Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar interações entre diferentes micróbios que são mediados por compostos secretados e levam a mudanças na expressão gênica bacteriana. Isso é conseguido pela cultura de cepa bacteriana contendo um repórter transcricional fluorescente com micróbios ambientais como colônias em placas de Petri de ágar. Os círculos laranja representam colônias de micróbios ambientais.

Enquanto os círculos azuis são colônias do repórter, o crescimento em meio sólido permite que os metabólitos que essas colônias produzem se difundam através do ágar e ativem a expressão gênica em colônias repórter próximas. Os potenciais acertos indicados aqui com estrelas são aquelas colônias que podem estar secretando compostos que alteram a expressão gênica no repórter. Esses organismos são isolados das placas de tela de co-cultura.

Esses indutores potenciais são testados novamente em uma triagem secundária para confirmar que eram os organismos secretores de moléculas que alteram a expressão gênica bacteriana no repórter. Embora este método forneça informações sobre as interações formadoras de biofilme de bacillus subtles com organismos do solo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como interações microbianas que afetam a expressão de virulência em espécies de estafilococos ou pseudomona. De fato, teoricamente, pode ser aplicado para identificar interações microbianas que alteram a expressão gênica de qualquer repórter em qualquer micróbio geneticamente tratável Depois de gerar construções repórter fluorescentes para o organismo de sua escolha, de acordo com o protocolo de texto, colete o solo removendo os 0,5 centímetros superiores do solo superficial exposto antes de usar uma espátula para coletar solo e tubos cônicos, Adicione 0,85% de solução salina estéril a uma proporção de 10 mililitros por um grama de solo para fazer uma pasta de solo e vortex por um minuto para desalojar as bactérias das partículas do solo.

Depois de deixar a pasta do solo assentar por um minuto, transfira a camada aquosa superior para um tubo novo, dilua o repórter e as amostras de solo de acordo com o protocolo de texto e localize 50 microlitros de cada uma no centro das placas de tela de co-cultura sob condições que não ativarão a construção repórter sozinha. Também coloque uma amostra de solo sozinha e um repórter sozinho como controle. Adicione cerca de 23 milímetros de esferas de vidro estéreis em cada placa e espalhe as células mantendo as placas na bancada e sacudindo-as para frente e para trás.

Enquanto gira até que o líquido seja absorvido, vire as placas e descarte as esferas em um copo de resíduos contendo etanol. Depois de incubar as placas de co-cultura usando fluorescência e começando do topo da placa, mova lentamente a placa para frente e para trás no campo de view para pontos brilhantes. Após uma varredura completa, gire a placa 90 graus e repita o processo.

Quando um ponto fluorescente é detectado, ligue lentamente a iluminação de campo brilhante e determine se a fluorescência está associada a uma colônia bacteriana. Isolar os organismos indutores putativos, que serão as colônias não fluorescentes proximais às colônias fluorescentes. Posicione-os no centro do campo de visão e acessíveis pela mão dominante, deixando a lâmpada fluorescente acesa.

Ligue lentamente o Brightfield para identificar pela forma e posição a colônia fluorescente e os organismos indutores circundantes Usando uma haste de vidro, pegue uma ponta de carregamento de gel redonda estéril de 200 microlitros e segure-a como um lápis. Descanse a palma da mão externa contra o palco para estabilizá-lo na superfície de trabalho. Em seguida, coloque a outra mão no lado interno do polegar da mão para estabilizar a ferramenta de coleta, mantendo a ponta da pipeta acima da superfície da placa.

Mova-o para o campo de visão e centralize-o acima da colônia que você gostaria de escolher. A dica ficará fora de foco. Usando a borda externa da mão, gire lentamente a ponta da pipeta para a colônia a ser colhida.

Toque-o levemente tentando minimizar quantas outras colônias a ponta entra em contato sem girar a ferramenta de coleta. Listre a ponta em uma seção de um prato novo. Após a colheita das colônias, incube as placas de acordo com as diretrizes do ensaio.

Quando as colônias estiverem visíveis, use um estereoscópio para determinar se um ou vários tipos de organismos estão crescendo na placa re streak Cada tipo de morfo em uma placa fresca e incube até crescer. Para testar se os indutores putativos são verdadeiros indutores, prepare gramados do repórter e cepas parentais não fluorescentes. Depois que as placas secarem, use palitos de dente estéreis para coletar células das colônias de teste.

Remende em um prato em branco e depois nos dois pratos de gramado. Alternativamente, suspenda os supostos organismos indutores em um mililitro de meio líquido em um veterinário de plástico estéril e meça o OD 600 das suspensões após normalizar o OD de cada suspensão para chegar a um OD 600 de 0,5 ponto, um microlitro de cada suspensão em cada uma das três placas. Finalmente, depois de permitir que os organismos cresçam, use a fluorescência sob um microscópio de dissecação para identificar organismos indutores putativos que ativam a cepa repórter fluorescente, mas não a cepa de controle parental.

A tela aqui foi usada para identificar organismos do solo secretores de compostos que alteram a expressão gênica de um componente estrutural da matriz do biofilme em b sutis usando um repórter transcricional fluorescente. Idealmente, cada placa de co-cultura deve conter uma proporção de um para um de repórter para colônias de solo que são colônias individuais bem espaçadas. Aqui, ilustramos como ter uma alta proporção de colônias repórter mostradas como círculos azuis em relação às colônias de solo mostradas como círculos marrons aumenta a confiança em identificar o organismo indutor real a partir de placas de co-cultura.

Os organismos indutores do solo secretam compostos que ativam o repórter. Múltiplas colônias repórter serão induzidas na placa com a maior proporção repórter para solo, facilitando a identificação dos verdadeiros indutores mostrados em vermelho de outros indutores putativos indicados por estrelas. O teor de nutrientes controla a extensão da formação de colônias de crescimento, enquanto a diluição do inóculo determina se as colônias resultantes estão adequadamente dispersas.

Como visto nesta co-cultura, a imagem B sutil produz uma matriz de biofilme fluorescente em resposta a vários micróbios do solo. Para os solos que examinamos, tivemos uma alta taxa de acerto para o repórter de matriz Ptap A YFP. Isso contrasta com nossos resultados não publicados de telas análogas.

Usando a esporulação e a competência, os repórteres foram poucos ou nenhum acerto identificado. Assim, as taxas de HI para diferentes tipos de células são altamente variáveis e podem ser difíceis de prever com antecedência. Aqui são mostrados dois exemplos de placas de tela de co-cultura antes e depois que as colônias indutoras em potencial foram escolhidas para isolamento.

Os resultados negativos e positivos do método de patch e spot são mostrados aqui, com aproximadamente 50% das colônias examinadas em nossa tela secundária sendo verdadeiros positivos. Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, por exemplo, sequenciamento de DNA SR de 16 s para determinar a identidade filogenética do organismo indutor ou usando espectrometria de massa HPLC em RMN para determinar a identidade química do composto ativo.