Name: Transplante subretinal de células precursoras do fotoreceptor purificado MACS na retina do rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda o transplante subretinal de células precursoras de fotoreceptores purificadas por MACS na retina de ratos adultos. Este método demonstra a integração celular e potencial para restauração da visão em pesquisas de regeneração retinal.

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Gostamos de agradecer a Anand Swaroop por fornecer ratos NRL-GFP, Jochen Haas para suporte técnico, e Sindy Böhme e Emely Lessmann pela criação animal.	
	Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro de Terapias Regenerativas Dresden, o Programa de Concessão de Sementes crtd, o SFB 655, e o ProRetina e.V. fundação, o Programa de Pós-Graduação DIGS-BB Dresden, e a Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Uso ético e cuidado com a declaração dos animais:
Todos os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com as leis da União Europeia e da Alemanha (Tierschutzgesetz) e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal do TU Dresden e do Landesdirektion Dresden (número de aprovação: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar a dissociação celular e a classificação celular
<ol><li>Rotule três tubos de reação de 15 ml com: Lavagem (W), Fração positiva (+) e fração negativa (-).</li>
</ol>2. Dissociação da retina
<ol><li>Decapitar os filhotes PN 4 usando uma tesoura.</li>
	<li>Enxágüe a cabeça dos filhotes em pouco tempo em 70% de etanol seguido de lavagem na PBS.</li>
	<li>Transfira a cabeça para o HBSS frio e enuclear o olho (repita este passo para todas as cabeças). Para enuclear, abra as pálpebras e fixe o olho com fórceps curvos na região do nervo óptico. Em seguida, puxe o olho cuidadosamente para fora da órbita.</li>
	<li>Depois de enuclear todos os olhos, isole a retina: introduza uma tesoura fechada no nervo óptico e abra as lâminas. Peal o RPE/chorid para fora. Remova as lentes e vasos sanguíneos usando fórceps curvos.</li>
	<li>Transfira as retinas isoladas para um tubo de reação de 1,5 ml contendo a solução papain (fornecida pelo kit de dissociação papain).</li>
	<li>Incubar as retinas na solução papan por 30-60 min em um banho de água ou shaker (400 rpm) a 37 °C.<ol>
<li>Enquanto as retinas incubam na solução papain, pipeta 1 ml de solução ovomucóide para um tubo de reação de 15 ml (rótulo "1").</li>
			<li>Adicionar 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solução ovomucoid (fornecida pelo kit) + 520 μl de EBSS a um tubo de reação de 15 ml (rótulo "2").</li>
		</ol>
</li>
	<li>Após a incubação do papain, transfira a solução de papain contendo as retinas parcialmente digeridas para o tubo de reação "2".</li>
	<li>Usando uma pipeta polida de fogo, realize a dissociação mecânica (10x para cima e para baixo).</li>
	<li>Pipeta a suspensão de célula única ao tubo de reação "1". Tente gerar 2 camadas colocando suavemente a suspensão da célula em cima da solução ovomucoid.</li>
	<li>Centrífuga por 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).</li>
	<li>Descarte o supernatante e resuspenque as células em 500 μl de tampão MACS.</li>
</ol>3. Classificação celular usando classificação celular associada magnética (MACS)
<ol><li>Adicione o anticorpo anti-CD73 de rato X μl aos 500 μl, a fim de alcançar uma concentração final de 10 μg/ml.</li>
	<li>Incubar 5 minutos no gelo.</li>
	<li>Encha o tubo de reação de 15 ml a 10 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 minutos a uma velocidade de 300 x g.</li>
	<li>Remova o supernatante.</li>
	<li>Resuspenque a pelota em 480 μl de tampão MACS e adicione 120 μl de microesferas IgG anti-rato de cabra.</li>
	<li>Incubar 15 min no gelo; não agitar, agitar ou misturá-lo.</li>
	<li>Encha o tubo de reação de 15 ml a 5 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Como o tubo de reação é centrifuado:<ol>
<li>Ajuste uma coluna LS no suporte magnético.</li>
			<li>Coloque o filtro de pré-configuração em cima da coluna LS.</li>
			<li>Hidrate o filtro de pré-esparação e a coluna LS com tampão MACS de 3 ml e colete o tampão MACS no tubo de lavagem (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Remova o supernatante.</li>
	<li>Resuspenda a pelota em 500 μl tampão MACS.</li>
	<li>Carregue a suspensão celular de 500 μl no filtro e adicione 1 ml de tampão MACS ao filtro e colete a fração negativa no tubo de reação de fração negativa (-).</li>
	<li>Em seguida, adicione 3 x 3 ml de tampão MACS à coluna para lavar as células que não estão ligadas à coluna</li>
	<li>Uma vez que estes 9 ml estejam através da Coluna LS, remova a coluna do suporte magnético e instale-a em cima do tubo de reação de fração positiva (+).</li>
	<li>Carregue rapidamente 5 ml de tampão MACS na coluna LS e coloque o êmbolo na Coluna LS e pressione-o até que todo o buffer esteja através da coluna.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de reação contendo a fração positiva por 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Remova o supernatante, resuspenda em 500 μl de tampão MACS e mantenha a 4 °C.</li>
	<li>Conte a quantidade total de células usando um dispositivo comum de contagem de células.</li>
	<li>Prepare uma suspensão celular a partir da fração classificada positiva contendo 2 x 105 células/μl no buffer MACS e mantenha a 4 °C</li>
</ol>4. Transplante de células precursoras do fotoreceptor classificados pelo MAC na Retina do Rato
<ol><li>Certifique-se de ter todas as seguintes soluções prontas: 1 ml de PBS ou HBSS estéreis, 10 μl DNAse I, 1-2 ml estéril desionizado H2O, alíquotas das frações de suspensão celular a 4 °C.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo adulto (ou seja, 2-4 meses de idade) com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), cetamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Em seguida, faça uma injeção subcutânea de Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) para alívio da dor.</li>
	<li>Dilatar pupilas com queda de Fenilefrino 2,5%-Tropicamid 0,5%.</li>
	<li>Fixar o mouse no suporte da cabeça do mouse e colocar sob microscópio estéreo.</li>
	<li>Aplique uma gota de gel vísico para evitar a secagem do olho.</li>
	<li>Faça um pequeno buraco na borda entre esclera e córnea (respectivamente ora serrata) usando uma agulha estéril de 30 G 1/2.</li>
	<li>Corte uma lâmina de cobertura comum em peças pequenas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando uma caneta de diamante, coloque uma dessas peças em cima da córnea, permitindo visualização direta da retina.</li>
	<li>Lave a seringa microliter presterilizada várias vezes com água deionizada.</li>
	<li>Carregue a seringa microliter com 1 μl de suspensão celular, direcione a agulha tangencialmente através da conjuntiva e esclera e coloque sob controle visual na metade nasal da retina.</li>
	<li>Faça um furo suavemente na retina até chegar ao espaço subretinal, injete a suspensão da célula no espaço subretinal.</li>
	<li>Observe o descolamento bolhoso da retina, que deve ser uniforme, cobrindo aproximadamente 1/4 do espaço da retina sem qualquer sangramento.</li>
	<li>Retire a seringa suavemente, o orifício da retina sela automaticamente.</li>
	<li>Lave a seringa microlitera várias vezes com água deionizada.</li>
	<li>Solte o mouse do suporte da cabeça.</li>
	<li>Acorde o rato injetando cloridrato de atipamozole para reversão do efeito de cloridrato de medetomidina.</li>
	<li>Coloque o mouse para acordar na câmara escura quente (aproximadamente 25 °C).</li>
	<li>Nos próximos 2 dias após o transplante, a Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) deve ser administrada por injeção subcutânea pela manhã e à tarde para alívio da dor.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O transplante subretinal de células precursoras fotorreceptoras representa uma ferramenta confiável para alcançar a integração dessas células sensíveis à luz em retinas hospedeiras em números significativos1,2. Isso pode permitir o estabelecimento de uma terapia celular para o tratamento de doenças degenerativas da retina no futuro6. A população de doadores de células, atualmente isoladas das retinas PN 4, é uma mistura de diferentes tipos de células, das quais apenas as células precursoras do fotoreceptor se integram a...

A visão é um dos principais sentidos dos humanos. O comprometimento desse sentido e da cegueira são uma das principais razões para a incapacidade nos países industrializados. A causa predominante para comprometimento da visão ou cegueira é a degeneração da retina, caracterizada pela perda celular fotorreceptora, pois pode ser observada na degeneração macular, retinite pigmentosa, distrofia cone-rod e outras condições. Até o momento, uma terapia eficaz para restaurar a visão perdida não está disponível. Em 2006 e 2008, dois laboratórios diferentes relataram, independentes um do outro, um transplante bem sucedido de células precursoras de fotorreceptor de varas em retinas de camundongos adultos do tipo selvagem1,2. Assim, decorrente da possibilidade de transplante de células precursoras fotorreceptores também em uma retina degenerada, para substituir fotorreceptores degenerados e restaurar a visão. De fato, foi demonstrado recentemente que tais células precursoras fotorreceptoras transplantadas provocam critérios morfológicos de fotorreceptores maduros do tipo selvagem, como segmentos externos devidamente desenvolvidos3, terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas e um corpo de células redondas localizados na camada nuclear externa2-4,bem como a capacidade de integrar-se funcionalmente ao circuito neural hospedeiro5-7. Um dos principais princípios dessa estratégia é o uso do pós-natal dia 4 (PN 4, PN0 é definido como dia de nascimento) retinas de camundongos jovens, resultando em uma mistura de diferentes tipos de células para transplante. No pano de fundo de uma futura aplicação terapêutica, essa mistura deve ser purificada para células precursoras fotorreceptoras. CD73 foi descrito como o primeiro marcador de superfície celular específico para fotorreceptores jovens na retina8-10. Aqui, demonstramos um método de purificação celular precursora fotoreceptor baseado neste marcador de superfície celular e com o uso da técnica de classificação celular associada a magnético (MACS). O MACS pode ter vantagens em comparação com as técnicas de classificação celular ativadas por fluorescentes, devido aos tempos de triagem rápidos e ao ajuste mais fácil às condições de GMP. Poderíamos demonstrar um enriquecimento de ~90% e uma taxa de integração até 3 vezes maior ao transplantar a população enriquecida para o espaço subretinal em retinas adultas do tipo selvagem. Assim, o enriquecimento celular precursor do fotoreceptor baseado em MACS e o transplante subretinal são técnicas confiáveis e promissoras para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica regenerativa para o tratamento da degeneração da retina.

<table><tbody><tr><td>Sistema de dissociação de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>DNase I fornecido não é usado no método</td></tr><tr><td>Rato purificado anti-rato CD73, clone TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Concentração de estoque 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rato IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Volume total de 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Usado para contar o número total de células</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Usado para dissociação das retinas</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Usado para contar o número total de células</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina 10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina 2,5%-Tropicamida 0,5%</td><td>Farmácia University Clinics Dresden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de pré-separação</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separador</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Vidro polido a fogo Pasteur</td><td>pipeta Marca</td><td>74777 20</td><td>A pipeta' As pontas precisam ser polidas a fogo e autoclavadas.</td></tr><tr><td>Suporte para tubos MACS de 15 ml</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>pode ser usado em vez de Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>pode ser usado em vez de Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo invertido Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de células Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td>Tubo</tr> de <tr><td>reação de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td> Tubo de reação de <td></td></tr><tr><td>2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de cabeça de mouse</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Seringa de microlitro Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 5 &micro; l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>entregue sem agulhas</td></tr><tr><td>Agulha especial Hamilton RN 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>Sem corte, 12 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Tesoura de Mola bingen - Lâminas de 5 mm Retas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Fórceps - Titânio Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td> Biologie <td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de diamante</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Capa de lama</td><td>Faíscas</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante subretinal de células precursoras do fotoreceptor purificado macs na retina do rato adulto

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

A deficiência visual e a cegueira devido à perda das células de sensoriamento de luz da retina, ou seja, fotorreceptores, representam a principal razão para a incapacidade nos países industrializados. A substituição de fotorreceptores degenerados por transplante celular representa uma possível opção de tratamento em futuras aplicações clínicas. De fato, estudos pré-clínicos recentes demonstraram que fotorreceptores imaturos, isolados da retina do camundongo neonatal no pós-natal dia 4, têm o potencial de se integrar à retina do camundongo adulto após o transplante subretinal. As células doadoras geraram uma morfologia fotorreceptora madura, incluindo segmentos internos e externos, um corpo de células redondas localizado na camada nuclear externa, e terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas. De fato, relatórios recentes demonstraram que os fotorreceptores doadores se integram funcionalmente aos circuitos neurais dos camundongos hospedeiros. Para uma futura aplicação clínica de tal abordagem de substituição celular, suspensões purificadas das células de escolha devem ser geradas e colocadas na posição correta para a adequada integração ao olho. Para o enriquecimento dos precursores do fotorreceptor, a classificação deve ser baseada em antígenos de superfície celular específicos para evitar a modificação genética das células doadoras. Aqui mostramos a classificação celular associada a magnético (MACS) - enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste transplantáveis isolados da retina neonatal de camundongos repórteres específicos do fotorreceptor com base no marcador de superfície celular CD73. A incubação com anticorpos anti-CD73 seguidos por anticorpos secundários conjugados por micro-contas permitiu o enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste pelo MACS para aproximadamente 90%. Em comparação com a citometria de fluxo, o MACS tem a vantagem de que pode ser mais fácil aplicado aos padrões GMP e que altas quantidades de células podem ser classificadas em períodos relativos curtos de tempo. A injeção de suspensões celulares enriquecidas no espaço subretinal de camundongos adultos do tipo selvagem resultou em uma taxa de integração 3 vezes maior em comparação com suspensões celulares não sortidas.

Para avaliar a capacidade dos fotorreceptores de haste de integrar-se à retina do rato, foi utilizada uma linha de repórteres de camundongos, na qual o GFP é impulsionado pelo zíper de leucina de retina neural (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl é o marcador mais antigo de fotorreceptores de vara iniciando sua expressão em E12.5 durante toda a idade adulta, permitindo uma rotulagem específica de células fotorreceptoras de vara de doador.
PN 4 Filhotes de NRL-GFP foram decapitados e olhos...

O transplante celular representa uma estratégia para o tratamento da degeneração da retina caracterizada pela perda de fotorreceptor. Aqui descrevemos um método de enriquecimento de fotorreceptores transplantáveis e seu enxerto subretinal em camundongos adultos.

Transplante subretinal de células precursoras do fotoreceptor purificado MACS na retina do rato adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

O objetivo geral do seguinte experimento é transplantar células precursoras de fotorreceptores enriquecidas em uma retina de camundongo receptor. Isso é alcançado primeiramente isolando o olho da retina de animais doadores jovens. Na segunda etapa, as células precursoras de fotorreceptores pós-natais são isoladas da população celular retiniana por meio de triagem celular magnética associada ao CD73.Em seguida, os precursores de fotorreceptores são transplantados no espaço sub-retiniano de animais receptores para facilitar sua integração na retina do receptor. Em última análise, o potencial de integração e o comportamento das células precursoras de fotorreceptores transplantadas podem ser analisados por microscopia de imunofluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da regeneração retiniana, como qual é a capacidade dos fotorreceptores transplantados de se integrarem à circuitaria neural do hospedeiro para a restauração da visão.As implicações desta técnica vão além do tratamento de doenças degenerativas da retina. Uma vez que a instalação e o enriquecimento de precursores de fotorreceptores por max possam ser facilmente adaptados a condições GMP, a demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos do transplante são difíceis de aprender, e o manuseio sutil e a colocação da agulha no espaço sub-retiniano são cruciais para garantir o máximo sucesso e reprodutibilidade. Para dissociar as retinas, comece por enxaguar brevemente as cabeças de filhotes do quarto dia pós-natal em etanol 70%, seguido por uma lavagem com PBS.Em seguida, transfira as cabeças para HBSS frio para nucleação dos olhos de cada olho. Primeiro, abra a pálpebra. Depois, usando um par de pinças curvas.Segure o órgão na região do nervo óptico e retire cuidadosamente o olho da órbita. Em seguida, para isolar a retina, introduza a ponta de uma tesoura fechada no nervo óptico e abra as lâminas. Remova o epitélio pigmentar da retina e a coroide, e use pinças curvas para retirar a lente e os vasos sanguíneos.Incube as retinas isoladas em um tubo de reação de 1,5 mililitro contendo solução de papaína por 30 a 60 minutos em agitador a 400 RPM e 37 graus Celsius. Enquanto as retinas estão em incubação, distribua um mililitro de solução OVO MOID em um tubo de reação de 15 mililitros, rotulado como um, e depois em um tubo de reação de 2 mililitros rotulado como dois, adicionando 60 microlitros de DNAs, 60 microlitros de solução OVO MOID e 520 microlitros de EBSS. Após a incubação, transfira a solução de papaína contendo as retinas parcialmente digeridas para o tubo de reação dois e, em seguida, pipete as retinas 10 vezes com uma pipeta flamejada.Cubra suavemente a suspensão de células isoladas sobre a solução OVO MOID no tubo de reação um e centrifugue a solução celular por cinco minutos a 300 Gs e temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em 500 microlitros de tampão max. Para separar por max, incube primeiro as células em 10 microgramas por mililitro de anticorpo rat anti-CD 73 no gelo.Após cinco minutos, lave as células em 10 mililitros de tampão máx. Em seguida, reconstitua o pellet em 480 microlitros de tampão máx e incube as células em 120 microlitros de microesferas de IgG anti-RET go em gelo, sem agitação, agitação mecânica ou mistura. Após 15 minutos, lave as células em cinco mililitros de tampão máx; durante a lavagem, coloque uma coluna LS em um ímã máx e posicione um filtro de separação prévio no topo da coluna.Em seguida, hidrate o filtro e a coluna com três mililitros de tampão max. Colete o tampão em um tubo de 15 mililitros rotulado W para lavagem. Quando as células terminarem de centrifugar, re-suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão max e carregue as células no filtro.Adicione um mililitro de tampão máx sobre as células e, em seguida, colete a fração negativa em um tubo de reação de 15 mililitros rotulado com "menos" para negativo. Em seguida, adicione três mililitros de tampão máx à coluna três vezes para lavá-la. Agora, remova a coluna do suporte magnético.Instale-o sobre um tubo de reação de 15 mililitros rotulado com sinal de mais para positivo. E carregue rapidamente cinco mililitros de tampão max na coluna. Passe todo o tampão através da coluna e, após centrifugar a fração positiva, re-suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão max.Coloque as células a quatro graus Celsius e conte-as. Em seguida, ajuste a concentração para duas vezes 10 à quinta células por microlitro em tampão max, mantendo as células a quatro graus Celsius para o transplante das células precursoras de fotorreceptores isoladas. Dilate as pupilas de um camundongo adulto sedado com uma gota de fenil levotrópica colírica enquanto as pupilas dilatam. Use uma caneta de diamante para cortar uma lamínula em pedaços de aproximadamente cinco por cinco milímetros.Coloque o camundongo sob um microscópio estereoscópico, imobilize o animal em um suporte para cabeça de camundongo e, em seguida, aplique uma gota de gel ICIC em cada olho para evitar a secagem. Agora, use uma agulha de calibre 30 e meia polegada para fazer um pequeno orifício na borda entre a esclera e a córnea. Em seguida, coloque um dos pedaços de lamínula de cinco por cinco milímetros sobre a córnea, permitindo a visualização direta da retina.Em seguida, enxágue várias vezes uma seringa microlitro pré-esterilizada com água estéril desionizada e, então, carregue a seringa com uma das suspensões celulares classificadas. Direcione a agulha diagonalmente através da conjuntiva e da esclera, posicionando-a na metade nasal da retina. Em seguida, perfure suavemente a retina até o espaço subretiniano e injete as células.Confirme o descolamento bolhoso e uniforme da retina, que deve cobrir aproximadamente um quarto do espaço retiniano sem qualquer sangramento. Em seguida, retire suavemente a seringa e enxágue-a várias vezes adicionais com água ionizada. Por fim, solte o camundongo do dispositivo de contenção.Injete o animal com cloreto de aamaz para reverter os efeitos da anestesia e permita que se recupere em uma câmara escura a 25 graus Celsius, a fim de avaliar a capacidade dos fotorreceptores bastonetes de se integrarem à retina do camundongo. Uma linhagem repórter de camundongo foi utilizada, na qual a GFP é expressa sob o promotor do fator de transcrição NRL (neural retina leucine zipper), conforme demonstrado nestes histogramas. A suspensão inicial de células retinianas continha 30,4% de bastonetes positivos para GFP.Após a triagem e enriquecimento baseados no CD73, observou-se até 86,9% de células precursoras de fotorreceptores positivas para GFP na fração positiva para CD73, enquanto na fração negativa para CD73 apenas 9,9% das células foram positivas para GFP. Também é observado o enriquecimento de células positivas para N-R-L-G-F-P após a triagem baseada no CD73.Após o plaqueamento in vitro, as células doadoras permanecem no local da injeção conforme definido pela retina hospedeira descolada em bolha e se integram à camada nuclear externa da retina hospedeira, adquirindo a morfologia de fotorreceptores maduros. Uma vez que a separação celular associada ao magnetismo mestre possa ser realizada em até duas horas, se feita corretamente. Este procedimento também pode ser adaptado para o enriquecimento de fotorreceptores derivados de células-tronco ou mesmo outras células-tronco retinianas.Dada a disponibilidade de anticorpos específicos para responder perguntas adicionais sobre a restauração ou resgate por transmutação celular na retina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transplantar células precursoras de fotorreceptores enriquecidas fotoquimicamente para o espaço sub-retiniano de camundongos receptores.

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