Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar e quantificar as lesões ateroscleróticas no seio aórtico do IM. Isso é feito dissecando primeiro um coração extraído para separar a porção apical e localizar o seio aórtico. Em seguida, os blocos de parafina são preparados com a porção apical processada do coração.

Em seguida, o seio aórtico é seccionado e montado em lâminas. Finalmente, as seções de tecido são coradas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram diferentes tamanhos e composições de lesões ateroscleróticas por meio de análises histoquímicas e imuno-histoquímicas.

Demonstrando o procedimento estará Daniel Venga penal, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. O Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster pré-aprovou todos os procedimentos aqui descritos após anestesiar um camundongo LDLR duplo negativo e extrair o sangue, eutanasiar e fixá-lo antes de isolar o coração, de acordo com o protocolo de texto, use um bisturi para fazer um corte transversal no coração perpendicular à aorta ascendente. Coloque a parte apical ou superior do coração em um de incorporação e mergulhe-o em Formina.

Em seguida, coloque o em um processador de tecidos e processe durante a noite. Usando o programa descrito no protocolo de texto para os moldes histológicos, derreta a cera de parafina durante a noite a 62 graus Celsius. Coloque cada tecido de processo em um molde de histologia profunda, garantindo que a interface do coração esteja tocando a base do molde e, em seguida, despeje a cera de parafina derretida para preencher completamente o molde.

Use um de plástico rotulado para cobrir o molde. Depois de resfriar os moldes no gelo ou em uma superfície fria, separe o bloco do molde para seccionar a aorta. Posicione o bloco no suporte da amostra do micrótomo para que possa ser seccionado de dentro para cima do coração.

Ajuste o micrótomo para 10 mícrons e corte o coração. Colete seções em uma lâmina de vidro e examine sob um microscópio de luz para determinar a posição e a orientação. O seio deve aparecer como três bases valvares bipartidas com folhetos anexados.

Quando uma ou duas válvulas do seio aórtico se tornarem evidentes, ajuste o ângulo do bloqueio conforme necessário. Quando as válvulas forem alcançadas, ajuste o micrótomo para cortá-lo de quatro a cinco mícrons. Montagem das primeiras 10 seções cada uma na parte superior de lâminas de vidro individuais e, em seguida, montagem de cada grupo subsequente de 10 seções na próxima posição.

Nos slides. Continue a coletar cortes até que nenhuma lesão aterosclerótica seja observada. Para corar cortes com hematina e eoin para visualizar lesões, coloque as lâminas em um secador de ar por oito minutos.

Em seguida, desparize as seções usando xileno para lavá-las quatro vezes por três minutos cada. Lave as lâminas em etanol 100% três vezes por três minutos cada. Em seguida, 70% de etanol e 50% de etanol.

Três vezes por três minutos cada. Use água destilada para enxaguar as lâminas e depois mergulhe-as. Hematina de MA por 15 minutos.

Lave e corra. Água da torneira por cinco minutos. Em seguida, lave e destile água por cinco minutos após imersão em eoin Y por um a cinco minutos.

Lave e destile água três vezes por cinco minutos cada. 50% etanol duas vezes por dois minutos cada. Em seguida, 70% de etanol três vezes por dois minutos a cada lavagem e 100% de etanol.

Três vezes por dois minutos cada. Em seguida, lave e xileno quatro vezes por dois minutos cada. Use um meio de montagem à base de xileno para montar as seções e capturar imagens sob um microscópio de luz.

Use um software de imagem para identificar e quantificar lesões, que podem ser determinadas em distâncias específicas do seio aórtico em intervalos de 40 a 50 mícrons, dependendo da espessura dos cortes, consulte o protocolo de texto para coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência. LDLR de cinco semanas. Os camundongos positivos foram alimentados com uma dieta padrão ou uma dieta rica em gordura por 10 semanas antes que seus corações fossem consertados, isolados e seccionados, conforme mostrado aqui.

Quando os camundongos são alimentados com uma dieta padrão de ração, o desenvolvimento aterosclerótico é muito limitado e pode não ser detectável em 15 semanas de oito. Uma dieta rica em gordura acelera significativamente a aterogênese neste modelo e induz a formação de grandes lesões avançadas contendo núcleos acelulares crônicos e capas fibrosas. As lesões ateroscleróticas podem ser caracterizadas pela coloração para a presença de tipos celulares específicos e fatores que definem os estágios de desenvolvimento da lesão.

A infiltração de monócitos na íntima representa um dos primeiros eventos da aterogênese íntima. Os monócitos se diferenciam em macrófagos que engolfam detritos celulares e lipídios. Macrófagos ingurgitados de lipídios conhecidos como células espumosas criam uma faixa gordurosa na parede da artéria vista aqui.

As células espumosas dos macrófagos podem ser detectadas em todos os estágios do desenvolvimento da lesão, colorindo-se com anticorpos contra marcadores específicos de macrófagos, como F quatro 80 e MAC três. As células musculares lisas vasculares ou v SMCs estão confinadas à camada medial de uma artéria saudável. As CVEs são induzidas a migrar e proliferar na íntima durante o desenvolvimento de uma lesão avançada.

Como pode ser visto neste painel, os SMCs V podem ser identificados pela coloração com um anticorpo contra a actina alfa após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das doenças cardiovasculares explorarem o desenvolvimento e a progressão de lesões ateroscleróticas em bastonetes.