Enriquecimento e purgação de células-tronco embrionárias humanas pela detecção de antígenos da superfície celular usando os anticorpos monoclonais TG30 e GCTM-2

O objetivo geral deste procedimento é classificar subconjuntos de células-tronco embrionárias humanas por sua ligação ao antígeno de superfície celular dos dois anticorpos monoclonais TG 30 e GC TM. Isso é feito pela primeira dissociação de células-tronco embrionárias humanas ou culturas HESC em suspensões unicelulares. Na segunda etapa, os HESC são corados com os anticorpos monoclonais, TG 30 e GCTM dois.

Finalmente, as células são separadas por classificação celular ativada por fluorescência e devolvidas à cultura. Em última análise, a capacidade de formação de colônias das células selecionadas pode ser avaliada por citometria de fluxo e microscopia de contraste de fase. A imagem principal dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a observação visual, é que ela fornece uma medida objetiva da pluripotência célula por célula para um grande número de células, e isso facilita a separação das células-tronco embrionárias das células diferenciadas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pluripotência, como como as mudanças nas condições de cultura afetam quantitativamente diferentes células-tronco embrionárias humanas e linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Demonstrando o procedimento hoje estarão os cientistas pesquisadores do meu laboratório, George Zoe Hun Chi e Bay Wang, Para fazer uma suspensão de célula única de Hess, comece aspirando os meios de cultura de Hess de dois frascos T 75 contendo uma linha de células Hess cultivada. Lave cada frasco com 10 mililitros de DPBS e, em seguida, incube cada cultura com três mililitros de solução de dissociação expressa triplo E a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Após cinco minutos, bata na lateral do frasco para desalojar as células e, em seguida, confirme o descolamento ao microscópio. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura a frio a cada frasco usando uma pipeta estéril de 10 mililitros. Tritrate suavemente as células dissociadas várias vezes contra a parede do frasco para obter uma suspensão predominantemente unicelular.

Agora agrupe as suspensões de célula única hes através de um filtro de célula de 70 mícrons em um tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros para corar os antígenos da superfície celular de Hess. Primeiro Eloqua cerca de 100.000 células em 150 microlitros de mídia em cada um dos seis tubos de microcentrífuga de controle de 1,5 mililitro. Em seguida, incubar os tubos de controle e a amostra de classificação restante com os anticorpos primários de interesse em volumes de reação final de 200 microlitros e cerca de nove mililitros, respectivamente, em meios de cultura, incluindo os controles de isotipo.

Coloque os tubos horizontalmente no gelo e misture-os delicadamente por 30 minutos em uma plataforma de balanço. Depois de girar as células, descarte o sobrenadante e lave a amostra de classificação em 20 mililitros de meio de cultura a frio e as amostras de controle em 200 microlitros do mesmo. Agora incube a amostra de classificação em um volume final de 2,5 mililitros com os anticorpos secundários apropriados em meios de cultura a frio e os controles em um volume final de 200 microlitros do mesmo adicione o anticorpo PE anti-US CD 90.2 recém-preparado ao tubo de controle apropriado neste momento também.

Mais uma vez, misture delicadamente os tubos horizontalmente no gelo por 30 minutos em uma plataforma de balanço. Depois de girar as células, ressuspenda novamente a amostra de classificação em 20 mililitros de meio de cultura a frio e os controles em 200 microlitros e lave as células duas vezes no meio. Ressuspender a amostra de classificação em dois a três mililitros de meios de cultura frios suplementados com iodeto de propídio e cada um dos controles, exceto as células não coradas, em 300 microlitros do mesmo.

Em seguida, coe cada suspensão de célula individual através de um filtro de célula de tampa de 35 mícrons acoplado a cinco tubos de ensaio de fundo redondo de poliestireno de polietileno de cinco mililitros e centrifugue os tubos para forçar qualquer suspensão de célula residual nas tampas do filtro nos tubos. Em seguida, bata nas laterais dos tubos para ressuspender cada suspensão de célula única e coloque as células no gelo. Configure o citômetro de fluxo para TG 30 GCTM duas classificações de células ativadas por fluorescência de modo que as suspensões de células Hess dissociadas sejam fechadas como células únicas para eliminar possíveis aglomerados e duplicatas.

Em seguida, remova os detritos potenciais com as portas de dispersão dianteiras e laterais para que apenas as células intactas sejam classificadas. Em seguida, exclua as células não viáveis com base em sua expressão de iodeto de propídio. Bloqueie os fibroblastos embrionários de camundongo ou células alimentadoras de metanfetamina por seleção negativa com base em sua expressão de camundongo CD 90,2 pe.

Defina o TG 30 G CTM duas marchas negativas de acordo com a autofluorescência de fundo para as células não coradas e também os controles de isotipo. A fração HESC viável isolada livre de alimentadores de metanfetamina pode então ser finalmente fracionada em TG 30 GCT M negativo dois TG negativo 30 GCT baixo M dois TG baixo 30 médio GC TM dois médios e TG 30 alto GCTM duas subpopulações altas. Depois de configurar o citômetro de fluxo, adicione um mililitro de meio condicionado por metanfetamina a cada um dos dois tubos de ensaio redondos de poliestireno de cinco mililitros e coloque-os no gelo.

Em seguida, recupere 400.000 células cada uma das subfrações diferenciadas TG 30 negativas GC TM duas negativas e pluripotente TG 30 alta GCTM duas subfrações celulares altas. Depois de girar os tubos de coleta, resus suspende cada pellet celular em um mililitro de meio condicionado MEF pré-equilibrado. Em seguida, semeie um frasco T 75 pré-equilibrado, um terço de densidade MEF com o HESC de cada fração em meio condicionado com metanfetamina, incube as culturas de células a 37 graus Celsius a 5% de CO2, atualizando o meio diariamente por aproximadamente duas semanas.

Culturas de células pluripotentes TG 30 de alto GCTM de duas células altas mostram colônias semelhantes a troncos humanos após uma semana e atingem cerca de 80% de fluência de co em nove a 11 dias. Culturas de TG 30 negativo GC TM duas células negativas crescem principalmente como um gramado de fibroblastos como células que atingem a cofluência em 11 a 13 dias. A detecção combinada dos antígenos de superfície celular TG 30 e GC TM dois permite a discriminação de vários subconjuntos celulares no estágio pluripotente e em vários estágios de diferenciação inicial de HESC, conforme indicado por sua expressão de marcadores de células-tronco e fatores de transcrição específicos da linhagem de acordo com relatórios anteriores, o TG 30 GC TM dois negativos baixos, subfrações médias e altas podem ser discriminadas dentro da linha de células-tronco embrionárias humanas masculinas usadas para este estudo aqui, as porcentagens das diferentes subpopulações fechadas típicas de uma análise de citometria de dois fluxos TG 30 GCTM são mostradas no experimento mostrado aqui.

Um número definido de TG 30 GCT M negativo duas células negativas foi cultivado consecutivamente após a triagem por aproximadamente duas semanas e, em seguida, recorreu à coleta apenas do TG 30 GCT M negativo duas frações negativas antes do replaqueamento. A cada passagem, os resultados indicam que a subfração inicial TG 30 gct M negativa duas subfrações negativas enriquece para TG 30 GCT M negativo duas células diferenciadas negativas após empacotamento consecutivo. Uma população menor de TG 30 GCT M alto duas células altas é detectada na passagem inicial, mas eventualmente desaparece com o empacotamento adicional, deixando apenas amostras grátis de células-tronco pluripotentes.

Aqui é mostrada a morfologia típica do gramado de TG 30 GCT M negativo diferenciado duas células negativas após 14 dias. Observe que as colônias esporádicas do tipo HESC observadas após 14 dias se misturaram com as três células negativas de TG 30 GC TM duas células negativas que são provavelmente geradas pela contaminação de TG 30 de alta GCT M duas células altas. Observe que isso ocorre raramente e na passagem inicial pós-fatos com base em observações anteriores usando este ensaio, espera-se que a coleta e o cultivo de TG 30 GCTM alto duas células altas enriqueçam para HSCs pluripotentes formadoras de colônias.

Portanto, o empacotamento consecutivo de TG 30 pluripotente de alta GCTM duas células altas após a classificação por citometria de fluxo também foi investigado nessas culturas representativas, as células foram selecionadas por fax usando TG 30 e G CT M duas, substituindo apenas as TG 30 de alta G CTM duas células altas em cada passagem. Desta forma, observou-se que a maioria das células estava localizada nas subfrações associadas à pluripotência, indicando uma população enriquecida de células pluripotentes que também mantém uma capacidade de diferenciar e regenerar uma pequena porcentagem de TG 30 G CTM negativo, duas células negativas. Além disso, culturas consecutivas de TG 30 de alto G CTM duas células de alta classificação exibem um grande número de colônias semelhantes a HESC após a passagem, indicando também a manutenção do estado de pluripotência.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de calibrar o aparelho de fax antes de usar todas as vezes para garantir a reprodutibilidade dos resultados seguindo este procedimento. Outros métodos como microarrays, sequenciamento do genoma completo ou teratomas podem ser realizados para responder a perguntas como essas células são realmente pluripotentes após seu desenvolvimento? Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de células-tronco pluripotentes induzidas explorarem a segurança e a estabilidade dessas células em comparação com as células-tronco embrionárias humanas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e corar cuidadosamente culturas mistas de células-tronco enbr humanas para enriquecer as células periet. Não se esqueça de que trabalhar com células humanas pode ser extremamente perigoso e as precauções, como usar luvas e trabalhar com classe dois por gabinete de segurança, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.