Name: Contextual e Cued Medo Condicionado Teste Usando um sistema de análise de vídeo em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 19 min 32 s
Description: Aprenda a realizar testes de condicionamento de medo contextual e por sinal em camundongos usando um sistema automatizado de análise de vídeo. Este protocolo padronizado melhora a confiabilidade das avaliações comportamentais em neurociência.

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Alguns dos dados aqui apresentados foram obtidos no laboratório do Dr. Jacqueline N. Crawley no Instituto Nacional de Saúde Mental dos EUA e nós gostaríamos de lhe agradecer por nos permitir mostrar os dados no papel. Agradecemos também Kazuo Nakanishi por sua ajuda no desenvolvimento de programa ImageFZ para análise comportamental. Esta pesquisa foi apoiada por Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B) (21300121), Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras (Comprehensive Cérebro Science Network) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura do Japão , conceder a partir de Neuroinformatics Japão Center (NIJC) e doações do CREST do Japão Agência de Ciência e Tecnologia (JST).

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Confirmamos que não há conflitos de interesse conhecidos associados com esta publicação e não houve apoio financeiro significativo para este trabalho que poderia ter influenciado o seu resultado.

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos paradigmas mais utilizados para avaliar a aprendizagem ea memória. Este teste é uma forma de condicionamento pavloviano em que é feita uma associação entre um contexto e / ou um estímulo condicionado (sinal sonoro) e um estímulo aversivo (footshock elétrica). Depois de até mesmo um único par do contexto / sinal sonoro e footshock, os ratos apresentam congelamento de longa duração, quando confrontado com qualquer contexto ou a sugestão. Neste ensaio, o comportamento de congelação é usado como um índice de memória medo. Os estudos farmacológicos e lesão revelaram que a formação da memória, consolidação e recuperação são regulados por diversas regiões do cérebro, como a amígdala, o hipocampo e córtex pré-frontal 3,33-35. Além disso, estudos de genética molecular têm demonstrado o papel dos genes e moléculas envolvidos na aprendizagem e na memória nestas regiões do cérebro usando camundongos geneticamente modificados 36 específicas. Portanto, este teste é simple e útil para explorar a base neurobiológica aprendizagem medo subjacente e memória. Neste artigo filme, apresentamos nosso protocolo para fornecer pesquisadores com informações detalhadas para entender e facilmente realizar o teste. Comportamento de congelamento foi quantificada através da observação direta por experimentadores humanos. Um pesquisador bem treinado é esperado para produzir resultados estáveis ​​confiáveis ​​em todo observações. No entanto, este método envolve potenciais problemas, tais como diferenças no método de observação, vieses do observador, e os erros de quantificação simples, o que torna difícil comparar diretamente os resultados de pesquisadores independentes e diferentes laboratórios. Um sistema de medição de computador baseado em photobeam automatizado também foi usado 26,30-32. No entanto, este sistema também apresenta problemas potenciais na medição comportamentos de congelamento. Devido ao arranjo de sensores, este sistema pode ser incapaz de detectar pequenos movimentos da cabeça que typically ser marcado como &quot;ativo&quot; através da observação humana. Além disso, tremendo durante o congelamento pode ser considerado como não congelantes porque quando um congela animais, interrupções intermitentes no photobeam são observadas como conseqüência do tremor. Como um método alternativo, automatizados imagem e vídeo-análise de sistemas foram desenvolvidos 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 descritos alguns sistemas com programas de software de análise de imagem que têm boa validade e marcar congelamento bem 17,20,37-38. No entanto, a maioria destes sistemas e programas de análise tem que ser obtida a partir de fornecedores comerciais e são tipicamente dispendiosos. Nós desenvolvemos o software ImageFZ para a análise do comportamento de congelamento, e este programa é distribuído como um programa de software livre. ImageFZ detecta o mouse como um corpo de pixels (uma partícula) e discrimina sutil movimento do mouse como &quot;congelamento&quot; ou &quot;não-congelamento &#39;, dependendo da quantidade deárea de regiões que não se sobrepõem entre as partículas de cada par de imagens consecutivas. Como mostrado nos resultados representativos, as medições utilizando o programa ImageFZ são consistentes com ou mais preciso do que o obtido utilizando outros métodos. Assim, o programa ImageFZ mede automaticamente o comportamento que os observadores humanos julgar como o congelamento de acordo com critérios definidos. Além disso, o programa ImageFZ calcula a distância percorrida (cm) antes, durante e após a exposição ao choque no pé, o que facilita uma avaliação da sensibilidade de choque e a análise do comportamento de congelação. Existem diferenças metodológicas entre os laboratórios. Essas diferenças podem resultar em dificuldade de comparação de dados entre os laboratórios e em replicar os resultados em diferentes laboratórios. Para obter dados mais estáveis ​​e comparáveis, é necessário normalizar o protocolo de teste, tanto quanto possível. O sistema de análise com ImageFZ leva à automação de processos de ensaio, o que pode contribuir paraa padronização dos protocolos usados ​​em laboratórios. Várias respostas comportamentais devem ser considerados quando se analisa o comportamento de congelamento. Em primeiro lugar, quando os animais enfrentam uma situação temerosa, eles podem fugir em vez de congelar 39. Fugindo é uma das respostas de medo, e sua ocorrência vai levar a subestimar a memória do medo. Em segundo lugar, a congelação pode depender de um nível de actividade geral, e o nível de actividade em ratinhos experimentais e de controlo necessita de ser examinado. Por exemplo, apesar de ratinhos sem o receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostrou níveis reduzidos de congelação em comparação com ratinhos de tipo selvagem, vários testes comportamentais indicaram que os resultados podem ser atribuídos ao seu fenótipo de hiperactividade em vez da sua diminuição da memória 18. ImageFZ calcula a distância (cm) percorrida pelos sujeitos. Os dados estão disponíveis para examinar se existem diferenças nos níveis gerais de atividade entre os sujeitos. Se houver uma diferença no grupoa distância percorrida, uma abordagem possível para o problema é de considerar a distância percorrida durante o primeiro 2 min de formação, como a actividade da linha de base e para usar uma razão de supressão (razão de supressão = (actividade durante o teste) / (actividade da linha de base durante a + actividade durante teste)) como um índice secundário de medo 17,40. Finalmente, uma diferença na sensibilidade à dor, induzir as alterações na reactividade a um choque nas patas eléctrico, se houver, pode resultar em variações do comportamento de congelação. ImageFZ também calcula a distância percorrida (cm) em detalhe a partir de 2 segundos antes de uma exposição de um choque nas patas de 2 segundos a 2 segundos após a exposição (em 6 segundos), o qual pode ser utilizado como um indicador da sensibilidade do choque nas patas. Sistemas de vídeo-análise de ter sido desenvolvido para medir o comportamento de congelamento de albino, preto, cutia, e diluir os ratos marrons. ImageFZ utiliza uma bandeja de piso preto e grades pretas para examinar ratos brancos (ver Figura 1B). As grades pretas são feitas de especi<html> aliado processado metais revestidos com tinta preta e tem uma condutividade eléctrica semelhante à das grelhas de metal não revestida, que são tipicamente utilizados para ratos pretos. ImageFZ também analisa o comportamento de congelamento em ratos e outros roedores por meio de ajustes dos parâmetros do programa. Na versão atual do ImageFZ, o comportamento do sujeito é gravado usando uma câmera de vídeo a partir da parede superior para analisar o congelamento. ImageFZ também pode ser usado em uma configuração em que as imagens são captadas a partir do lado da câmara. Além disso, o ImageFZ controla um máximo de quatro aparelhos. Este recurso permite ao pesquisador analisar simultaneamente quatro ratos, economizando tempo e reduzindo os possíveis influências de diferenças no tempo de execução de cada um dos temas e da ordem de testes sobre o comportamento. Assim, ImageFZ simplifica o procedimento de teste e análise do comportamento de congelamento, e este programa facilita o teste com menos trabalho e sem qualquer tipo de formação para os experimentos comportamentais. e_content &quot;&gt; No laboratório Miyakawa, avaliamos mais de 110 cepas de ratos geneticamente modificados e dos ratos de controle do tipo selvagem no teste de condicionamento do medo contextual e cued utilizando o sistema de vídeo análise para elucidar os efeitos de um determinado gene na aprendizagem e memória 41-42 Obtivemos um grande conjunto de dados brutos para mais de 5.000 ratos Os dados brutos que foi usado para artigos de pesquisa publicados 4-16 estão incluídos no &#39;Mouse Fenótipo banco de dados &quot;, como um banco de dados público (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Este artigo filme presente fornece informações detalhadas a respeito dos detalhes do nosso procedimento experimental e promove a compreensão da situação de teste.

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é o paradigma comportamental utilizado para avaliar medo associativa aprendizagem e memória em roedores 1-3. Este teste tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos neurobiológicos da aprendizagem medo e memória em camundongos transgênicos e knockout 1,4-16. Comportamento de congelamento, que é definida como a imobilidade completa, com a exceção da respiração, é uma resposta comum a situações de medo. Neste paradigma comportamental, depois de animais são expostos a um emparelhamento de um sinal sonoro com uma footshock elétrica, eles respondem ao estímulo de produção de medo, mostrando o comportamento de congelamento, que é medido como um índice de aprendizagem medo associativa e memória. Este teste requer equipamentos menos elaborado, menos esforço físico pelo investigador, e muito menos tempo de treinamento para os ratos do que outras tarefas de aprendizagem e memória, que geralmente requer cerca de 5-10 min / dia por rato durante 2 dias. Embora o procedimento de teste é simple e requer pouco tempo para realizar, o investigador deve cuidadosamente observar e medir o comportamento do mouse e, portanto, vários sistemas automáticos de medição foram desenvolvidos para realizar a análise comportamental 17-20. Nosso sistema de vídeo-análise, que foi desenvolvido com o programa de software ImageFZ, nos permite analisar facilmente o comportamento de congelamento e produzir resultados altamente confiáveis. Este artigo fornece informações detalhadas sobre o nosso procedimento de teste e descreve como usar o programa de software ImageFZ.

<table><tbody><tr><td>Programa ImageFZ</td><td>Desenvolvido por Tsuyoshi Miyakawa</td><td></td><td>Este programa está disponível através da O'Hara & Co., Tóquio, Japão e para download gratuito em http://www.mouse-phenotype.org/. Este software é executado no Windows XP/Vista/7 de 32 bits.</td></tr><tr><td>Câmara de condicionamento</td><td>O' Hara & Co., Japão</td><td>CL-3002L</td><td>Para o rato.</td></tr><tr><td>Câmara de ensaio com focagem</td><td>O' Hara & Co., Japão</td><td>CLT-3002L</td><td>Para o rato.</td></tr><tr><td>Interface</td><td>O' Hara & Co., Japão</td><td>CL-1040</td><td>A interface inclui um gerador de ruído branco/tom, que pode ser controlado pelo programa ImageFZ.</td></tr><tr><td>Gerador de choque embaralhado</td><td>O' Hara & Co., Japão</td><td>SGA-2040</td><td>O gerador de choque pode ser controlado pelo programa ImageFZ.</td></tr><tr><td>Testador de grade de choque (amperímetro)</td> <td>O' Hara & Co., Japão</td><td>SG-T</td><td></td></tr><tr><td>USB dispositivo de captura de vídeo</td><td>XLR8</td><td>USB2IVOSX</td><td></td></tr><tr><td>divisor de imagem quádruplo</td><td>Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japão</td><td>400AS</td><td></td></tr><tr><td>Sala à prova de som</td><td>O' Hara & Co., Japão</td><td>CL-4210</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de Congelamento</td><td>San Diego Instruments, Inc., CA, EUA</td><td></td><td>16 x 16 photbeam array&nbsp; (espaçamento de 2,5 cm)</td></tr></tbody></table>

contextual e cued medo condicionado teste usando um sistema de análise de vídeo em ratos

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos testes comportamentais, que avalia a capacidade dos ratos para aprender e lembrar uma associação entre estímulos ambientais e experiências aversivas. Neste teste, os ratos são colocados numa câmara de condicionamento e são dadas as aparas de um estímulo condicionado (de um sinal sonoro) e um estímulo não condicionado aversivo (um choque nas patas eléctrica). Depois de um tempo de atraso, os ratinhos são expostos à mesma câmara de condicionamento e uma câmara com uma forma diferente de apresentação do sinal sonoro. Congelamento comportamento durante o ensaio é medido como um índice de memória medo. Para analisar o comportamento automaticamente, desenvolvemos um sistema de análise de vídeo usando o programa de software aplicativo ImageFZ, que está disponível como um download gratuito em http://www.mouse-phenotype.org/. Aqui, para mostrar os detalhes do nosso protocolo, demonstramos o nosso procedimento para o contextual e cued teste medo condicionado em ratos C57BL/6J usando o sist ImageFZem. Além disso, nós validado nosso protocolo e o desempenho do sistema de vídeo de análise por meio da comparação do tempo de congelação medido pelo sistema ImageFZ ou um sistema de medição de computador baseado em photobeam com que marcado por um observador humano. Como mostrado nos resultados representativos, os dados obtidos por ImageFZ foram semelhantes aos analisados ​​por um observador humano, indicando que a análise comportamental usando o sistema ImageFZ é altamente fiável. O artigo filme presente fornece informações detalhadas sobre os procedimentos de teste e irá promover a compreensão da situação experimental.

No teste de medo condicionado, experimentadores humanos utilizado para quantificar o comportamento de congelamento por meio de observação direta de trabalho intensivo 26-29, mas de medição computador recentemente com base em photobeam (por exemplo, o sistema de &quot;Congelar Monitor &#39;) e imagem em análise de sistemas têm sido usados ​​para automaticamente medir o comportamento de congelamento 26,30-32. ImageFZ é um sistema de análise de imagem-automatizado, o qual produz os resultados comparáveis ​​àqueles obtidos por meio de observação humana, tal como descrito abaixo. Aqui, nós comparamos os resultados de observação humana com os de análise ImageFZ sob parâmetros variáveis: &#39;Rate (quadros / seg) &quot;e&quot; Congelamento critério (pixels). Neste experimento, cinco camundongos C57BL/6J machos (média de peso corporal ± SD (g), 31,4 ± 3,55, com média de tamanho do corpo ± SD (pixels), 351,6 ± 62,2) foram utilizados em 15-27 semanas de idade. A observação humana foi feita usando um programa de evento de gravação (um programa de software Macintosh OS9); um evento de pressionar a tecla que continued por 2 segundos ou mais, quando um rato exibido um ataque de nenhum movimento foi considerado &quot;congelamento&quot;. A percentagem de congelamento foi calculado a cada 60 segundos em cada um dos testes e utilizado para análises de correlação. A porcentagem de congelamento marcado pelos dois observadores (confiabilidade interobservador, para condicionado, r = 0,879; para teste de contexto, r = 0,957; para teste cued, r = 0,866, para todos os casos, r = 0,888) foi em média de gerar um ser humano marcar. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através ImageFZ com cada taxa de quadros (ou seja, 1, 2 e 4 fps) e aqueles obtidos através de observações humanos foram examinados. Tal como ilustrado na Figura 4, as percentagens calculadas através de congelamento ImageFZ (1, 2, e 4 fps) eram altamente correlacionados com o valor médio obtido a partir da medição dos dois observadores. Notavelmente, a captura de imagens a uma taxa de quadros mais alta nem sempre produz a melhor correlação. A análise de imagem em 1 resultados fps gerado semelhantes aos obtidos a partir de observadores humanos e emteste ach. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através de observações humanas e utilizando ImageFZ em cada condição do &#39;critério de congelamento (pixels) &quot;(ou seja, 20, 30 e 40 pixels) foram examinados. As percentagens de congelamento calculados usando ImageFZ no &#39;critério de congelamento (pixels)&#39; de 20, 30 e 40 pixels foram, em todos os casos, altamente correlacionada com os obtidos através de observações humanas (Figura 5). Como mostrado na Figura 5D, quando o critério de congelamento é definido para um valor baixo, o movimento sutil de um rato, consideradas como &quot;congelamento&quot; por observadores humanos, seria considerado &quot;não-congelamento &#39;usando ImageFZ. Por outro lado, se o critério é definido para um valor alto, o movimento de um rato, marcado como &quot;não-congelamento &#39;por observadores humanos, seria considerado&#39; congelamento &#39;usando ImageFZ (Figuras 5C, 5F, e 5I). Assim, para obter os resultados mais fiáveis, cada um dos parâmetros do programa ImageFZ deve ser calibrado nósção os dados marcados através de observações humanas em cada ambiente de teste. Além disso, compararam-se os resultados obtidos por um observador humano, usando um sistema de medição com base photobeam computador (o sistema de monitor de congelamento), com os obtidos usando ImageFZ (ver Figura 6). O observador humano desconhecia o grupo de tratamento e os resultados do ImageFZ marcar. Para os ajustes dos parâmetros do sistema de congelamento Monitor, usamos três medidas de porcentagem de congelamento de um sistema previamente validado 30. Resumidamente, o número de intervalos de 10 seg, em que os animais necessitaram de mais de 1 ou 2 segundos a atravessar a primeira nova feixe do intervalo (10 seg 1 seg e 2 seg 10 seg, respectivamente) e a latência entre o início de cada intervalo de cinco segundos e a terceira nova interrupção do feixe dentro deste intervalo (Latency3) foram medidos. As percentagens dos intervalos durante o qual o mouse foi congelamento ou a porcentagem da quantidade total de tempo required para quebrar o terceiro photobeam foram calculados. As percentagens de congelamento medidos em cada sistema estão ilustrados na Figura 6. Os grupos foram comparados por meio de duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (ver Tabela 1). As percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ (Figura 6B) foram mais semelhantes aos marcados através da observação humana (Figura 6A) do que os resultados obtidos utilizando um sistema baseado em photobeam (Figuras 6C-E). As percentagens de congelamento medidos utilizando o programa ImageFZ em cada teste foram altamente correlacionados com aqueles marcou através da observação humana (condicionado, r = 0,947, teste de contexto, r = 0,970; cued teste, r = 0,934), enquanto que as correlações entre as percentagens de congelamento medido utilizando o sistema de medição de computador baseado em photobeam (10seg 1s, 2s 10seg, ou Latency3) e o observador humano foram menores (condicionado, r = 0,503, 0,593, e 0,761; contexto test, r = 0,772, 0,819 e 0,912) em comparação com as correlações entre as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ e observação humana (Figuras 7A e 7B). Além disso, a Figura 7 revela que as diferenças entre as percentagens de congelação obtidos através da observação humana e usando ImageFZ em cada rato foram as menores diferenças. Estes resultados indicaram que as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ foram semelhantes aos obtidos através de observação humana e que ImageFZ é altamente preciso, quando a medição da quantidade de congelamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> Figura 1. Aparelhos de contextual e cued teste medo condicionado. (A) Uma câmara quadrada de acrílico para o teste de condicionamento e contexto, ( <strong&gt; B) grades de metal sobre um piso de plástico branco para preto, cutia, ou diluir os ratos marrons (em cima) e grades de metal preto electrifiable sobre um piso de plástico preto para ratos brancos (inferior), as imagens ampliadas das grades são mostrados na direita painel, (C) um gerador de ruído / tom branco e um gerador de choque, (D) uma sala à prova de som, e (E) uma câmara triangular acrílica com um piso plano para o teste cued. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática do protocolo. (A) Visão geral do contextual e cued teste medo condicionado, (B) condicionado, (C) cCONTEXTO teste, e (D) com pistas de teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> Figura 3. A análise de imagem pelo software ImageFZ. Para cada par de imagens sucessivas, sendo a quantidade de área (pixels), através do qual o rato é movido calculado ImageFZ. Quando esta área é inferior a um certo limiar (por exemplo, 30 pixels), o comportamento é julgada ser &quot;congelamento&quot;. Quando a quantidade de área igual ou superior ao limiar, o comportamento é considerado &quot;não-congelamento &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Comparações entre as percentagens de congelamento calculados a partir de imagens em diferentes taxas de quadros usando ImageFZ com os medidos através da observação humana. Os testes de medo condicionado foram realizados utilizando camundongos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores marcou o comportamento de congelamento. Simultaneamente, imagens ao vivo foram capturados em 4 fps usando o programa ImageFZ. Os arquivos capturados em 4 fps foram reduzidos depois de extrair os quadros para corresponder a imagens capturadas em 1 fps ou 2 fps. Os valores dos parâmetros de &quot;Rate (frames / seg)&quot; foram definidos como 1, 2 ou 4 fps, e as porcentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir de arquivos de imagem usando análise offline ImageFZ. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Os coeficientes de correlação de Pearson entre os dados obtidos a partir da observação humana e análise ImageFZ foram calculados.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. As percentagens de congelamento calculados a partir das imagens em diferentes valores de critério de congelamento, utilizando ImageFZ e os medidos através de observações humanos foram comparados. Os testes de medo condicionado foram conduzidos utilizando ratos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores registraram o comportamento de congelamento, e as imagens foram capturadas ao vivo usando o programa ImageFZ. As percentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir das imagens (1 frame / seg) através de análise offline ImageFZ, definir os valores dos parâmetros do &quot;critério de congelamento (pixels) &#39;a 20, 30 ou 40 pixels. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Co correlação de Pearsonefficients entre os dados obtidos a partir da observação humana ea análise ImageFZ foram calculados em cada teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> Figura 6. Os percentuais de congelamento foram medidos usando sistemas automatizados e observação humana em grupos incondicionados e condicionados de camundongos C57BL/6J machos (n = 5, cada grupo). (A) a observação humana, (B) ImageFZ, (C) Bloqueio de Sistema Monitor de 1 (10seg 1seg), (D) Bloqueio de Sistema Monitor 2 (2seg 10seg) e (E) Bloqueio de Sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparações foram realizadas utilizando duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (uncovs condicionado grupo nditioned grupo, * P &lt;0,05; †, p &lt;0,01). Os dados obtidos com ImageFZ foram semelhantes aos marcou através da observação humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> Figura 7. Correlação e distribuição das diferenças entre as porcentagens de congelamento, medidos usando sistemas automatizados e de observação humana. (AB) Gráficos de dispersão e os coeficientes de correlação de Pearson entre as porcentagens de congelamento marcados através de sistemas automatizados e observação humana freqüência são mostrados. As percentagens de congelamento, calculados usando ImageFZ, foram altamente correlacionados com os obtidos através da observação humana. (CF) Ocorrências de menos de um dif 10%rença entre as percentagens de congelação obtidos a partir de sistemas automatizados versus observação humana foram maiores quando os dados analisados ​​usando ImageFZ foram comparados com aqueles analisados ​​através da observação humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ANOVAs </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Condição </td><td> Tempo </td><td> Condição x Tempo </td></tr><tr><td> Dia 1 (condicionado) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 </td><td> F (7,56) = 20,79, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 16,58, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 </td><td> F (7,56) = 21,40, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 11,69, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 </td><td> F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 </td><td> F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (2sec10sec) </td><td> F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 </td><td> F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 </td><td> F (7,56) = 1,52, p = 0,1803 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 </td><td> F (7,56) = 9,94, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 </td></tr><tr><td> Dia 2 (contexto) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 </td><td> F (4,32) = 1,48, p = 0,2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 </td><td> F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 </td><td> F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 20,28, p = 0,002 </td><td> F (4,32) = 1,63, p = 0.1918 </td><td> F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (2sec10sec) </td><td>F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 </td><td> F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 </td><td> F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 </td><td> F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparações de estatísticas.

Este artigo apresenta um protocolo para um teste de condicionamento do medo contextual e cued usando um sistema de vídeo de análise para avaliar o medo de aprendizagem e memória em camundongos.

Contextual e Cued Medo Condicionado Teste Usando um sistema de análise de vídeo em Ratos

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

O teste de condicionamento contextual e agudo ao medo é um teste comportamental amplamente utilizado para avaliar a capacidade de Lawrence de aprender. Lembre-se de associações entre uma experiência agressiva e pistas ambientais. No entanto, neste teste existem algumas diferenças metodológicas entre o local de trabalho, o que pode resultar na dificuldade de comparação de dados e na duplicação de resultados.Para obter dados mais estáveis e tivos, é importante padronizar o protocolo de teste o máximo possível. Nele demonstramos o protocolo do teste de campo. O teste de funcionamento do medo é um teste simples, sensível e confiável para avaliar sua memória.Este teste é frequentemente usado para entender o mecanismo neurológico e molecular e subjacente ao aprendizado e à memória, e também para avaliar a função cognitiva de potenciais modelos de camundongos de transtornos psiquiátricos, como transtorno pós-estresse e esquizofrenia. No teste de comportamento voltado, que é medido como um índice de aprendizagem e memória é pontuado pela ização de observadores humanos, foram alguns sistemas automatizados para analisar o comportamento de uso automaticamente. Desenvolvemos um sistema de análise de imagem usando o programa de software baseado em imagem FG e imagem A.Estamos distribuindo esse programa de software e ele pode ser baixado gratuitamente neste endereço. Neste, apresentamos nosso protocolo de teste e o sistema de análise automatizado. Primeiro, mostramos como proteger o operador do aplicativo como imagem do programa de software.Em segundo lugar, demonstramos os protocolos detalhados do teste, incluindo teste de contexto de condicionamento e teste Q para dispositivo usando o sistema. Finalmente, apresentamos os resultados atuais que indicam que o sistema FD de imagem N pode produzir resultados altamente confiáveis. Agora vamos começar.Comece no teste de condicionamento do medo rapidamente. Um rato é colocado em uma câmara com piso de grau. O OID é apresentado como um auditor.Fila do auditor por 30 segundos. Depois disso, um choque de código elétrico é fornecido. Esse emparelhamento de uma fila de auditores e o choque no pé é dado três vezes para aumentar a associação entre a fila de auditores e o choque elétrico.Durante o teste, o comportamento de congelamento é medido como um índice de aprendizado associado e memória injusta. Em segundo lugar, após 24 horas, o camundongo é colocado na mesma câmara de condicionamento e é pontuado pelo comportamento de pulga. Para medir contextualmente o medo de controle, o camundongo é então transferido para G de formato diferente sem qualquer fila auditiva e, posteriormente, a fila auditiva é apresentada.Neste teste, o comportamento de congelamento é usado como um índice de memória de medo agudo. Durante o teste, o comportamento do mouse é registrado por meio de uma câmera conectada a um computador. O comportamento é julgado como congelamento ou não congelamento.Pelo programa de software de imagem, o programa pode calcular a porcentagem de tempo de congelamento e tráfego de distância. Aqui, por exemplo, a análise de imagem é demonstrada durante o teste. As imagens ao vivo são capturadas em um comprimento por segundo.A imagem do cria uma imagem binária de cada imagem ao vivo para cada par. Com chamas sucessivas, a quantidade de área pela qual o mouse se moveu é calculada pela imagem do programa. Quando a área está abaixo de um certo limite, o comportamento é considerado congelamento, que geralmente é definido como uma ausência completa de qualquer movimento, exceto para respiração e difícil de bater.O comportamento de congelamento que dura menos do que o limite de tempo definido não é considerado congelante. O valor limite deve ser definido previamente para que produza o melhor ajuste entre os tempos de congelamento medidos pela imagem Z e as observações humanas. Quando a quantidade de área é igual ao limite ou X três Z, o comportamento é considerado não congelante.Aqui demonstramos nosso protocolo de teste em camundongos usando este sistema de análise de vídeo. Neste protocolo, os operadores são construtivos em uma câmara quadrada de grade com grades de metal e descobertos com uma imagem de chumbo transparente. O FD pode distinguir o assunto escuro de um fundo branco em cada imagem de vídeo capturada.Mas esse processo nos permite analisar o comportamento de congelamento do sujeito que a câmara precisa ser colocada em um piso branco para analisar o comportamento de camundongos pretos, bons ou pretos diretos. O comportamento de congelamento de camundongos de alumínio também pode ser analisado pela imagem D usando grades de metal preto Sob uma regra preta, luzes de diodo emissor de luz são presas à vela acima do aparelho. A regra da grade é iluminada em 100 telhados pelas luzes LED.Um alto-falante conectado ao gerador de tom de ruído branco é montado na vela acima da tampa. Um ruído branco 55 é apresentado como uma fila auditiva. As grades são conectadas a um gerador de choque para fornecer choque elétrico de alimentos.O teste de vento de choque é definido em 0,3 milhão de pares antes do início do teste. A intensidade da corrente na grade deve ser verificada por um metal porque o teste de choque pode ser diminuído por um acúmulo de fe e urina nos camundongos, a câmara de teste é colocada em tear à prova de som para minimizar o ruído externo. Durante o teste, a apelação está localizada em um som diferente daquele em que os testes de cone e contexto são realizados.É composto por uma câmara que possui propriedades diferentes da câmara de cone. Fornecendo um contexto normal, é necessário alterar os códigos sensoriais o máximo possível para que o mouse perceba o contexto do Nobel como não relacionado à câmara de conting. Neste protocolo, o aparelho é uma câmara triangular acri com uma régua acri plana e o eletrodo transparente.Um alto-falante é montado na vela acima da liderança para apresentar em ou três filas. Essa fila é a mesma sugestão que foi fornecida aos ratos no hawing. O nível de iluminação do piso é definido para estudar a aparência.Cada câmara é um cubo com uma cabine de carga montada em vela, câmera de dispositivo para monitorar o comportamento do mouse. Antes do início de cada teste, as paredes e pisos de acrílico são limpos com uma lingueta, de modo que em água bruta super alta e as grades são limpas com etanol 70%. Para evitar um viés baseado no corte olfativo, as grades são limpas com Ethan em vez de água bruta super hype para prejudicar que as grades não deduzem sua condutividade elétrica devido aos últimos dois a quatro camundongos, Um pacote de casa em uma sala de espera com temperatura controlada para reduzir os possíveis aumentos de transporte de gaiola no comportamento e para adaptar os camundongos ao ambiente experimental.A gaiola contendo os camundongos foi transferida para uma sala de espera à prova de som pelo menos 30 minutos antes do início de cada teste. Todos os experimentos devem ser realizados durante o mesmo período de tempo para minimizar as variações de comportamento que podem ser produzidas por testes em momentos diferentes. Os camundongos de cada grupo devem ser testados em contrapeso para reduzir os efeitos potenciais do tempo experimental.Sob a ordem de teste do sujeito sobre o desempenho comportamental, a imagem D pode controlar um máximo de quatro aparelhos de teste de camundongos simultaneamente enquanto o pesquisador economiza tempo e digital para dedução nos efeitos potenciais do procedimento experimental no comportamento do camundongo. Antes do início da sessão contínua, execute o software aplicativo A FD. Selecione o menu de plugue FD referente a e FD online e defina os valores dos parâmetros definidos por passo da seguinte forma.Etapa um, o ID do projeto especifica a pasta onde deseja armazenar a data dos arquivos. Etapa dois, tipo de nome da sessão. Qualquer palavra na caixa da sessão é a data experimental e o texto da referência a file em que a hora de início e a duração do ruído branco e do choque alimentar estão escritos na caixa de referência.O texto de deferência para arquivo deve ser preparado na pasta de deferência na imagem, a pasta de antemão. Etapa três configurações de parâmetros. Insira os valores de parâmetro, como duração, tempo e critérios de congelamento, conforme mostrado no filme.Etapa quatro, ID do assunto. Insira a identificação do assunto. Etapa cinco, as configurações da câmera contrastam o brilho e o contraste da imagem capturada.Etapa seis, configurações de limite. Primeiro, para medir a distância percorrida a partir das imagens consecutivas, ajuste o valor principal do limite do programa, que é definido para segmentar as imagens em partículas pretas e fundo branco. A distância percorrida é calculada entre cada conjunto com coordenadas XY para o centro de gravidade com a partícula nas imagens consecutivas.Do segundo ao principal comportamento das imagens consecutivas, apenas assumindo o valor extra x do programa que está definido para segmentar as imagens em partículas pretas sob o fundo e, em seguida, calcular a quantidade de área de regiões não sobrepostas entre partículas de qual par de janela de entrada de imagem consecutiva a região não sobreposta é mostrada. Altere os meios expressos para o valor na quantidade de valor da região deve estar abaixo do valor do grito ING quando o mouse mostrar o comportamento. Esses valores devem ser ajustados para que os dados por fadiga de imagem correspondam ao próprio esquadrão por humano.Etapa sete, defina como campo de captura especificado o campo, qual câmara você deseja capturar depois de clicar com o botão retângulo na caixa de ferramentas para retangular ao redor do chão dela. Câmara na janela de imagem ao vivo. Em seguida, selecione o romance de câmara e clique no botão definir para finalmente clicar no botão completo.Após a definição das configurações dos parâmetros, o teste preparatório deve ser feito usando mouses de prática antes do primeiro teste da data para determinar se o sistema de análise de imagem e quais geradores de choque de ruído funcionam com os problemas mova a gaiola de pente contém os mouses de prática para a escuridão de teste de som da escuridão adjacente à espera e coloque cada mouse na câmara de condicionamento imediatamente após colocar os mouses na câmara, clique na parte inferior inicial da imagem de Z.Os ratos podem explorar totalmente a câmara por 120 segundos. Depois. Um ruído branco como uma fila auditiva é apresentado por 30 segundos e durante os últimos dois segundos do som, um choque alimentar é dado aos ratos. Este procedimento é repetido três vezes na sessão para fortalecer a associação entre a fila e o choque alimentar.As máscaras são deixadas com a câmara por 90 segundos após o último emparelhamento. Estabelecer ainda mais a associação entre o contexto da câmara e a experiência passiva. Após 480 segundos, o mouse é devolvido à gaiola inicial e a gaiola é devolvida à prateleira da sala de espera.Após cada teste, limpe as câmaras e a grade com cuidado. Em seguida, clique no próximo botão de análise e repita a sessão nos mouses de teste. Aproximadamente 24 horas após o movimento preocupante, a gaiola continua para os ratos para uma sala de tear à prova de som.O tear de espera pelo menos 30 minutos antes do início de cada teste. Imagem longa do e defina os valores dos parâmetros do software da mesma maneira que no condicionamento. No entanto, defina o tempo de duração para até 300 segundos e selecione 35 textos para arquivar para o teste contextual.35 texto para arquivo está em branco. Coloque o mouse na câmara de condicionamento e clique na parte inferior inicial. Os camundongos podem explorar completamente a câmara por 300 segundos sem nenhuma apresentação de estímulo.Após 300 segundos, colocou os ratos em sua gaiola doméstica e limpou as câmaras. Em seguida, clique na próxima análise inferior e repita o procedimento na imagem longa dos ratos de teste de D e defina os valores dos parâmetros da mesma maneira que no texto de referência contínua para arquivar para este teste e definir o tempo de duração de até 360 segundos. Este é um texto de referência a ser arquivado para este teste.Coloque cada mouse na câmara triangular e clique no botão Iniciar da imagem Z.Os mouses devem explorar a câmara nos primeiros três minutos. Nem ruído branco nem choque no pé são apresentados. Esta câmara tem propriedades diferentes que fornecem um novo contexto e relacionadas à câmara contínua.Nesta câmara normalmente deve se movimentar muito e não mostrar comportamento. No final dos primeiros três minutos, o ruído branco que é apresentado no Concho é fornecido aos ratos por três minutos. Durante a apresentação do auditor, o auditor enfileira os ratos ou exibe o comportamento escrito após 360 segundos de erupção, devolve os ratos à gaiola de casa e retorna a gaiola à prateleira da sala de espera.Após o teste, limpe as câmaras com cuidado. Em seguida, clique na parte inferior da próxima análise e repita o procedimento usando os mouses de teste. Este vídeo mostra que a passagem do congelamento analisada pela imagem do sistema parece estar mais intimamente relacionada ao pensamento medido por um observador humano.A observação foi confirmada pelos detalhes que mostraram que a porcentagem de locação medida por imagens físicas em cada teste foi altamente correlacionada ou pontuação de pensamento pelo observador humano. Além disso, este número demonstra que as diferenças entre as porcentagens de congelamento medidas por observações humanas e a imagem do sistema em sua imagem foram as menores. Esses resultados indicaram que a porcentagem de congelamento medida pela imagem do sistema foi semelhante às obtidas pela observação humana e que a precisão de medir a quantidade de razão pela imagem Z é alta. Okey.Como você gostou? Como você pode ver no teste, a análise comportamental padrão pode ser realizada facilmente. Existem algumas dicas e pontos importantes para usar a imagem do sistema, então deixe-me perguntar a ika sobre isso. Okey.Primeiro, como você se sentiu sobre o procedimento de teste da imagem do sistema? Acho que nosso procedimento de teste é muito simples e a imagem do sistema é uma ferramenta útil para medir a razão, o comportamento com precisão e rapidez. Qualquer pessoa pode facilmente usar um programa de software com um treinamento prévio Como resultado, este sistema pode ser usado para avaliar sua memória em muitos meses em um curto espaço de tempo, o que nos economizará tempo e mais tarde.Entendo. Então, há algo que devemos ter cuidado ao realizar o teste? Sim, porque o operador que afirma que é importante obter a imagem mais nítida para medir com o comportamento com precisão, e por isso você deve ajustar o comprimento da câmera e as coisas de escrita belo.Também no estudo do programa, você precisa definir os valores sexuais e os critérios de razão cuidadosamente para julgar se o comportamento pode ou não ser considerado como razão. É importante que o resultado tenha sido imediato, o programa como com o pensamento deles pela observação humana, como mostrado no presente resultado. Okey. Como você pode ver, este pode ser um artigo, forneça informações detalhadas sobre o procedimento de teste e o uso do programa de software.Esperamos que este possa ser um artigo. Promova sua compreensão do teste e contribua para a padronização do protocolo.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

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