Name: Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a usar cocultura com Bacillus subtilis para detectar interações microbianas mediadas por compostos secretados. Este método permite visualizar mudanças na expressão gênica em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O autor agradece a Roberto Kolter (Harvard Medical School) para o seu conselho e assistência durante o desenvolvimento desta tela co-cultura de valor inestimável. Ela também graças Matthew Powers para a leitura do manuscrito para a clareza e Chia-yi Cheng para a assistência com a obtenção Figura 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li>
<li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiston%2C+DW+%22Introduction+to+Fluorescent+Proteins%22">Introduction to Fluorescent Proteins</a>. , (2013).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li>
<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
<li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+%28CGG%29+genes+in+different+bacterial+genera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li>
<li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li>
<li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
<li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Saccharomyces+interactions%3A+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma das limitações inerentes a este protocolo é que ele conta com o cultivabilidade de organismos microbianos. Como tem sido bem documentada 24, mais a vida microbiana no planeta não pode (ainda) ser cultivadas sob as condições de cultura exploradas até o momento. Assim, um grande número de interações entre espécies microbianas que estão ocorrendo em ambientes naturais vai passar despercebido usando essa abordagem. No entanto, uma vez que o nosso desejo é o de identificar não só a existência de tais interacçõ...

Estamos interessados ​​em compreender como os metabólitos que as bactérias segregam afetam a fisiologia eo desenvolvimento de micróbios vizinhos. Muitos metabolitos têm sido caracterizados pelos seus efeitos bioactivos sobre os outros micróbios. Dois exemplos bem descritos incluem os antibióticos, os quais inibem o crescimento de outros micróbios e as moléculas de quorum sensing, que alteram a expressão génica global de outros micróbios. No entanto, as bactérias produzem muitos outros produtos naturais de moléculas pequenas que não têm bioatividades conhecidos 1. Nós supomos que as bactérias têm evoluído e preservada a capacidade de produzir alguns destes metabolitos porque lhes permitem modular a fisiologia celular de seus vizinhos microbianos nas comunidades microbianas complexas dentro do qual a maioria das bactérias existentes. Tipos de células de Bacillus subtilis Nós nos concentramos nossos estudos sobre as interações microbianas quimicamente mediadas que envolvem Bacilsubtilis lus. Isto não é só por causa de seu status como a bactéria modelo Gram-positivas e as ferramentas genéticas resultantes disponíveis para sua manipulação, mas também devido à sua capacidade de se diferenciar em tipos de células caracterizadas. Exemplos incluem células que são: natação; produzem a matriz extracelular que é necessária para a formação de biofilme robusta; competentes para tomar-se o ADN a partir do ambiente, e esporulação, entre outros, 2. Cada um destes tipos de células expressa um regulão transcricional característica que torna fisiologicamente e / ou fisicamente distintos dos seus irmãos geneticamente idênticos. Sob muitas condições de crescimento, vários tipos de células como coexistir várias subpopulações dentro de uma única colónia de B. células subtilis 3. Embora muitas espécies de bactérias podem apresentar análogo tipo de célula heterogeneidade, esse fenômeno tem sido particularmente bem estudada em B. subtilis. Em particular, os genes que são upregulated dentro de cada uma delas específica B. tipos celulares subtilis foram identificados. A identificação de tais genes regulados positivamente é essencial para o trabalho aqui descrito, porque muitos destes fenótipos microbianos de interesse são difíceis ou impossíveis de se observar directamente. Por exemplo, não podemos detectar visualmente um traço, como natação em sólidos (1,5%) placas de ágar, apesar de uma subpopulação de B. células subtilis produzir flagelos nessas condições 3. Um outro exemplo é a produção de matriz de biofilme. Produção Matrix pode ser visualizado por morfologia da colônia (pois resulta em colônias macroscopicamente enrugados), mas apenas em determinado meio de crescimento, e só depois de vários dias de crescimento 4. No entanto, sabendo que os genes são regulados positivamente durante a diferenciação, podemos construir os repórteres de transcrição que actuam como marcadores de diferenciação celular para estes tipos de células. Construções repórter Estes fluorescente trepórteres ranscriptional constituído pelos promotores de genes específicos do tipo de células conduzindo a produção de um gene repórter, por exemplo, uma proteína fluorescente. Exemplos incluem P hag-YFP (para natação células), P Tapa-YFP (para as células produtoras de matriz do biofilme), e P SSPB-YFP (por esporulação células), onde P x indica a região do promotor para o gene de x. Estas construções repórter são integrados em um locus neutro no cromossoma (Figura 1 e ver abaixo) de modo a que a regulação natural do fenótipo é deixada intacta. No entanto, agora, quando uma célula expressa este fenótipo, que também expressa uma proteína fluorescente. Isso proporciona uma leitura fora facilmente visualizado da ativação de determinado comportamento fenotípica, permitindo-nos para triagem de micróbios que ativam esta resposta fisiológica. Embora tais repórteres são comumente usados ​​em microbiologia, eles não têm sido amplamente aplicada em telas para identifinterações metabólicas y entre micróbios antes deste método foi descrito 5. Há uma série de considerações importantes na concepção e construção de linhagens de células-repórter específicos do tipo. Utilizamos repórteres fluorescentes exclusivamente de transcrição, embora outros tipos de construções são certamente possível. Nós desencorajamos o uso de fusões traducionais como marcadores para diferenciação tipo de célula em nossa tela, no entanto, por duas razões: 1) o desejo de deixar o tipo específico de célula proteína nativa imperturbável, e 2) o reconhecimento de que uma difusa, célula- grande fluorescência será mais fácil de detectar do que puncta localizada no interior das células (comum com fusões de translação). Selecção do gene repórter Após decidir usar a transcrição de um-para ler, o gene repórter tem de ser seleccionada (por exemplo, LacZ, fluorescência, ou luciferase). LacZ tem a vantagem de necessitar de menos especializado equipamento para detectar, mas há uma probabilidade muito maior de falsos positivos entre os micróbios ambientais. Nas nossas mãos, o nível de Lac + organismos entre os micróbios do solo do fundo era proibitivamente alta (&gt;&gt; 10% de micróbios do solo eram azuis (Lac +) em placas de X-gal, dados não mostrados). É possível que por titulação da concentração de X-gal no meio, isto pode ser optimizado para permitir a utilização de um repórter com X-gal, mas não esta tentativa. Luciferase oferece alta sensibilidade de detecção e é a repórter mais ortogonal: não há quase nenhuma chance de micróbios ambientais sendo luminescente inerentemente. No entanto, descobrimos que é difícil identificar instrumentação em nossa instituição que permitiu a detecção de luminescência através de placas de Petri inteiras, como a maioria foi projetado para digitalizar regiões localizadas apenas em placas de multi-bem. Também pode haver complicações em visualizar colônias luminescentes de uma maneira que também permitiu a física simultânea éolation de organismos indutores. Enquanto estiver usando fiduciários pode ter feito isso possível, nós em vez optou por usar repórteres transcricionais fluorescentes, que foram provados trabalhar em B. subtilis, uma sensibilidade adequada e de detecção de baixas taxas de falsos positivos entre os organismos do solo, e deixou-se o uso de instrumentação facilmente disponível para visualização e os procedimentos de isolamento. Seleção Fluoróforo O fluoróforo específico escolhido dependerá de suas espécies de bactérias, o meio de crescimento agar você está usando, eo filtro de fluorescência especial define que você tem disponível. Com a nossa instrumentação, descobrimos que tanto o B. subtilis colônias si e do ágar foram cultivadas em exibiram fundo menos fluorescência quando foram usados ​​filtros YFP (proteína fluorescente amarela), fazendo com que o repórter superior a GFP (proteína fluorescente verde) em nossas mãos. A utilização do codão de proteínas fluorescentes sãofreqüência otimizada para eucariotos, tornando-se importante para selecionar um fluoróforo ou conhecidos da literatura para trabalhar em suas espécies bacterianas, ou para testá-lo explicitamente usando um promotor constitutivo. Um grande número de constante evolução variantes da proteína fluorescente estão disponíveis 6, que foram revistas em uma série de fontes de 7,8, alguns dos quais prevêem expressamente a orientação sobre a escolha de uma proteína fluorescente apropriado para a sua experiência 9. Seleção Promotor A seleção de um promotor vai depender muito do seu tipo de célula ou fenótipo de interesse. Para os organismos tais como B. subtilis, alguns genes repórter específicos do tipo de célula ter sido estabelecida na literatura. Para outras cepas de bactérias, examinando microarray ou transcrição de dados será necessário fornecer informações sobre quais genes são altamente regulada de acordo com as condições em que o seu tipo de célula de interesse is manifestado. Um estudo recente catalogado a transcrição de B. subtilis sob 104 diferentes condições de crescimento, utilizando microarrays azulejos 10. Este documento fornece informações abrangentes sobre quais genes são altamente regulada em diferentes condições, o que é de valor inestimável para os fenótipos menos bem caracterizados. Ao invés de mapear regiões promotoras específicas para cada gene de interesse, que normalmente simplesmente utilizar a sequência de 200-500 pb a montante do gene como promotor. O comprimento exacto sequência depende do contexto genómico: regiões mais curtas são utilizados quando necessário para evitar a inclusão de regiões codificantes a montante da vizinha grelhas de leitura abertas. Loci e integração Neutro Como manter a construção repórter na sua estirpe bacteriana torna-se a última pergunta na concepção de uma fluorescente tensão transcricional repórter. Em bactérias, os genes de interesse são frequentemente mantidosem plasmídeos utilizando selecção de antibiótico. No entanto, pode não ser possível a utilização de antibióticos durante a co-cultura sem matar os microrganismos ambientais. Se os plasmídeos são mantidos estavelmente nas suas espécies bacterianas, pode ser possível aumentar suas bactérias contendo um plasmídeo repórter-borne, na presença de antibióticos para se preparar o repórter para o rastreio, e, em seguida, eliminar o uso de antibióticos durante o próprio co-cultura, na esperança de que o plasmídeo vai ser suficientemente mantidas para permitir a fluorescência. No entanto, se plasmídeos são facilmente perdidos em sua bactéria, ou são perdidos em condições de estresse, isso não vai ser uma opção viável. Em muitos casos, a melhor solução será integrar a construção repórter no cromossoma bacteriano, que permite a manutenção estável do repórter, mesmo na ausência de selecção. Para que a integração para não atrapalhar a expressão normal ou regulação de seu gene de interesse, recomendamos a integração em um site ectópica no cromossomo que can actuar como um &quot;locus de ponto morto.&quot; Em B. subtilis estes locais de integração são genes que - quando mutado - transmitir um fenótipo em certos meios de comunicação mínima (permitindo que integrantes de ser identificado sem seleção antibiótico), mas não alteram o crescimento ou a produção de esporos em rich media, e incluem genes como Amye, Laca, thrC, pyrD, gltA, e Saca (transmitindo a capacidade de utilizar o amido, β-galactósidos, treonina, uracilo, glutamato, e de sacarose, respectivamente) 11-13. Embora a integração destes genes têm sido eficazmente utilizados durante muitos anos em B. subtilis (particularmente em Amye e Laca), conhecimento similar pode não estar disponível para genes em muitas outras espécies bacterianas. O uso de pontos de ligação de fagos são ótimas alternativas para os locais de integração cromossômicas neutros: muitas espécies específicas 14-16, bem como sites gerais de integração, como local de ligação a Tn7 (att Tn7) têmforam identificados e utilizados para as inserções de genes em muitas espécies bacterianas 17,18. Micróbios ambientais Nós usamos o solo como uma fonte direta de micróbios ambientais para nossa tela de co-cultura. O solo contém uma grande diversidade de microrganismos, e muitos desses organismos são fonte rica de produtos naturais. Utilizando suspensões líquidas de solo colocadas directamente em placas com a estirpe repórter fluorescente transcrição (sem isolamento prévio das bactérias do solo), é possível simplificar consideravelmente a abordagem experimental. O solo pode ser usado imediatamente após a colheita, ou congeladas a -80 ° C para uso futuro. O uso imediato tem a vantagem de uma maior diversidade de micróbios potencialmente podem ser cultivadas, incluindo aqueles que não irão sobreviver a congelação bem. Tem a desvantagem de que a concentração de organismos do solo cultivável a partir destas amostras é desconhecida, o aumento do número de placas de tela que tem de ser usado. Delayed utilização tem a vantagem de que os ufc / ml para cada fonte de solo pode ser determinada previamente, permitindo que um número optimizado de colónias a ser cultivado em cada placa de tela. No entanto, é necessário que os organismos do solo ser capaz de sobreviver congelamento. Note-se que a diversificação da piscina indutor sendo examinado (ou seja, as fontes de solo) parece ser mais eficaz na identificação de novas interações entre espécies de triagem em profundidade sobre o mesmo solo: maior diversidade filogenética foi observada nos acessos identificados em nossa tela de matriz de indução como fontes adicionais de solo foram examinados em vez de triagem das mesmas fontes de solo mais profundamente (EA Shank e R. Kolter, Harvard Medical School, resultados não publicados). Visão global A abordagem que descrevemos aqui é simples em termos de seus requisitos técnicos. Trata-se: 1) a construção de uma transcrição repórter fluorescente em B. subtilis ou umaoutras espécies de bactérias de interesse, 2) identificar as condições em que este repórter não está activado, 3) a preparação de aliquotas desta estirpe repórter e os organismos a serem rastreadas (no nosso caso o solo, mas outras fontes podem ser utilizadas em vez disso), 4) misturando estes dois conjuntos de micróbios em meios sólidos, 5) identificar e isolar putativo induzindo organismos, e 6), confirmando que estes organismos, de fato ativar este fenótipo em uma tela secundária. Uma vez identificados, estes organismos e seus metabolitos nos fornecem ferramentas químicas para modular o comportamento de bactérias, para estudar a fisiologia bacteriana e interacções microbianas, e para actuar potencialmente como novos suportes para compostos terapêuticos futuras.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td>Qualquer espectrofotómero capaz de medir valores de 600 absorvância.</td></tr><tr><td>Caldo Luria, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Podem ser necessárias fontes de mídia alternativas.</td></tr><tr><td>Contas de vidro, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel, redondas</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Varetas de vidro</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Estreoscópio de dissecação de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>O autor utilizou um estereoscópio de dissecação Zeiss Stemi SV6 com uma fonte de luz fluorescente EXFO X-cite 120, um cubo de filtro YFP de passagem longa, uma objetiva acromática de 0,63X, oculares de 10X e um Câmera digital Axio HRC HR. A maior parte da triagem foi feita com a montagem de foco em 2.0-3.2X. Qualquer estereoscópio de dissecação com recursos de fluorescência é bom, desde que você tenha os filtros corretos para o FP que está usando. É melhor se houver um obturador que permita alternar facilmente entre campo claro e fluorescência, bem como um palco que permita a iluminação de cima e de baixo. Se você deseja capturar imagens, uma câmera acoplada também é necessária.</td></tr></tbody></table>

usando coculture detectar quimicamente mediada interespécies interações

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Na natureza, as bactérias raramente existem isoladamente, pois eles estão em lugar cercado por um conjunto diversificado de outros microorganismos que alteram o meio ambiente local através da secreção de metabólitos. Estes metabolitos têm o potencial de modular a fisiologia ea diferenciação de seus vizinhos microbiana e são prováveis ​​fatores importantes para a criação e manutenção de comunidades microbianas complexas. Nós desenvolvemos uma tela à base de co-cultura de fluorescência para identificar tais interacções microbianas quimicamente mediados. A tela envolve a combinação de uma transcrição repórter tensão fluorescente com micróbios ambientais em meios sólidos e permitindo que as colônias de crescer em co-cultura. O repórter transcricional fluorescente é projetado de modo que a estirpe bacteriana escolhido fluorescência quando é expressar um fenótipo de interesse particular (ou seja, a formação de biofilme, esporulação, a produção de fator de virulência, etc.) A triagem é realizada sob condições de crescimento where este fenótipo não é expresso (e, por conseguinte, a estirpe repórter é tipicamente não fluorescente). Quando um micróbio ambiental segrega um metabolito que activa este fenótipo, difunde-se através do ágar e ativa a construção repórter fluorescente. Isto permite que a indução de-produzir metabolito micróbio para ser detectado: eles são as colónias não fluorescentes mais proximais às colónias fluorescentes. Assim, esta tela permite a identificação de micróbios ambientais que produzem metabólitos difusíveis que ativam uma resposta fisiológica especial em uma cepa repórter. Esta publicação aborda como: a) selecionar as condições de co-cultura de rastreio adequados, b) preparar o repórter e micróbios ambientais para o rastreio, c) executar a tela de co-cultura, d) isolar putativo induzindo organismos, e e) confirmar a sua atividade em uma tela secundária. Nós desenvolvemos este método para triagem de organismos do solo que ativam biofilme matriz de produção em Bacillus subtilis </em&gt;, no entanto, também discutimos considerações para aplicar esta abordagem a outras bactérias geneticamente tratáveis.

Esta tela foi utilizado para identificar organismos do solo que segregam uma substância que altera a fisiologia do B. subtilis. Os resultados descritos aqui focar o tipo de células produtoras de matriz de B. subtilis, que produz a proteína e exopolissacarídeo que são necessários para a formação de biofilme robusta nesta bactéria. Nós selecionamos o promotor do operon Tapa-sipW-tasa para nossa construção repórter fluorescente (P tapa-YFP). Este operão codifica o componente e...

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar interações entre diferentes micróbios que são mediados por compostos secretados e levam a mudanças na expressão gênica bacteriana. Isso é conseguido pela cultura de cepa bacteriana contendo um repórter transcricional fluorescente com micróbios ambientais como colônias em placas de Petri de ágar. Os círculos laranja representam colônias de micróbios ambientais.Enquanto os círculos azuis são colônias do repórter, o crescimento em meio sólido permite que os metabólitos que essas colônias produzem se difundam através do ágar e ativem a expressão gênica em colônias repórter próximas. Os potenciais acertos indicados aqui com estrelas são aquelas colônias que podem estar secretando compostos que alteram a expressão gênica no repórter. Esses organismos são isolados das placas de tela de co-cultura.Esses indutores potenciais são testados novamente em uma triagem secundária para confirmar que eram os organismos secretores de moléculas que alteram a expressão gênica bacteriana no repórter. Embora este método forneça informações sobre as interações formadoras de biofilme de bacillus subtles com organismos do solo, ele também pode ser aplic

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Speare, L., et al. Ensaio de Coincubação para Quantificar Interações Competitivas entre Isolados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio de co-incubação usado para estudar como as cepas bacterianas competem em um ambiente compartilhado. É amplamente aplicado em microbiologia para identificar mecanismos, como morte dependente ou independente de contato, que impulsionam essas interações.

Ensaio de Coincubação para Estudo de Interações Competitivas entre Cepas Bacterianas

Fonte: Nathoo, N., et al. Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações moleculares e sinalização planta/micróbio. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra um sistema de co-cultivo hidropônico para estudar as interações planta-bactéria em condições estéreis. As mudas das plantas são transferidas para um meio de crescimento ácido estéril, incubadas e inspecionadas quanto à contaminação antes da inoculação com Agrobacterium. As bactérias ativadas se...

Um sistema de co-cultivo para estudar as respostas moleculares de hospedeiros vegetais e bactérias em interação

Fonte: Temkin, M. I. et al. Ensaios de Cocultura de Alto Rendimento para a Investigação de Interações Microbianas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar interações microbianas entre Corynebacterium propinquum e Staphylococcus em uma cocultura.

Um ensaio in vitro para estudar interações microbianas em co-cultura

As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.

Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Este protocolo fornece uma diretriz abrangente para a configuração e monitoramento quantitativo de co-culturas, incluindo cianobactérias secretoras de açúcar fotoautotróficas e leveduras heterotróficas.

Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

Aprenda a usar cocultura com Bacillus subtilis para detectar interações microbianas mediadas por compostos secretados. Este método permite visualizar mudanças na expressão gênica em tempo real.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Explorar mais vídeos