Name: In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Aprenda a investigar a bomba de efluxo MexAB de Pseudomonas aeruginosa usando lipossomos e gradiente de prótons. Este método permite estudar a atividade de proteínas de membrana in vitro.

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Este estudo foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR projecto-2010-BLAN-1535) e por uma bolsa da região de Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Produção e purificação de proteínas <ol><li> Mexa, MexB de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transforme os plasmídeos contendo os genes Mexa e MexB em um E. coli estirpe de produção (por exemplo, C43 DE3). Placa em LB Agar suplementado com o antibiótico apropriado. Escolha uma única colônia para inocular um pré-cultivo O / N. Na manhã seguinte, inocula a pré-cultura em 1 L de LB e crescer a 37 ° C, sob agitação (240 rpm). </li><li> Uma vez que as células tenham atingido a fase exponencial (DO600 = 0,6-0,8) induzir com IPTG a 1 mM. Realizar a indução por 2-3 horas a 30 ° C, sob agitação. </li><li> Células de centrifugação (9000 xg durante 20 minutos) e ressuspender em 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Disrupt células usando uma prensa francesa (10.000 psi, 4 pass). Descarte as células intactas e corpos de inclusão por centrifugação a 9000 xg por 20 min. </li><li> Membranas de pellets 1 hora a 100.000 x g e resuspend cada pellet em 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Determinar a concentração de proteína total da membrana utilizando o ensaio colorimétrico de BCA e solubilizar as membranas de O / N com 2% de maltósido de dodecilo (DDM) em um volume final determinada de modo que o detergente: proteína é de 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 h para descartar o material não solubilizado e agregados. </li><li> Incubar o sobrenadante, durante 2 horas a 4 ° C com uma resina de níquel (mexa purificação) ou uma resina de cobalto (MexB purificação) equilibrada com bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Despeje a resina em uma coluna vazia. Recolher o fluir. </li><li> Lava-se a resina com 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, em seguida, com 25 ml de bis-Tris 10 mM, pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Eluir o protein com 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Concentra-se a proteína com um dispositivo de ultrafiltração até 3 ml e carga sobre uma coluna de dessalinização, equilibrada com um tampão livre de imidazol. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga proteínas solubilizadas (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Em seguida, concentra-se a proteína novamente até 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bacteriorodopsina de Halobacter Salinarium <ol><li> Cultivar células Salinarium Halobacter sob iluminação a 37 ° C durante 10 dias num meio de crescimento líquido contendo NaCl 4 M, MgSO4 a 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levedura 5 g / L, e peptona 5 g / L. </li><li> Disrupt células por diálise contra água deionizada. </li><li> Purifica-se a membrana de púrpura de 30-40% (w / v) gradiente de sacarose (100.000 xg durante 17 horas). </li><li> Solubiliza-se a suspensão de membrana com 2% octylglucOside durante 24 horas a 37 ° C (volume para a solubilização, a fim de voltar a suspender a membrana a um detergente 2:1 (w / w): proteína). Estimar a concentração de BR solubilizado usando ε (570 nm) = 54.000 M-1 cm-1. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga a BR solubilizado (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Nota: As membranas nativas são naturalmente enriquecida em BR por isso não purificação adicional é necessária. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de proteolipossomas <ol><li> A formação de lipossomas: Coloque 400 ul de DOPC dissolvido em clorofórmio (25 mg / ml) em um copo de vidro e adicionar 1,5 mg de colesterol armazenado como um pó. Seca-se-lhes imediatamente antes da manipulação sob uma corrente de azoto ou de vácuo durante pelo menos uma hora numa proveta de vidro. O DOPC: proporção molar de colesterol é de 3,3:1. <ol><li> Depois de terem secado, hidratar os lípidos com 1 ml de HEPES 25 mM, pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM de piranina. A suspensão deve aparecer turvação nesta fase. </li><li> Aquece-se a solução durante 10 min a 37 ° C. Sonicar durante 10 min a 40 W com 30 seg de pulso, 30 sec ciclos de pausa à TA. A suspensão deve aparecer clara nesta fase. </li><li> Para obter uma população de lipossomas monodispersas, realizar dois ciclos de extrusão e para cada ciclo, passar a suspensão de lipossomas através do filtro, pelo menos, 11x. Para o primeiro ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 200 nm e para o segundo ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 100 nm. Medições de dispersão de luz dinâmica pode ser realizada nesta etapa para verificar a homogeneidade da suspensão. </li></ol></li><li> Incorporação de proteínas Princípio: proteínas de membrana pode ser reconstituída em lipossomas, graças ao efeito solubilizante de detergentes. Lipossomas detergente solubilizou-se a incubação com a proteína de membrana solubilizada em detergente e a formação do proteoliposomes é desencadeada por uma rápida eliminação do detergente com grânulos de poliestireno 9. <ol><li> Adicionar 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) e incubar O / N a 4 ° C (a temperatura de solubilização pode ser adaptado para a proteína a ser estudado). </li><li> Adicionar a proteína solubilizada em detergente (BR, MexB e mexa) para os lipossomas dissolvidos, e incubar 15 min a 4 ° C. Adicionar as proteínas para a suspensão de lipossomas solubilizado nas seguintes proporções (w / w): lípidos / MexB = 20, MexB / mexa = 2,5, e lípidos / BR = 30. </li><li> Adicionar pérolas de poliestireno em um 30:1 grânulos: proporção de detergente (w / w, considerando o peso total do detergente, inclusive detergente adicionado com as proteínas purificadas) e incubar 5 h, no escuro (por causa da BR) à TA sob suave agitação. Antes deste processo, activar as BioBeads com metanol e etanol e incubação extensivamente lava-se com água. </li><li> Purifica-se a proteína proteolipossomos e substratos livres utilizando um PD-10coluna de dessalinização, equilibrada com HEPES 25 mM, pH 7, K 2 SO 4 100 mM e MgCl 2 a 2 mM. </li><li> Armazenar os proteolipossomas a 18 ° C no escuro até 2-3 semanas. </li></ol></li><li> Avaliação da eficácia de reconstituição em gradiente de sacarose. Para verificar que tanto o MexB ea BR foram reconstituídos em lipossomos, purificar a suspensão proteolipossomos em um gradiente de sacarose descontínua. <ol><li> Suavemente resolver os proteolipossomas em um gradiente de cinco camadas de sacarose (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). </li><li> Ultracentrifuge para 17 horas a 100.000 xg (com aceleração mínima e taxas de desaceleração). </li><li> Recolher cuidadosamente as várias fracções do gradiente (especialmente as interfaces entre cada camada de sacarose), e analisadas em SDS-PAGE (10%) por meio da coloração com Coomassie ou transferência de Western. Proteínas agregadas são encontrados no fundo do tubo, enquanto que, as proteínas de detergente solubilizado nonincorporated são encontrados na parte superior dao tubo. Proteolipossomos e lipossomas são encontrados nas interfaces de sacarose que correspondem à sua densidade intrínseca. Lipossomas vazios são recuperados mais acima no gradiente do que os proteolipossomos. </li></ol></li></ol> 3. A medição de fluorescência <ol><li> Efectuar as medições de fluorescência a 25,0 ° C por meio de um espectrofluorómetro permitindo medições de duplo comprimento de onda (luz de Xe, 150 W). Períodos de iluminação alternativa (para ativar a BR com comprimentos de onda de excitação / emissão de 550 nm / 550 nm) e medições de fluorescência com comprimentos de onda de excitação / emissão de 455 nm / 509 nm por 2 segundos para medir a fluorescência piranina. Defina as larguras de banda de excitação e emissão de 5 nm. Efectuar as medições na presença de 50 nM de valinomicina para prevenir a formação de um potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: Na verdade, porque as bombas de prótons BR, há mais cargas positivas no interior do lipossoma do que fora. Esta cargagradiente podem ser descartados utilizando valinomicina, que é um K + ionóforo selectiva. Uma vez adicionados à valinomicina lipossomas suspensão, tal como uma molécula hidrófoba, se inserir na membrana do lipossoma, transportar passivamente K +, e, portanto, a dissipar o potencial de membrana ΔΨ. </li></ol>

<ol><li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us%3F+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li>
<li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li>
<li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li>
<li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li>
<li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).</li>
<li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li>
<li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li>
<li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li>
<li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes%3A+caveats+and+keys%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li>
<li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis%2C+edited+by+iConcept+Press%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

Não há nada a divulgar.

Descreve-se um processo de reconstituição projetado para ensaio transporte de proteínas de membrana. Uma vez estabelecido, o processo de reconstituição da proteína leva à medições que são muito reprodutíveis. No entanto, as condições exactas para reconstituir a proteína irá variar a partir de uma proteína para outra. Muito cuidado deve ser tomado na otimização dos seguintes parâmetros: i) qualidade da purificação (pureza e ausência de material agregado); ii) a eficiência da etapa de detergente de solubilização (quando possível, de baixo detergente CMC devem ser preferidos porque são mais fáceis de obter livrar), iii) dessorção do detergente (que é por exemplo possível combinar o uso de esferas de poliestireno com um passo de diálise, mas este facto pode afectar a taxa de dessorção, um parâmetro crítico para a actividade posterior da proteína, ver ref [ 9]), iv) a reconstituição de lípidos (a natureza química do lípido, o lípido e o rácio de proteínas, a presença de amphiph adicionaliles são parâmetros críticos que devem ser variadas e otimizado). Na temperatura de adição e tempo de incubação afeta todas estas questões. O controlo de qualidade é portanto primordial em cada passo do procedimento de reconstituição. Deste ponto de vista, de dispersão de luz é uma técnica muito conveniente porque é rápida, não destrutiva, e requer apenas 20 ul de amostra a uma concentração na gama micromolar. Uma vez que os proteolipossomas são formados, gradiente de sucrose é também de grande ajuda porque abre o caminho para uma verificação sistemática de reconstituição: qualitativa (a proteína é, de facto incorporada na membrana do lipossoma), bem como quantitativo (quantos proteína em um lipossoma). Este último seria abordada por medir com precisão a proteína e concentrações de lipídios. Nosso ensaio não depende da titulação do próprio substrato e isso evita considerações inquietos a respeito de possível difusão passiva artifactual de<html> molécula devido a partição hidrofóbica nas membranas. O ensaio explora as propriedades de piranina como sonda confiável e quantitativa de mudanças de monitoramento de pH. Nossos resultados estão de acordo com os resultados obtidos com outro procedimento onde a formação de gradiente de prótons foi realizada utilizando valinomicina 10, mas permite um gradiente mais robusta e reproduzível 11. Além disso, o gradiente de protões pode ser ajustada precisamente, simplesmente pela variação da concentração do tampão (para mais detalhes ver 12 Verchere et al.). No processo de uma medição de controlo é efectuado em primeiro lugar, na ausência de substrato (o que dá acesso à actividade passiva da proteína). A actividade efectiva transportador de proteína de membrana é então medida após o substrato ter sido adicionado na mesma cuvette. Este é verdadeiramente um activo porque o experimento pode ser considerado como um verdadeiro, resultado induzido pelo substrato não ambíguo,. ent &quot;&gt; O protocolo pode ser adaptado para alto, médio rendimento (por exemplo, medições de 96-poços) automatização pois iluminar a amostra provoca a automatização e paralelização reacção. consistiria na preparação de um lote grande de proteolipossoma, e na distribuição de alíquotas em 96 poços de placa. substratos (e também possíveis inibidores) seria então adicionado e após a incubação no escuro durante 45 min, a placa de ser sujeito a ciclos de medição de fluorescência de iluminação / piranina num leitor de microplacas. Para obter informações adicionais sobre o protocolo, os leitores são convidados a ler Verchere et al. 12,13

Proteínas de membrana integrais representar até 30% dos genes codificados em genomas eucarióticos. Eles compartilham um papel central, como a manutenção de portão (receptores), transporte de nutrientes, íons ou compostos nocivos (transportadores) ou a manutenção da permeabilidade da membrana através de camadas duplas (canais) entre todas as células vivas 1. As bombas de efluxo tem um papel central na resistência contra a terapia antibiótica 2. Em bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, que é protegida por uma membrana externa, transportadores de efluxo são organizadas como sistemas de tripartidos onde MexB, a bomba de efluxo localizadas na membrana interna, trabalha em conjunto com mexa, uma proteína periplasmática, e, uma OprM canal de membrana externa. A proteína de membrana interna citoplasmática funciona como uma bomba dependente de energia com uma ampla especificidade de substrato. A proteína da membrana externa actua como uma porina enquanto que o terceiro é localizado no espaço periplasmático e é pensado para estabilizar o complexo inteiro <sup&gt; 3. A seguir, vamos nos concentrar no projeto de um ensaio funcional para a montagem Mexa MexB. A informação estrutural acumulou ao longo dos últimos cinco anos, graças à determinação de raios-X do AcrB proteína homóloga de Escherichia coli 4-7. Embora seja claramente importante par dessa informação com dados dinâmicos e cinéticos, a concepção de um ensaio funcional para este transportador é um verdadeiro desafio 8. Com efeito, as proteínas da membrana deve ser mantida em um ambiente membranoso e um compartimento fechado deve ser mantida durante um transporte vectorial de substrato a ser alcançado. Reconstituição de proteínas de membrana em proteolipossomos foi amplamente apresentados e analisados ​​(ver Rigaud e Levy 9). Tais protocolos de permitir a monitorização da actividade de proteínas de membrana, por exemplo, seguindo os substratos através da membrana do lipossoma. Neste caso, surgem limitações do umDisponibilidade de substratos tituláveis ​​(fluorescente, radioactivo, etc.) e do facto de que, muitas vezes, estes substratos são hidrofóbicos e têm uma tendência para atravessar as membranas, independentemente da presença do transportador. Como alternativa, pode-se seguir as variações espectroscópicos de um corante relatando sensível a alterações químicas que ocorrem como consequência do transporte. Como afirmado acima, os prótons energizar o transporte via MexB. Assim, uma opção relevante é monitorar as variações espectroscópicas de um corante relato sensível ao pH para acompanhar variações de pH, devido ao transporte de substrato-driven próton. A escolha de um corante fluorescente evita quaisquer efeitos artefatuais devido à natureza hidrofóbica do substrato. Uma dificuldade adicional é a geração de um gradiente de protões. Vários protocolos podem ser encontrados na literatura. Entre eles, o uso da técnica de valinomicina é generalizado, mas mostrámos que é entediante para executar 10-11. Além disso, énão reprodutível e não é reversível. Nós têm recorrido ao uso de bacteriorodopsina (BR), uma bomba de protões activado pela luz de Halobacter Salinarium, um obrigatório archaeon halofílica Gram-negativo aeróbico marinha. Esta proteína é coreconstituted em lipossomas com MexB e, após a iluminação, BR bombas de protões no interior dos lipossomas e, portanto, cria o ΔpH (ácida para dentro) necessária para a proteína de transporte do substrato 12-13.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Piranina (8- ácido hidroxipireno-1,3,6-trissulfônico)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecil-&beta;-D-maltopiranosídeo)</td>Kit extrusor <td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>(extrusora, seringas estanques a gás Hamilton)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorventes</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Cromatografia coluna vazia</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de espalhamento de luz dinâmico</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro investigação do mexab efluxo bomba de pseudomonas aeruginosa

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Há uma necessidade científica emergente para ferramentas confiáveis ​​para monitorar transporte de proteínas de membrana. Apresenta-se um método que conduz à reconstituição das bombas de efluxo na bactéria gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, em um ambiente biomimética que permite uma investigação precisas da sua actividade de transporte. Três pré-requisitos são cumpridos: compartimentação em um ambiente lipídico, o uso de um índice relevante para o transporte ea geração de um gradiente de prótons. O transportador de proteína de membrana é reconstituído em lipossomas, juntamente com bacteriorodopsina, uma bomba de protões activado pela luz que gera um gradiente de protões, que é robusta, assim como reversível e ajustável. A actividade da proteína é deduzida a partir das variações de pH que ocorrem no interior do lipossoma, usando pyranin, uma sonda fluorescente dependente de pH. Descreve-se um procedimento passo-a-passo em que a purificação da proteína da membrana, a formação de lipossomas, a reconstituição da proteína, e um transportenálise são abordados. Apesar de terem sido concebidos especificamente para um transportador de RND, os métodos descritos poderiam ser adaptados para utilização com qualquer outro transportador de proteína de membrana energizados por um gradiente de protões.

O ensaio consiste de monitorização de piranina fluorescência como uma função do tempo, enquanto um gradiente de protões é gerado. Para esse fim, as amostras são submetidas a iluminação alternativamente (daí bombear protões pela BR é desencadeada) e, em seguida, para medições de fluorescência utilizando excitação e emissão de comprimentos de onda de piranina (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm). A Figura 1 mostra um controlo representativo obtidos com o ensaio, na ausência de mexa / MexB, verificando que o gradiente de protão gerado pela BR é reversível. Depois de um ciclo de acidificação, proteolipossomas são mantidos no escuro durante 45 minutos a fim de parar a BR para bombear protões (protões difundir lentamente e de forma passiva através de bicamadas lipídicas após o seu gradiente de concentração). Após este tempo de recuperação, a activação de BR é possível, simplesmente, iluminando a mesma suspensão novamente. Figura 2corresponde a uma medição de transporte real. Um controle negativo com lipossomas livres de proteínas mostra que, como esperado, o pH é constante sobre iluminação (Figuras 2A e 2B, os círculos de laranja). No entanto, proteolipossomas contendo BR nas suas membranas não bomba de protões, assim, o pH dentro dos lipossomas diminui e um gradiente estável é construído (Figuras 2A e 2B, quadrados roxo). Triângulos cinza e diamantes vermelhos (Figura 2A) representam pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB, na presença ou na ausência de Hoechst 33342, respectivamente. Observamos uma atividade independente do substrato onde o gradiente de prótons é apenas parcialmente dissipada por MexB contra-transporte. Atribuímos essa observação a uma atividade basal de MexB. A fim de testar o efeito de mexa na actividade de MexB, mexa foi adicionado para a reconstituição, o primeiro na ausência de qualquer tipo de substrato ( <strong&gt; Figura 2B, diamantes azuis). Mais uma vez, o gradiente de protão gerado pela BR é apenas parcialmente dissipada. A medição de transporte real é realizado no mesmo exemplo. Previamente, o gradiente de protões deve ser reinicializado e o substrato tem de ser adicionado à suspensão a fim de atingir o seu sítio de ligação na proteína. Para esse efeito, a suspensão foi incubada no escuro, na presença do substrato durante 45 minutos. Após a iluminação posterior, pode-se ver que o gradiente de prótons gerado pela BR está agora totalmente dissipada por MexAB (Figura 2B, triângulos verdes), como conseqüência do transporte de substrato pela bomba. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figura 1 Reversibilidade da gradiente de prótons construído pela iluminação BR: piranina fluorescência de proteolipossomos BR medidos em função do tempo. De 0-15 min, BR bombas de prótons como resultado da ativação de luz. De 15-60 min, proteolipossomas são incubados no escuro, durante este tempo, protões passivamente mova para fora dos lipossomas, até o pH intravesicular e pH extravesicular são iguais. De 60-75 min, BR ainda é funcional e bombas de prótons sobre iluminação. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figura 2 Transporte ensaio: piranina fluorescência, convertidos para os correspondentes variações de pH, em função do tempo A) pH dentro dos lipossomas de controlo (círculos laranja); pH dentro de proteolipossomas contendo BR na membrana (quadrados roxo), pH dentro. de proteolipossomas contendo BR, e MexB na membrana sem Hoechst 33342 (d vermelhoiamonds); pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB na membrana com Hoechst 33342 (triângulos cinza) B) pH dentro de lipossomas de controle (círculos laranja);. pH dentro de proteolipossomos contendo BR na membrana (quadrados roxos); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana sem Hoechst 33342 (diamantes azuis); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana com Hoechst 33342 (triângulos verdes).

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a bomba FLX me AB de Pseudomonas aosa usando um teste funcional baseado na reconstituição de proteínas de membrana. Em lipossomas. Isso é feito primeiro expressando e purificando as proteínas da membrana, B misturado e Rodin bacteriano nas proteínas da membrana bacteriana são então extraídos das membranas e purificados puros por cromatografia de afinidade.O segundo passo é preparar lipossomas combinando um filme lipídico seco com tampão contendo purina, o que leva à formação de vesículas multilam. Após a sonicação, os lipossomas são extrudados para obter uma população homogênea de lipossomas. Em seguida, proteínas de membrana detergente e, em seguida, grânulos de poliestireno são adicionados à solução de lipossomas.As caudas hidrofóbicas do detergente são absorvidas pelas esferas de poliestireno, permitindo que as proteínas da membrana afrouxem a correia de detergente e se insiram na membrana do lipossomo. A última etapa é a remoção da purina não encapsulada Ao executar os lipossomas de protea em uma coluna de dessalinização, os lipossomas grandes atingem a parte inferior da coluna muito mais rápido do que a purina não encapsulada, que permanece amarrada no topo da coluna. Em última análise, os lipossomas protais são coletados e sua fluorescência é usada para investigar a atividade do Mex AB através da mudança no pH criada após a iluminação da opsina bacteriana.As bombas Rodin Effects são transportadores que promovem a resistência aos antibióticos devido ao reconhecimento e transporte de uma ampla gama de substratos de todas as famílias de antibióticos, há uma necessidade urgente de novos e confiáveis testes de atividade in vitro para efeitos de proteínas de membrana. Transportadores. De fato, esses ensaios ofereceriam novos insights sobre os mecanismos moleculares de transporte e ajudariam na triagem farmacológica de novos candidatos a inibidores potenciais. Nós nos concentramos no mix a mix, B-O-P-R-M, eFlex Perm da Pseudomona gin.Apresentamos conselhos técnicos e métodos necessários para satisfazer três requisitos para projetar um teste funcional in vitro eficiente para misturar uma bomba B ffl, incluindo a constituição da proteína em uma membrana, usar compartimento fechado necessário para o transporte vetorial do substrato, uma boa mostra de chaminés e matriz que evita o efeito artifactual devido à natureza adro do substrato e a geração de um gradiente proteico necessário para misturar AB para função. A força do nosso ensaio é a maneira como geramos um gradiente T reprodutível e reversível para criar um delta de pH que chamamos de bactérias instituídas ou VR com mistura AB em uma membrana lipossômica. BR é uma proteína de membrana purificada da membrana roxa de aob salinium allic Marin gram-negativo, aans aeróbicos obrigatórios.Após a iluminação, esta proteína bombeia proteínas ativamente. Portanto, se o BR for constituído junto com a proteína do lipossomo, a eliminação do lipossomo criará um delta de pH devido ao br, que bombeia proteínas para dentro dos lipossomas. A preparação de material proteico puro e estável é de suma importância.O procedimento de purificação da proteína de membrana faz com que B tenha sido bem descrito em uma publicação anterior do filme J ovy, bem como no protocolo de texto que acompanha este vídeo, onde uma descrição da purificação de uma mistura de proteínas de membrana A também pode ser encontrada Para preparar Rodin bacteriano de Halabach Salinium, cultive células halabach salinium sob iluminação a 37 graus Celsius por 10 dias. Em um meio de crescimento líquido, rompa as células dialisando contra a água deionizada. Purifique a membrana roxa em um gradiente de sacarose de 30 a 40%.Em seguida, solubilize a suspensão de membrana com glucocida octal a 2%. Foram 24 horas a 37 graus Celsius. Proteja o tubo da luz envolvendo-o em papel alumínio.Estimar a concentração de bactérias solubilizadas ou de dosina utilizando o coeficiente de extinção indicado no protocolo de texto imediatamente antes da reconstituição. Ultracentrifuge a opsina bacteriana solubilize para se livrar dos lipídios e un solubilize proteínas. Para preparar os lipossomas em um alto-falante de vidro, pesar 1,5 miligramas de colesterol armazenado em pó e adicionar 400 microlitros de diol fosfatidilcolina ou DOPC dissolvido em clorofórmio em um copo de vidro, seque-os sob vácuo por pelo menos uma hora em um copo de vidro antes da manipulação.A proporção molar de DOPC para colesterol resultante é de 3,3 para um. Depois de secarem, hidrate os lipídios com um mililitro de tampão hebes, a suspensão deve parecer turida. Nesta fase, aqueça a solução por 10 minutos a 37 graus Celsius sonicate por 10 minutos a 40 watts com alternância de 32º pulso, 32º ciclos de pausa à temperatura ambiente, a suspensão deve parecer clara.Nesta fase, O aspecto mais crítico do procedimento é a obtenção de uma suspensão apertada e monodispersa de lipossomas. Para isso, tomamos muito cuidado ao configurar o dispositivo de anel extra para que não ocorra vazamento. Além disso, limpamos o dispositivo meticulosamente após cada uso.Para obter uma população monodispersa de lipossomas, execute dois ciclos de extrusão para cada ciclo. Passe a suspensão de lipossomas pelo filtro pelo menos 11 vezes. Para o primeiro ciclo, use um tamanho de poro de membrana de 200 nanômetros e, para o segundo ciclo, um tamanho de poro de membrana de 100 nanômetros.Neste ponto, medições dinâmicas de espalhamento de luz podem ser realizadas para verificar a homogeneidade da suspensão. Aqui é mostrado um resultado típico desta etapa. As proteínas de membrana podem ser reconstituídas em lipossomas devido ao efeito solubilizante dos detergentes detergentes.Os lipossomas solubilizados são incubados com a proteína de membrana solubilizada em detergente e a formação da protea. Os lipossomas são desencadeados pela eliminação rápida do detergente com esferas de poliestireno. Para incorporar proteínas, adicione 28 miligramas de tritton X 100 e incube durante a noite a quatro graus Celsius.Adicione a proteína solubilizada em detergente, incluindo as bactérias opsina Mex B e Mex A aos lipossomas solubilizados e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius. Adicione esferas de poliestireno previamente ativadas. Adicione uma proporção de 30 para uma abelha para detergente e incube por cinco horas no escuro em temperatura ambiente.Sob agitação suave, purificar a proteína dos lipossomas de prótia e os substratos livres usando uma coluna de dessalinização PD 10 equilibrada com o tampão Hess. Para verificar se tanto o Mex B como a bactéria opsina foram reconstituídos em lipossomas, purificar a suspensão de lipossomas protea num gradiente descontínuo de sacarose. Assente suavemente o proteossomo em um gradiente de cinco camadas de sacarose.Em seguida, ultracentrifugue por 17 horas a cem mil G após a ultra ificação, proteínas agregadas são encontradas no fundo do tubo, enquanto proteínas solubilizantes de detergente não incorporadas são encontradas no topo do tubo. Protea, lipossomas e lipossomas são encontrados em interfaces de sacarose que correspondem à sua densidade intrínseca. Os lipossomas vazios são recuperados mais acima no gradiente do que os lipossomas prot.Coletar cuidadosamente as várias frações de gradiente antes de analisá-las com sulfato de sódio dilo. Eletroforese em gel de poliacrilamida usando coloração de kumasi ou western blotting. Realize medições de fluorescência a 25 graus Celsius usando um fluorímetro espectral, permitindo medições de comprimento de onda duplo.Alterne os períodos de iluminação para ativar a rodina bacteriana caracterizada por comprimentos de onda de excitação e emissão de 550 nanômetros com medições de fluorescência de purina, que são caracterizadas por um comprimento de onda de excitação de 455 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 509 nanômetros por dois segundos. Defina as larguras de banda de excitação e emissão para cinco nanômetros. Realizar as medições na presença de 50 nanomolares lineares para evitar a formação de um potencial de membrana inversa.O suspiro delta mostrado aqui é um controle representativo obtido com o ensaio na ausência de Mex a, Mex B, verificando que o gradiente de prótons gerado pela opsina bacteriana é reversível. Após um ciclo de acidificação, os lipossomas de Oreo são mantidos no escuro por 45 minutos para que a bactéria opsina pare de bombear prótons. Após esse tempo de recuperação, a ativação da opsina bacteriana é possível simplesmente acendendo a mesma suspensão.Novamente, uma medição de transporte real mostra que um controle negativo com lipossomas livres de proteínas tem um pH constante após a iluminação, conforme o esperado. No entanto, os lipossomas de protea contendo bactérias ou opsina em suas membranas bombeiam prótons. Assim, o pH dentro dos lipossomas diminui e um gradiente estável é construído.Os triângulos cinzas representam o pH dentro dos lipossomas protea contendo bactérias ou opsina e mex B na presença de fraude. 3, 3, 3, 4, 2 corante. Enquanto os diamantes vermelhos representam o pH na ausência do corante, observa-se uma atividade independente do substrato A onde um gradiente de prótons é apenas parcialmente dissipado pelo contra-transporte de Mex B, que é atribuído a uma atividade basal de Mex B.In para testar o efeito de mex A na atividade de Mex b Mex A foi adicionado à reconstituição primeiro.Na ausência de qualquer substrato, novamente, o gradiente de prótons gerado pela opsina bacteriana é apenas parcialmente dissipado. A medição real do transporte é realizada na mesma amostra e o próton é inicializado com rédea, e o substrato é adicionado na suspensão para atingir seu local de ligação na proteína. Após a iluminação subsequente, pode-se ver que o gradiente de prótons gerado pela opsina bacteriana está agora totalmente dissipado pela Mex AB como consequência do transporte de substrato pela bomba, É importante ter em mente que a condição exata necessária para adaptar este protocolo a outra proteína pode variar do que foi descrito aqui.Deve-se tomar cuidado para otimizar os seguintes parâmetros, qualidade da purificação, eficiência do detergente, etapa de solubilização da dessorção do detergente, composição lipídica e proporção lipídio/proteína. Além disso, os períodos de temperatura e incubação tendem a afetar todos esses parâmetros. Nosso protocolo abre caminho para uma melhor compreensão da atividade da mistura de bombas r e d flix B. No entanto, se tiver sido vendido especificamente para transportador r e d, este método pode ser adaptado a qualquer transportador de spam FFL ativado por PMF.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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