda que codifica os fatores de Yamanka para induzir a reprogramação in vivo de hepatócitos adultos em células de pluripotência aumentada.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

O objetivo geral do experimento a seguir é induzir e avaliar a reprogramação de células somáticas em direção à pluripotência em seu microambiente in vivo. Isso é conseguido carregando uma seringa com DNAs de plasmídeo que codificam os fatores Yamanaka e injetando-os hidrodinamicamente na veia da cauda de um camundongo BC como um segundo passo. Os hepatócitos primários são isolados dos tecidos hepáticos e os níveis relevantes de expressão gênica e proteica são estudados por Q-R-T-P-C-R em tempo real e citometria de fluxo.Em seguida, os tecidos hepáticos inteiros são seccionados e corados por diferentes técnicas, a fim de confirmar a reprogramação do tecido e avaliar a toxicidade do procedimento. São obtidos resultados que mostram diferenças na expressão gênica e proteica de reprogramação, pluripotência e marcadores específicos de hepatócitos. Além disso, a segurança da abordagem também é validada com evidências bioquímicas e histológicas.A principal vantagem da reprogramação de células somáticas in vivo é que ela acontece de forma rápida, eficiente e transitória. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da reprogramação. Por exemplo, os resultados da indução de pluripotência em adultos in vivo.Para começar a anestesiar, uma fêmea de seis semanas de idade. Em seguida, prepare uma solução de DNA plasmidial ENC codificando os fatores Yamanaka e um controle salino conforme descrito no protocolo de texto que acompanha Para que a transfecção seja bem-sucedida, injete a dose inteira em não mais do que cinco a sete segundos em pontos de tempo predeterminados após a injeção. Isole os hepatócitos primários expondo a cavidade torácica e perfundindo o fígado com tampão HBSS pré-aquecido e, em seguida, digerir o fígado perfundir o meio a uma taxa de fluxo de 0,6 litros por minuto por 15 minutos até que o fígado fique inchado e solto.Em seguida, remova o fígado com uma pinça após cortar o falor e os ligamentos coronários. Para obter mais detalhes sobre o isolamento de células hepáticas primárias, consulte as etapas neste vídeo adicional do JoVE. Em seguida, lave o fígado com meio de lavagem de hepatócitos enquanto o passa por um filtro de células de 100 mícrons.Para obter uma suspensão celular, colete a suspensão celular em tubos de 50 mililitros e ajuste o volume para 15 mililitros com o meio de lavagem de hepatócitos. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 50 G durante quatro minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e suspender o sedimento celular.Em 10 mililitros de meio de lavagem de hepatócitos, o pellet celular deve ser suspenso com cuidado, pois os hepatócitos são células muito frágeis. Repetir o procedimento de centrifugação por um total de três vezes e suspender o pellet final em 10 mililitros de meio de lavagem de hepatócitos. Em seguida, estime o número de células usando um hemocitômetro e um microscópio óptico para estudar a expressão gênica de hepatócitos isolados.Comece centrifugando duas vezes 10 elevado às sextas células a 300 vezes G e descarte o snat. Em seguida, extraia o RNA das células com um kit de coluna de rotação seguindo as instruções do fornecedor. Em seguida, use um micrograma do RNA extraído dos grupos de tratamento e controle para realizar Q-R-T-P-C-R em duas etapas, a fim de procurar mudanças nos níveis de pluripotência de reprogramação e marcadores de hepatócitos.Para analisar a pluripotência aumentada das células no nível da proteína, pegue os hepatócitos isolados e ajuste a densidade das células para uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro. Para citometria de fluxo, prepare alíquotas de 100 microlitros da suspensão celular e fixe-as em 100 microlitros de citocitose BD. Fixe o tampão de fixação por 20 minutos à temperatura ambiente após a fixação, pelete as células e resus, suspenda-as em 100 microlitros de um tampão de lavagem de permeação X BD incube por 10 minutos, adicione a temperatura ambiente.Em seguida, incube as células com anticorpos primários para fatores de transcrição expressos em células pluripotentes por 30 minutos. Isso inclui anti-mouse T quatro por CP SCI 5.5 ou anti-US nag pe. Certifique-se de incluir também controles negativos e de isotipo.Em seguida, analise as células coradas no citômetro de fluxo com canais CP sci 5.5 e PE quatro dias após a injeção da seção criogênica de DNA do plasmídeo, o fígado, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, incube seções fixas de metanol em tampão de bloqueio à temperatura ambiente por uma hora, seguidas por duas etapas de lavagem por cinco minutos cada com tampão de lavagem. Em seguida, adicione anticorpos primários anti T quatro anti meias dois e anti nag em lâminas separadas, certificando-se de cobrir completamente o tecido hepático.Cobrir as amostras até à aberração preventiva e incubar as secções durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as seções três vezes por cinco minutos cada com tampão de lavagem. Em seguida, incube-os por 1,5 horas em temperatura ambiente com seus respectivos anticorpos secundários após a incubação.Lave as seções do fígado três vezes por cinco minutos cada com PBS. Monte-os em meio anti-desbotamento dappy e proteja-os com lamínulas. Em seguida, visualize as lâminas com um microscópio de epifluorescência.Aqueça as seções criogênicas à temperatura ambiente por 15 minutos e fixe-as com aldeído paraforme a 4% por dois minutos. Em seguida, seque as lâminas ao ar por 30 minutos. Depois de seco, incube as seções com substrato líquido B-C-I-P-N-B-T a 37 graus Celsius por 30 minutos.Durante esse tempo, a solução reagirá com a fosfatase alcalina no tecido para formar um precipitado insolúvel visível por microscopia. Após 30 minutos, lave as lâminas com água destilada e monte-as com meios de montagem aquosos. Em seguida, capture imagens usando microscopia de luz nos dias 4, 8, 12 e 120.Após a transfecção, colete 300 microlitros de sangue diretamente do ventrículo cardíaco. Mantenha o sangue no gelo enquanto as diferentes amostras estão sendo coletadas para evitar que coagule muito cedo. Depois que todas as amostras forem coletadas, incube-as por 30 minutos a 37 graus Celsius ou até que o sangue coagule.Em seguida, centrifugar as amostras a 2000 g durante cinco minutos e pipetar cuidadosamente o soro para um novo tubo einor. Em seguida, analise os níveis séricos de albumina e das enzimas hepáticas, A-L-T-A-S-T-A-L-P e GLDH usando um espectrofotômetro. Além de rastrear o sangue para avaliar a toxicidade hepática, prepare também seções de tecido embebidas em parafina, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.Em seguida, corar o tecido com coloração H e D ou PIS e analisar as imagens capturadas. Microscopia de luz após injeção hidrodinâmica da veia da cauda dos plasmídeos, um aumento significativo na expressão gênica dos fatores de reprogramação transfectados. T três, quatro, meias, dois e cmic no nível de mRNA foram observados no segundo dia após a injeção.A expressão desses fatores diminui com o tempo após a injeção. Os marcadores de pluripotência endógenos, nano g ECAT um e REX um, também foram significativamente regulados positivamente em comparação com os hepatócitos de animais injetados com solução salina no segundo e quarto dias após a injeção e voltaram aos níveis basais a partir do oitavo dia. Ao mesmo tempo, a desdiferenciação da população de hepatócitos foi confirmada pela regulação negativa de genes específicos de hepatócitos, A-L-B-A-A-T e TRF que foram estatisticamente significativos no quarto dia e atingiram os níveis basais a partir do oitavo dia.Além disso, a expressão de T três quatro e nag no nível da proteína foi investigada por citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. Apenas OC três quatro é expresso no primeiro dia. Após a injeção de HTV, enquanto para a expressão do marcador de pluripotência endógena nano G, foi necessário esperar até o quarto dia.A ocorrência de reprogramação celular in vivo foi confirmada por análise imuno-histoquímica dos tecidos hepáticos. Células positivas para todos os marcadores e atividade enzimática são reprodutíveis encontradas nos tecidos hepáticos de animais injetados em KSM, mas não nos controles injetados com solução salina. As colorações H e e PAS mostram sinais transitórios, mas não graves, de dano tecidual que se dissipou após o segundo dia.Não foi observada formação de teratomas ou qualquer sinal de displasia ou alterações morfológicas no período do estudo. Também não houve anormalidades funcionais hepáticas ao longo do estudo para nenhum dos animais, conforme confirmado pelos níveis de albumina e enzimas hepáticas mostrados aqui. Este estudo fornece evidências de prova de princípio de reprogramação celular in vivo em direção à pluripotência.Isso aconteceu de forma rápida, transitória e eficiente após a administração dos fatores Yamanaka. Nossa hipótese é que a reprogramação in vivo pode ser alcançada em outros tecidos além do fígado, desde que o gene adequado. Os vetores hepáticos são projetados para transfectar o tecido-alvo.Além disso, com protocolos e tecnologias aprimorados, pode ser possível extrair as células do programa in vivo para serem usadas em estudos posteriores.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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