Name: Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a detectar príons infecciosos após passagem pelo sistema digestivo de corvos-americanos usando bioensaio em camundongos. Este método ajuda pesquisadores a estudar transmissão de encefalopatias espongiformes em vida selvagem.

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Gostaríamos de agradecer a S. Werner para fornecer os corvos utilizados neste estudo e USDA, APHIS, WS, NWRC equipe de cuidados de animais para cuidar dos animais e monitoramento. Mencione ou utilização de um produto não implica o endosso do USDA. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo USDA, APHIS, Serviços Veterinários.

Nosso protocolo foi adaptado de um nós publicado anteriormente 7. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), de animais e plantas Serviço de Inspeção de Saúde (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Pesquisa da Vida Selvagem (NWRC) Institutional Animal Care e Use. 1. Corvo Gavaging <ol><li> Estimar o tempo de passagem do &#39;material cerebral pseudo&#39; através do trato digestivo de corvos americanos. <ol><li> Misture 5 ml de cozidos e ovos mexidos inteiro com corante azul e gavage um corvo com um 2 em agulha gavage (Figura 1). </li><li> Verifique corvo a cada 30 minutos até que azul / fezes verdes com manchas não estão mais sendo excretado. </li></ol></li><li> Obter RML (Chandler tensão) infectados C57BL / 6 cérebros não infectados e doentes terminais do mouse. </li><li> Gerar a 20% peso / volume normal e infectado homogeneizado mouse-cérebro em um homogeneizador de bala liquidificador com 1xsalina tamponada com fosfato (PBS) e esferas de vidro, em seguida, centrifugar a 3.000 g durante 1 min para remover as partículas maiores. Remover o sobrenadante e dilui-se com um volume igual de PBS 1x para gerar a 10% em peso / volume em PBS estéril. Congelar a -80 ° C até ser necessário. </li><li> 17 horas antes da gavage remover comida, mas não de água, a partir de penas de galinha. </li><li> Aleatoriamente alocar corvos para os grupos de tratamento e por via oral gavage cada corvo com 5 ml de homogeneizado normal ou infectado cérebro do rato usando um 2 em agulha gavage. </li><li> Transferência de corvos para gaiolas individuais e coletar e agrupar todas as fezes dentro de cada gaiola para 4 post hr gavage (Figura 2). </li><li> Homogeneizar fezes reunidas para cada corvo num homogeneizador bala misturador com esferas de vidro, até uma textura uniforme. * Fezes galinha são na maior parte de líquido e pode ser misturado facilmente. </li><li> Para cada corvo, diluir a 500 ul de homogeneizado fecal em 9,5 ml de 1x PBS para um volume total de 10 ml. </li><li> Centrifugar a homogena fecalte durante 15 minutos a 1400 xg e extrair o sobrenadante. </li><li> Para minimizar o risco de uma infecção microbiana secundária, tratar o sobrenadante com 1 ml de 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (Invitrogen, EUA) por cada 100 mL de homogeneizado, em seguida, colocar sob luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reduzir risco de contaminação viral e bacteriana. Após a exposição à radiação UV, as amostras sonicate em 3000 um Mp sonicador em configuração 70 para 30 segundos para romper a membrana de qualquer micróbio restantes. </li></ol> 2. Rato Inoculação <ol><li> Aleatoriamente alocar ratos para os seguintes grupos de tratamento (Tabela 1): <ol><li> Grupo 1 - camundongos positivos do tratamento inoculado por via intraperitoneal (IP) com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml de camundongo infectado cérebros. </li><li> Grupo 2 - Negativo camundongos inoculados tratamento IP com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml cérebros de camundongos normais. </li><li> Diluir infected e normal homogeneizado cérebro do rato para Grupos 3 e 4 a 1:100 w / v em 1x PBS. </li><li> Grupo 3 - murganhos de controlo positivo IP inoculados com 1 ml de homogeneizado de rato infectado-cérebro. </li><li> Grupo 4 - Negativo ratinhos de controlo inoculados IP com 1 ml de homogeneizado de cérebro de rato normal-. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Grupo de Tratamento </td><td> Número de animais </td></tr><tr><td> Grupo 1 </td><td> Scrapie + Corvo Fezes </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Grupo 2 </td><td> Scrapie - Corvo Fezes </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Grupo 3 </td><td> Scrapie + Mouse Cérebro </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Grupo 4 </td><td> Scrapie - Rato Cérebro </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Estatuto Tabela 1 Scrapie de inóculo (+ positivo, negativo -). Eo número de animais utilizados 7. <ol start="2"><li> Intraperitoneal inocular mouse: <ol><li> Scruff rato por dorsal pele do pescoço com o polegar eo dedo indicador e rode suavemente para expor o lado ventral. </li><li> Elevar extremidade posterior do mouse assim que a cabeça é um pouco menor. </li><li> Insira 25 G agulha através de um centímetro de pele, um centímetro lateral da linha média, e 1-2 cm anterior à articulação sacro-ilíaca, utilizando uma seringa de agulha de bloqueio. </li><li> Injectar 1 ml inocular lentamente rato cavidade do corpo. </li></ol></li></ol> 3. Rato de Monitoramento <ol><li> Monitorar os ratos diariamente até que eles expressam sinais clínicos de rato scrapie. Os sinais clínicos podem incluir: cifose, ataxia, rabo duro, falta de higiene, emagrecimento e letargia. </li><li> Pontuação ratos para cada um dos seis sinais clínicos, quando os sinais visíveis são evidentes, em que 0 = nenhum visível, 1 = moderado, 2 = e grave. </li><li> Eutanásia ratos quando escores totais diárias para cada signo atingir ≥ 8 para 1 dia, ≥ 6 continuamente por 3 dias, ou aos 365 dias após a inoculação (dpi). </li><li> Cérebros colheita imediatamente após euthanÁsia e armazenar a -70 ° C. </li><li> Para confirmar um diagnóstico de scrapie, digerir as amostras de cérebro com 3 mL de um 50 ug / ml de solução de proteinase K (PK) diluídos como se segue: 3.1. ul PK, 12,5 uL de EDTA 500 mM, pH 8, 109,39 ul de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, em seguida, desactivar o PK adicionando 8 ul de tampão de carga e incubando amostras a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras num gel de SDS-PAGE a 12%, electroforese e transferência para PVDF Immobilon membrana e bloqueio com 5% de leite desnatado em 0,2% de Tween 20 em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida sondar com Bar224 anticorpo monoclonal anti-PRP conjugado com peroxidase de rábano, diluído em Superblock, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar membrana durante 1 hora com PBS-Tween 20 a 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min com substrato quimioluminescente e imagem em um sistema de documentação de gel G-box. </li></ol>

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epizootiology+of+chronic+wasting+disease+in+free-ranging+cervids+in+Colorado+and+Wyoming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming.</a> Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+prion+transmission+in+mule+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Horizontal prion transmission in mule deer.</a> Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).</li>
<li>Sigurdson, C. J., Adriano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Wasting+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Chronic Wasting Disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+prion+transmission+in+mule+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of prion transmission in mule deer.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).</li>
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<li>Bruce, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmissions+to+mice+indicate+that+%27new+variant%27+CJD+is+caused+by+the+BSE+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent.</a> Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).</li>
<li>Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+lateral+transmission+of+scrapie+between+sheep+kept+under+natural+conditions+using+lymphoid+tissue+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy.</a> Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).</li>
<li>Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+prion+zoonoses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The risk of prion zoonoses.</a> Science. 335 (6067), 411-413 (2012).</li>
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<li>Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+larvae+and+pupae+as+vectors+for+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Fly larvae and pupae as vectors for scrapie.</a> Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).</li>
<li>Matthews, D., Cooke, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+transmissible+spongiform+encephalopathies+in+non-ruminant+livestock+and+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Scientifique+Et+Technique-Office+International+Des+Epizooties%22%5BJournal%5D)">The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish.</a> Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).</li>
<li>Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deer+carcass+decomposition+and+potential+scavenger+exposure+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).</li>
<li>Scherbel, C., Pichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+scrapie+associated+prion+protein+%28PrPSc%29+by+the+gastrointestinal+microbiota+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle.</a> Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).</li>
<li>Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapie+susceptible+and+scrapie-resistant+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).</li>
<li>Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+sheep+scrapie+brain+homogenate+to+rumen-simulating+conditions+does+not+result+in+a+reduction+of+PrP%28Sc%29+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels.</a> Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).</li>
<li>Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+BSE+and+scrapie+prions+in+stools+from+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models.</a> Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).</li>
<li>Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+shedding%2C+alimentary+clearance+and+intestinal+spread+of+prions+in+hamsters+fed+with+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie.</a> Veterinary Research. 40 (1), 4(2009).</li>
<li>Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li>
<li>Bjorndal, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+of+digestive+responses+in+two+generalist+herbivores%2C+the+tortoises+Geochelone+carbonaria+and+Geochelone+denticulate%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate.</a> Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).</li>
<li>Clark, R. G., Gentle, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+grain+passage+time+in+captive+mallards%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Estimates of grain passage time in captive mallards.</a> Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).</li>
<li>Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+intake%2C+digestion+and+passage+of+proboscis+monkey+%28Nasalis+larvatus%29+in+captivity%5BTitle%5D)+AND+%22Primates%22%5BJournal%5D)">Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity.</a> Primates. 33 (3), 399-405 (1992).</li>
<li>Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+feeding+strategies+and+potential+disease+transmission+in+Wisconsin+white-tailed+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer.</a> Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).</li>
<li>Pulford, B., Spraker, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+PrPCWD+in+feces+from+naturally+exposed+Rocky+Mountain+elk+%28Cervus+elaphus+nelsoni%29+using+protein+misfolding+cyclic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification.</a> Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).</li>
<li>Hicks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guano+deposition+in+an+Oklahoma+crow+roost%5BTitle%5D)+AND+%22Condor%22%5BJournal%5D)">Guano deposition in an Oklahoma crow roost.</a> Condor. 81 (3), 247-250 (1979).</li>
<li>Aldous, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Winter+habits+of+crows+in+Oklahoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Winter habits of crows in Oklahoma.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos um procedimento para documentar a passagem de material de PrP Res através do sistema digestivo de corvos. Usamos métodos convencionais para determinar se os corvos têm a capacidade de translocação de material PrP Res para áreas geográficas livres da doença. Outros avaliaram a resistência de PrP Res para ruminantes 19-21 e roedores 22,23 fluidos digestivos, sendo que ambos não conseguiram eliminá-lo. A futura aplicação destas técnicas devem ser aplic...

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são desordens neurodegenerativas fatais infecciosas que afetam a vida selvagem, os animais domésticos e seres humanos. O agente infeccioso de doenças TSE parece ser isoformas deformadas ou patogênicos (PrP Res) de uma proteína príon. EET animal incluem doença debilitante crônica (CWD) em veados (Odocoileus hemionus), veados de cauda branca (Odocoileus), alces (Cervus elaphus) e alce (Alces alces); scrapie em ovinos e caprinos; encefalopatia espongiforme bovina ( BSE) em gado doméstico; encefalopatia mink transmissível em mink viveiro; encefalopatia espongiforme felina em gatos; exótico encefalopatia espongiforme ungulados em exótico jardim zoológico rumina da família dos bovídeos, e encefalopatia espongiforme em primatas não humanos 8. A doença TSE humano único, a doença de Creutzfeldt-Jakob variante, é raro e pensado para ser adquirida através do consumo de PrP Res-contaminalimentos ciado 9. Da mesma forma, a EEB pode infectar os seres humanos se carne contaminada é consumida 10. De todas as doenças TSE, scrapie e CWD são os dois únicos com epidemias auto-sustentáveis ​​e fontes de infecção se presume ser de animal para animal 2,3,11, bem como a partir de fontes ambientais 4-6. A pesquisa sugere que a maioria das doenças TSE exigem períodos de incubação prolongados notáveis ​​de eventos de exposição naturais de PrP Res a manifestação de sinais clínicos 2-4,6,8 e barreiras de espécies aparentes minimizar, mas não eliminar o potencial de, a transmissão entre espécies 12-14 . Identificar mecanismos para a propagação do príon infeccioso (PrP Res) o material é extremamente importante para responder a perguntas sobre como as doenças TSE mover por toda a paisagem. Estudos experimentais têm sugerido que os insetos 15,16, aves e suínos 17, e os corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos) 7,18 são portadores passivos ou dispersores de material PrP Res. A passagem de material de PrP Res através do sistema digestivo de corvos foi recentemente documentado, demonstrando o papel que podem desempenhar na dispersão de doenças TSE 7. Estes resultados tornam plausível que corvos, um limpador, poderia encontrar, consumir e transportar o material infeccioso via deposição de fezes, para áreas livres da doença. Os procedimentos que demonstram aqui foram usados ​​para documentar a passagem de material PrP Res através do sistema de digestão de corvos e vai facilitar muito a aplicação destes métodos para outro limpador e modelos específicos de espécies de carnívoros em futuras pesquisas relacionadas. Neste estudo foram utilizados os métodos convencionais para investigar um meio não-convencionais de tráfico de material PrP Res, o que poderia contribuir para a disseminação e carga global de material PrP Res.

<table><tbody><tr><td>Cepa RML Chandler scrapie adaptado para camundongos</td><td>Rocky Mountain Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC57BL / 6 camundongos</td><td>Hilltop Lab Animals Corvos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>americanos</td><td>capturados</td><td></td><td></td>selvagens</tr><tr><td>Caneta / Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K solução</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007 e 0009</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris SDS PAGE 12% gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immobilon PVDF</td><td>Millipore</td><td>1SEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Bullet homogeneizador misturador</td><td>Braintree Scientific</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>2,3 mm Grânulos de zircônia/sílica</td><td>Produtos BioSpec</td><td>11079125Z</td><td></td></tr><tr><td>Bar224 anticorpo monoclonal anti-PrP</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009035</td><td></td></tr><tr><td>Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37517</td><td></td></tr><tr><td>substrato quimioluminescente</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>G-box sistema de documentação em gel</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

procedimentos para identificar infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Material de príon infeccioso (PrP Res) é provável que a causa da fatal, neurodegenerativa Encefalopatia Espongiforme Transmissível (EET) doenças 1. A transmissão de doenças TSE, tais como a doença debilitante crónica (CWD), presume-se ser de animal para animal de 2,3, bem como a partir de fontes ambientais 4-6. Catadores e carnívoros têm potencial para translocação de material PrP Res através do consumo e excreção de carniça contaminados com CWD. Trabalhos recentes tem documentado passagem de material PrP Res através do sistema digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), um limpador norte-americano comum 7. Nós descrevemos os procedimentos utilizados para documentar a passagem de material PrP Res através corvos americanos. Crows foram tratadas por gavage com RML-deformação scrapie adaptado do rato e suas fezes foram coletadas 4 post hr gavage. Fezes galinha foram em seguida reunidas e injectadas por via intraperitoneal emC57BL / 6. Ratos foram monitorados diariamente até que eles manifestaram sinais clínicos de rato scrapie e foram, posteriormente, submetidos à eutanásia. Camundongos assintomáticos foram monitoradas durante 365 dias após a inoculação. Análise de Western blot foi realizada para confirmar o estado da doença. Os resultados revelaram que os príons infecciosos permanecer depois de viajar através do sistema digestivo de corvos e estão presentes nas fezes, causando doença em ratos de teste.

Os procedimentos utilizados demonstram que o sistema digestivo do corvos não elimina PrP Res. infecciosidade 4 h após gavagem oral de homogeneizado de cérebro scrapie 7. Todos os vinte corvos que foram tratadas por gavage com material PrP Res posteriormente transmitidos material de PrP Res via fezes de ratos. Ratos doentes foram identificados pela manifestação dos sinais rato-scrapie clínicos e confirmação da doença foi completada por análise de Western blot. <p class="jov...

Catadores têm potencial para translocam infecciosas transmissíveis prions encefalopatia espongiforme em suas fezes para áreas livres da doença. Nós métodos de detalhes usados ​​para determinar se prions de scrapie mouse adaptados permanecer infeccioso após a passagem que o trato digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), o consumidor comum de animais mortos.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

O objetivo geral deste procedimento é documentar a passagem de material infeccioso PreOn através do sistema digestivo de American Crows. Isso é feito primeiro medindo corvos com material PreOn infeccioso. O segundo passo é coletar as fezes do corvo por quatro horas após a gavagem e prepará-las para injeção em camundongos.Em seguida, os camundongos são inoculados intraperitoneal com um mililitro de homogeneizado fecal de corvo. A etapa final é monitorar os camundongos diariamente até que eles expressem sinais clínicos de raspagem de camundongos. Em última análise, a análise de western blot é usada para confirmar a presença de PreOn infeccioso no modelo de camundongo e verificar a transmissão da doença.A ideia de que os corvos poderiam transportar. CWD veio até nós em um dia de inverno, quando depois de dirigir para uma instalação de alces em cativeiro, onde estávamos fazendo algumas pesquisas e vendo alces atropelados sendo alimentados por corvos, e mais tarde naquele dia, corvos saindo do céu do nada, pousando nesses cochos de alimentação, alimentando-se ao lado dos alces, defecando no grão que os alces estavam consumindo, além da observação da literatura de que muitos dos corvos n

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.

Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo

Um método para preservar, detectar e seqüência de RNA a partir de vírus da gripe aviária foi validado e estendido usando naturais amostras de fezes de pássaros. Esta técnica elimina a necessidade de manter uma corrente fria e manipulação de vírus infeccioso e podem ser aplicados em uma instalação de 96 poços de alto rendimento.

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar proteína príon mal dobrada em seções cerebrais usando imuno-histoquímica. Ao tratar a seção cerebral com ácido fórmico para desnaturar príons e minimizar o risco de infecção, bem como desmascarar os agregados de príons usando a recuperação de epítopos induzida por calor, as seções são imunomarcadas para os agregados de proteína de príon mal dobrados e observadas ao microscópio.

Detecção de proteínas príon anormais no tecido cerebral usando imuno-histoquímica

Um protocolo de exame clínico curto é apresentado para auxiliar na detecção de sucata clássica e atípica em ovelhas e cabras.

Protocolo de Exame Clínico para Detectar Scrapie Atípico e Clássico em Ovelhas

Medir a barreira à transmissão interespécies de doenças priônicas é desafiador e normalmente envolve desafios em animais ou ensaios bioquímicos. Aqui, apresentamos um ensaio de conversão de proteína príon in vitro com a capacidade de prever barreiras de espécies.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Aqui nós apresentamos um protocolo para criar cirurgicamente 'intestinais laços ligados' no intestino de frango. Este procedimento permite a comparação de virulência em situ em um único host vários as estirpes Clostridium perfringens . Esse método marcadamente diminui o número de galinhas geralmente necessários para experimentos semelhantes na vivo .

Um modelo de alça Intestinal ligados em galinhas livres anestesiados patógeno específico para estudar a virulência de Clostridium Perfringens

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Falta um método para avaliar áreas comumente usadas em ambientes de laboratório para contaminação por príons e descontaminação eficaz. O protocolo descrito aqui fornece os principais fundamentos para a implementação de um teste de segurança de príons em laboratório que pode ser facilmente modificado para atender às necessidades individuais de laboratórios específicos.

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Aprenda a detectar príons infecciosos após passagem pelo sistema digestivo de corvos-americanos usando bioensaio em camundongos. Este método ajuda pesquisadores a estudar transmissão de encefalopatias espongiformes em vida selvagem.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

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