Name: Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprenda a quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino usando técnicas histoquímicas e imuno-histoquímicas. Este método permite analisar o tamanho e a composição das lesões em modelos de doenças cardiovasculares.

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Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa operacional dos Institutos Canadenses de Ciências da Saúde e da Associação Canadense de Diabetes. A DEV é apoiada por uma bolsa de estudos da Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chile).

O Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster pré-aprovou todos os procedimentos aqui descritos.
1. Colhendo Coração e Aorta
<ol>
	<li>Anestesiar o rato e abrir cuidadosamente a cavidade torácica para revelar o coração e a aorta proximal.
	<ol>
		<li>Extraia o sangue do camundongo por pontuação direta do ventrículo direito do coração. 
		Nota: O sangue pode ser armazenado e usado para a análise de lipídios plasmáticos e outros fatores transmitidos pelo sangue.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eutanasiar o camundongo por luxação cervical.</li>
	<li>Enxágue a vasculatura com 5 ml de soro fisiológico. 
	Nota: Isso é realizado por perfusão por gravidade através de uma punção com agulha no ventrículo esquerdo. Para permitir a drenagem, é feita uma pequena incisão no átrio direito. Após o enxágue da vasculatura, amostras de tecido de fígado, músculo e tecido adiposo podem ser coletadas, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC para análise futura.</li>
	<li>A vasculatura é fixada por perfusão por gravidade no ventrículo esquerdo com formol tamponado neutro a 10% 
	Nota: Uma vez iniciada a perfusão, o fluxo de formalina tamponada neutra a 10% é ajustado para um gotejamento lento para que o processo demore 1-2 min. Órgãos e tecidos que foram fixados por perfusão podem ser usados para o estudo da expressão de proteínas por meio de imunofluorescência ou histoquímica, mas geralmente não podem ser usados como amostras para western blotting ou para o estudo da expressão gênica.</li>
	<li>Extrair cuidadosamente o coração e aproximadamente 2 mm de aorta proximal da carcaça. Outros tecidos, incluindo a aorta descendente, podem ser coletados e armazenados para análise posterior. 
	Nota: A aorta descendente (para a bifurcação ilíaca) também pode ser usada para examinar a aterosclerose.</li>
	<li>Faça um corte transversal com bisturi no coração removido de forma perpendicular à aorta ascendente. 
	Nota: Isso é facilitado pelo uso de um microscópio de dissecação e pode ser feito com eficácia cortando ao longo de uma linha reta que une as pontas inferiores dos átrios direito e esquerdo (Figura 1).</li>
	<li>Armazene a parte apical (superior) do coração em um de incorporação e mergulhe-o em formalina tamponada neutra para processamento.</li>
</ol>
2. Preparação da Aorta
<ol>
	<li>Coloque o com o tecido dissecado no processador de tecidos.</li>
	<li>Amostras de tecido de processo. 
	Nota: Geralmente, os processadores de tecidos são programados para trabalhar durante a noite devido à duração da operação e às soluções envolvidas nesse processo. As amostras são processadas seguindo um protocolo estabelecido:
	<ol>
		<li>Formol tamponado neutro a 10% por 1 hora a 42 ºC.</li>
		<li>Formol tamponado neutro a 10% por 1 hora a 42 ºC.</li>
		<li>Etanol 70% por 30 min a 40 ºC.</li>
		<li>Etanol a 85% por 30 min a 40 ºC.</li>
		<li>Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.</li>
		<li>Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.</li>
		<li>Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.</li>
		<li>Xileno durante 1 hora a 40 ºC.</li>
		<li>Xileno durante 1 hora a 40 ºC.</li>
		<li>Xileno durante 1 hora a 40 ºC.</li>
		<li>Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.</li>
		<li>Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.</li>
		<li>Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.</li>
		<li>Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Derreter a cera de parafina durante a noite a 62 ºC (Figuras 1D-E). Estimar a quantidade total de cera de parafina a ser utilizada com base nos gramas de cera de parafina necessários para preencher um molde histológico e no número de blocos a serem preparados. 
	Nota: Um molde de histologia profunda é preferível ao molde raso porque fornece um ângulo de rotação potencial mais amplo ao seccionar. Um único molde de histologia profunda requer 11 g de cera de parafina.</li>
	<li>Coloque cada tecido processado em um molde de histologia profunda e, em seguida, despeje a cera de parafina derretida para preencher completamente o molde (Figura 1F). Cubra o molde com um de plástico rotulado (Figura 1G).</li>
	<li>Resfrie o molde preenchido no gelo ou em uma superfície fria (Figura 1H), a fim de criar o bloco sólido e separar o bloco do molde (Figuras 1I-J). 
	Nota: Ao colocar o coração dissecado no molde, certifique-se de que a face interna do coração esteja tocando a base do molde e, em seguida, preencha o bloco com parafina derretida. Um de plástico rotulado cobre o molde antes de solidificar, a fim de fornecer uma base para lidar com o bloco. Depois de resfriado, o molde é removido e os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente em temperatura ambiente.</li>
</ol>
3. Secção da Aorta
<ol>
	<li>Posicione o bloco com o coração no suporte da amostra do micrótomo para que possa ser seccionado de dentro para cima do coração (Figura 2)</li>
	<li>Ajuste o micrótomo para cortar uma espessura de corte de 10 μm e prossiga para seccionar o coração.</li>
	<li>Colete seções em uma lâmina de vidro e examine sob um microscópio de luz para determinar a posição e a orientação.</li>
	<li>Quando 1 ou 2 válvulas do seio aórtico se tornarem evidentes, ajuste o ângulo do bloqueio conforme necessário (Figura 3A). 
	Nota: O seio deve aparecer como três bases de válvulas bipartidas com folhetos anexados. Se apenas um ou dois folhetos da válvula forem observados, o ângulo de corte deve ser ajustado de acordo.</li>
	<li>Ajuste o micrótomo para cortar a 4-5 μm e colete as seções em lâminas de vidro revestido. 
	Nota: Embora o procedimento possa ser variado, recomenda-se uma abordagem sistemática, pela qual as primeiras 10 seções, do seio aórtico avançando para a aorta ascendente, são coletadas na parte superior de uma lâmina de vidro rotulada (lâminas rotuladas de 1 a 10). Os cortes subsequentes são coletados seguindo o mesmo padrão: #11-20, #21-30, #31-40 até que as lesões ateroscleróticas não sejam mais observadas (Figura 3B). Desta forma, as lesões ateroscleróticas podem ser examinadas e caracterizadas em locais precisos ao longo da aorta ascendente. Por exemplo, o slide 1 contém as seções 1, 11, 21, 31, 41 e 51, representando lesões ateroscleróticas do seio aórtico até a aorta ascendente. Lâminas adicionais, rotuladas de 11 a 20, podem ser incluídas se a lesão for grande, para coletar mais seções distais seguindo o mesmo padrão.</li>
	<li>Continuar a coletar cortes até que nenhuma lesão aterosclerótica seja observada. 
	Nota: As lâminas podem ser armazenadas em temperatura ambiente por meses, antes de uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>
4. Coloração e quantificação de lesões ateroscleróticas
As lesões ateroscleróticas podem ser analisadas de muitas maneiras diferentes usando uma variedade de técnicas. A análise mais básica envolve a determinação da área de secção transversa da lesão. Para comparar com precisão a área da lesão, é importante que o ponto de partida para a medição da lesão seja consistente de amostra para amostra. Isso é facilitado pelo uso dos folhetos da válvula para orientação. Para facilitar a identificação e quantificação precisas da área da lesão, seções transversais selecionadas são coradas com hematoxilina e eosina. Isso envolve a imersão das lâminas em uma série de soluções por tempos especificados, que irão desparafinizar/manchar o tecido.
Protocolo para coloração de hematoxilina e eosina:
<ol>
	<li>Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min e depois desparafinize as seções lavando 4× em xileno, por 3 min por lavagem.</li>
	<li>Lave as lâminas em etanol 100% 3× por 3 min cada.</li>
	<li>Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada e depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.</li>
	<li>Enxágüe com água destilada e depois mergulhe na Hematoxilina de Mayer por 15 min.</li>
	<li>Lave em água corrente da torneira por 5 min e depois lave em água destilada por 5 min.</li>
	<li>Mergulhe em Eosin Y por 1-5 min.</li>
	<li>Lave em água destilada 3× por 5 min cada, lave em etanol 50% 2× por 2 min cada, depois etanol 70% 3× por 2 min cada.</li>
	<li>Lave em etanol 100% 3× por 2 min cada e depois lave em xileno 4× por 2 min cada.</li>
	<li>Monte seções usando meio de montagem à base de xileno e capture imagens usando uma câmera digital montada em um microscópio óptico.</li>
	<li>Identifique e quantifique a área da lesão usando um software de imagem. 
	Nota: A área da lesão pode ser determinada a distâncias específicas do seio aórtico em intervalos de 40-50 μm (dependendo da espessura de cada seção). Um gráfico dessas medidas de área versus distância fornece um perfil da lesão aterosclerótica (Figura 4). A área sob a curva representa uma estimativa do volume total da lesão aterosclerótica. A caracterização adicional da lesão pode incluir a determinação da área necrótica. O núcleo necrótico (nc) de uma lesão avançada é formado por células espumosas apoptóticas. Com a prática, isso pode ser determinado pelo exame das regiões acelulares dos cortes corados com hematoxilina e eosina (Figura 4A). As lesões precoces tendem a ter muito pouca necrose, enquanto as lesões mais avançadas têm áreas necróticas aumentadas que podem contribuir para a instabilidade da placa. Cortes seriados da mesma aorta devem ser examinados para confirmar a presença de uma região necrótica.</li>
</ol>
5. Caracterização adicional da lesão aterosclerótica
Detalhes específicos sobre o estágio de desenvolvimento aterosclerótico podem ser determinados pela coloração com anticorpos direcionados contra tipos ou marcadores celulares específicos. A imuno-histoquímica em cortes de parafina é uma técnica padrão usada para identificar tipos ou marcadores celulares específicos no contexto do tecido não corado circundante. A detecção de antígenos geralmente é obtida usando um substrato de peroxidase de rábano.
A coloração por imunofluorescência envolve o uso de anticorpos conjugados com fluoróforo e requer um microscópio de fluorescência e filtros apropriados para detecção. Esta técnica permite a coloração simultânea de dois (ou mais) antígenos.
Protocolo Geral para Coloração Imuno-Histoquímica:
<ol>
	<li>Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min.</li>
	<li>Desparafinize as seções em 4 mudanças de xileno, 3 min each.</li>
	<li>Lave em etanol 100% 3× por 3 min cada para remover o xileno.</li>
	<li>Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada, depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.</li>
	<li>Lave em água destilada por 5 minutos cada e depois lave 3× em PBS por 5 minutos cada.</li>
	<li>Realize a recuperação do antígeno. Isso pode ser feito usando o método de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER) em uma panela de pressão de micro-ondas e solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 10 mM, pH 6,0). 
	Nota: O processo de fixação da formalina pode mascarar os antígenos de interesse. Em nossa experiência, o HIER melhora significativamente o desempenho de alguns anticorpos, mas não é necessário para outros. Além disso, existem outras alternativas disponíveis ao método HIER de recuperação de antígenos.</li>
	<li>Quando a panela de pressão esfriar, coloque as lâminas no PBS por 15 min.</li>
	<li>Incube seções em soro normal (da mesma espécie da qual o anticorpo secundário foi derivado) por 30 min. NÃO LAVE AS LÂMINAS - DRENE O SORO.</li>
	<li>Incubar com anticorpo primário diluído em soro de bloqueio normal durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave com PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Incubar as secções com o anticorpo secundário biotinilado que foi diluído em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube as lâminas com estreptavidina peroxidase de rábano por 30 min e depois lave com PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Reação cromogênica - incubar lâminas em DAB fresco (3,3'-diaminobenzidina) por 5-30 min. Esta reação deve ser monitorada usando um microscópio. Pare a reação lavando as lâminas em água da torneira.</li>
	<li>Contra-coloração com hematoxilina por 1 min. Lave com água da torneira por 5 min e depois lave em água destilada 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Repita as etapas 4.7-4.9 para montagem de slides.</li>
</ol>
6. Protocolo Geral para Coloração de Imunofluorescência
Um protocolo semelhante, com pequenas alterações, pode ser seguido para a coloração por imunofluorescência.
<ol>
	<li>Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min e depois desparafinize as seções em 4 trocas de xileno, 3 min cada.</li>
	<li>Lave em etanol 100% 3× por 3 min cada para remover o xileno.</li>
	<li>Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada, depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.</li>
	<li>Lave em água destilada por 5 min cada e depois lave em PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Realize a recuperação do antígeno. Isso pode ser feito usando o método de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER) em uma panela de pressão de micro-ondas e solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 10 mM, pH 6,0). 
	Nota: O processo de fixação da formalina pode mascarar os antígenos de interesse. Em nossa experiência, o HIER melhora significativamente o desempenho de alguns anticorpos, mas não é necessário para outros. Além disso, existem outras alternativas disponíveis ao método HIER de recuperação de antígenos.</li>
	<li>Quando a panela de pressão esfriar, coloque as lâminas no PBS por 15 min.</li>
	<li>Incube seções em soro normal (da mesma espécie da qual o anticorpo secundário foi derivado) por 30 min. NÃO LAVE AS LÂMINAS - DRENE O SORO.</li>
	<li>Incubar com anticorpo primário diluído em soro de bloqueio normal durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave com PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Adicione anticorpo conjugado com fluoróforo secundário que é diluído em soro bloqueador normal (ou PBS). Incube por 1,5 hora em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave com PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Contra-coloração com DAPI.</li>
	<li>Lave em PBS 3× por 5 min cada.</li>
	<li>Aplique uma lamínula usando mídia de montagem antidesbotamento.</li>
</ol>

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<li>Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+atherosclerotic+lesions+in+the+innominate+artery+of+the+ApoE+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).</li>
<li>McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3Dreconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine%3A+Microscopiccomputedtomography-based+virtual+histology+for+visualization+and+morphometry+of+atherosclerosis+in+diabetic+apolipoprotein+e+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice.</a> Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).</li>
<li>Kirkby, N. S., Low, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-dimensional+imaging+of+murine+neointimal+and+atherosclerotic+lesions+by+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography.</a> PLoS One. 6 (2), e16906(2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A aterosclerose é uma doença crônica complexa das grandes artérias musculares que é uma das principais causas subjacentes de infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. A progressão da doença envolve a interação de muitos tipos diferentes de células dentro da parede da artéria, com células sanguíneas circulantes, partículas de lipoproteínas e outros fatores transmitidos pelo sangue que estamos apenas começando a entender. Muito do nosso conhecimento atual sobre o desenvolvimento e progressão da aterosclerose veio ...

Nas últimas duas décadas, o desenvolvimento e o uso de modelos de camundongos propensos à aterosclerose por meio de manipulação dietética e/ou genética aumentaram significativamente nossa compreensão dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos no desenvolvimento da lesão aterosclerótica1-3. Grande parte do nosso conhecimento e compreensão da aterogênese vem de estudos realizados em camundongos deficientes em apolipoproteína (Apo)-E4 camundongos, nos quais lesões ateroscleróticas se desenvolvem espontaneamente e deficientes em receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR)5 camundongos, nos quais a aterosclerose é induzida pela dieta. Uma vantagem importante desses modelos é que eles permitem o estudo de um número relativamente grande de animais geneticamente definidos sob condições dietéticas e ambientais controladas. Além disso, as lesões ateroscleróticas avançadas que se desenvolvem em algumas dessas cepas de camundongos parecem ser muito semelhantes às observadas em seres humanos, contendo núcleos necróticos cheios de lipídios e capas fibrosas. A aterosclerose se desenvolve rapidamente nesses modelos de camundongos, tornando muito viável estudar o desenvolvimento de lesões, desde a faixa gordurosa até a placa avançada, em questão de semanas. Além disso, fatores de risco conhecidos para doenças cardiovasculares em humanos, incluindo diabetes6, dislipidemia7, obesidade8, hipertensão9, fumaça de cigarro10 e um ambiente sedentário11 demonstraram acelerar ainda mais o desenvolvimento de lesões.
Na maioria, senão em todos os modelos de camundongos propensos à aterosclerose, o desenvolvimento da lesão pode ser detectado pela primeira vez no seio aórtico. O tempo de início depende da cepa e da dieta do camundongo. À medida que as lesões aumentam de tamanho, elas tendem a crescer na aorta ascendente. Em camundongos ApoE-/- e LDLR-/-, o desenvolvimento subsequente de lesões pode ser detectado em bifurcações aórticas no arco aórtico, na aorta descendente e em outras artérias maiores12-14. A Dra. Beverly Paigen e colegas, além de desenvolver alguns dos primeiros modelos de aterosclerose induzida por dieta, também estabeleceram um ensaio para a quantificação de lesões ateroscleróticas no seio aórtico que se tornou o padrão de medição de lesões em modelos de camundongos15. Ao longo dos anos, essa técnica foi refinada e descrita em detalhes16. Aqui apresentamos uma versão modificada do "método de Paigen" para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas em um camundongo. A análise de cortes transversais da aorta seriados de uma região vascular específica e em uma orientação definida e fixa, facilita a coleta precisa de dados e permite a detecção precisa de variações no desenvolvimento da lesão em diferentes grupos de tratamento. Os métodos apresentados aqui baseiam-se nas técnicas anteriores. Especificamente, descrevemos como a caracterização da lesão em termos de área, volume, conteúdo necrótico e celular é possível por meio do exame de cortes seriados usando uma combinação de histoquímica e imuno-histoquímica.

<table><tbody><tr><td>Camundongos com deficiência de LDLR&nbsp;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td><td>The Jackson</td><td>Laboratory stock #002207</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de Histologia</td><td>Ted Pella Inc</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Paramat</td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de solvente</td><td>Tissue Tek II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Processador</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>de processamento</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Preassure Cooker</td><td>Nordic Ware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem antidesbotamento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>Montagem de xileno médio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>Alpha actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo; s Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-Diaminobenzidina)</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

A aterosclerose é uma doença das grandes artérias e uma das principais causas subjacentes de infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. Vários modelos diferentes de camundongos foram desenvolvidos para facilitar o estudo da fisiopatologia molecular e celular desta doença. Neste manuscrito descrevemos técnicas específicas para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino e na aorta ascendente. A vantagem desse procedimento é que ele fornece uma medida precisa da área de secção transversa e do volume total da lesão, que pode ser usada para comparar a progressão aterosclerótica em diferentes grupos de tratamento. Isso é possível através do uso dos folhetos valvares como marco anatômico, juntamente com o ajuste cuidadoso do ângulo de secção. Também descrevemos métodos básicos de coloração que podem ser usados para começar a caracterizar a progressão aterosclerótica. Estes podem ser modificados para investigar antígenos de interesse específico para o pesquisador. As técnicas descritas são geralmente aplicáveis a uma ampla variedade de modelos dietéticos e geneticamente induzidos existentes e recém-criados

Ratos LDLR-/- com cinco semanas de idade foram alimentados com uma dieta padrão ou com uma dieta rica em gordura durante dez semanas. Os animais foram sacrificados e perfundidos com formalina, conforme descrito anteriormente. Foram preparadas seções transversais do seio aórtico e coradas com hematoxilina e eosina para determinar a área e o volume da lesão (Figura 4). Quando os camundongos são alimentados com uma dieta padrão, o desenvolvimento aterosclerótico é muito limitado e pode não ser detectável ao...

Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar e quantificar lesões ateroscleróticas no seio aórtico de MI. Isso é realizado primeiramente dissecando um coração extraído para separar a porção apical e localizar o seio aórtico. Em seguida, blocos de parafina são preparados com a porção apical processada do coração.Em seguida, o seio aórtico é seccionado e montado em lâminas. Por fim, os cortes teciduais são corados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram diferentes tamanhos e composições de lesões ateroscleróticas por meio de análises histoquímicas e imuno-histoquímicas.Demonstrará o procedimento Daniel Venga penal, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. O Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade McMaster aprovou previamente todos os procedimentos descritos aqui. Após anestesiar um camundongo LDLR duplo negativo e extrair o sangue, eutanasiar e fixar o animal antes de isolar o coração de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilize um bisturi para fazer um corte transversal no coração, perpendicular à aorta ascendente. Coloque a porção apical ou superior do coração em um cassete de inclusão e submerja-o em Formol.Em seguida, coloque a cassete em um processador de tecidos e processe durante a noite. Utilizando o programa descrito no protocolo textual, derreta a parafina para as formas de histologia durante a noite a 62 graus Celsius. Coloque cada tecido processado em uma forma de histologia profunda, garantindo que a interface do coração esteja tocando a base da forma, e então despeje parafina derretida para preencher completamente a forma.Use um cassete plástico rotulado para cobrir o molde. Após resfriar os moldes em gelo ou em uma superfície fria, separe o bloco do molde para seccionar a aorta. Posicione o bloco no porta-espécime do micrótomo de modo que possa ser seccionado de dentro para o topo do coração.Ajuste o micrótomo a 10 micrômetros e corte o coração. Colete os cortes em uma lâmina de vidro e examine ao microscópio óptico para determinar a posição e a orientação. O seio deve aparecer como três bases valvares bipartidas com folhetos anexos.Quando uma ou duas válvulas do seio aórtico se tornarem evidentes, ajuste o ângulo do bloco conforme necessário. Quando as válvulas forem alcançadas, ajuste o micrótomo para cortá-las com quatro a cinco mícrons. Monte as primeiras 10 seções, cada uma no topo de lâminas de vidro individuais, e depois monte cada grupo subsequente de 10 seções na próxima posição.Nas lâminas. Continue a coletar seções até que nenhuma lesão aterosclerótica seja observada. Para corar as seções com hematina e eosina a fim de visualizar as lesões, coloque as lâminas em um secador de ar por oito minutos.Em seguida, desparafinize as seções utilizando xilol para lavá-las quatro vezes, durante três minutos cada. Lave as lâminas em etanol a 100% três vezes, durante três minutos cada. Em seguida, em etanol a 70% e etanol a 50%.Três vezes, durante três minutos cada. Use água destilada para enxaguar as lâminas e, em seguida, imerja-as em hematina de MA por 15 minutos.Lave e escorra. Água da torneira por cinco minutos. Em seguida, lave e água destilada por cinco minutos após imersão em eossina Y por um a cinco minutos.Lave com água destilada três vezes, cinco minutos cada. 50% etanol duas vezes, dois minutos cada. Em seguida, 70% etanol três vezes, dois minutos cada lavagem, e 100% etanol.Três vezes, por dois minutos cada. Em seguida, lave e use xilol quatro vezes, por dois minutos cada. Utilize um meio de montagem à base de xilol para montar as seções e capture imagens em um microscópio óptico.Utilize um software de imagem para identificar e quantificar lesões, que podem ser determinadas a distâncias específicas do seio aórtico em intervalos de 40 a 50 mícrons, dependendo da espessura das seções; consulte o protocolo no texto para coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência. Camundongos LDLR positivos com cinco semanas de idade foram alimentados com dieta padrão ou dieta rica em gordura por 10 semanas antes de seus corações serem fixados, isolados e seccionados conforme mostrado aqui.Quando os camundongos recebem uma dieta padrão à base de ração, o desenvolvimento aterosclerótico é muito limitado e pode não ser detectável aos 15 semanas de idade. Uma dieta rica em gordura acelera significativamente a aterogênese neste modelo e induz a formação de grandes lesões avançadas contendo núcleos acelulares necróticos e capas fibrosas. As lesões ateroscleróticas podem ser ainda caracterizadas por meio de coloração para a presença de tipos celulares e fatores específicos que definem as fases do desenvolvimento da lesão.A infiltração de monócitos na íntima representa um dos primeiros eventos da aterogênese da íntima. Os monócitos se diferenciam em macrófagos que englobam detritos celulares e lipídios. Os macrófagos carregados de lipídios, conhecidos como células espumosas, formam uma estria gordurosa na parede arterial vista aqui.As células espumosas de macrófagos podem ser detectadas em todas as fases do desenvolvimento da lesão por meio de coloração com anticorpos contra marcadores específicos de macrófagos, como F four 80 e MAC three. As células musculares lisas vasculares ou v SMCs estão confinadas à camada média de uma artéria saudável. As v SMCs são induzidas a migrar e proliferar na íntima durante o desenvolvimento de uma lesão avançada.Como pode ser observado neste painel, as CMLV podem ser identificadas por meio de coloração com um anticorpo contra a actina alfa após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de doenças cardiovasculares explorassem o desenvolvimento e a progressão de lesões ateroscleróticas em roedores.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Análise Quantitativa e Caracterização de Lesões Ateroscleróticas no Seno Aórtico Murino

A análise ex vivo de lesões arteriais de modelos animais de doenças cardiovasculares classicamente depende de técnicas histológicas e imuno-histoquímicas. Estes fornecem medições bidimensionais em lesões tridimensionais. Este manuscrito descreve a geração de lesões arteriais para análise quantitativa em 3 dimensões usando tomografia de projeção óptica.

Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

Este vídeo mostra dois modelos de desenvolvimento íntima placas nas artérias murino e enfatiza as diferenças de hiperplasia miointimal e aterosclerose.

Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

Este artigo descreve uma metodologia detalhada de usando uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para perfundir vasculatura murino para quantificação do diâmetro da aorta em um modelo do rato de aneurisma da aorta e dissecação.

Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Descreveremos um protocolo para induzir a aterosclerose na raiz da aorta de ApoE- / - ratos alimentados com uma dieta aterogênico, através de uma contínua liberação de aldosterona. Também são descritos métodos para caracterizar a composição da placa bacteriana.

Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E

Propomos um protocolo padronizado para caracterizar a composição celular do tarde-estágio lesões ateroscleróticas murino, incluindo métodos sistemáticos de dissecação animal, incorporação de tecido, corte, coloração e análise das artérias Braquiocefálica de ratos de rastreamento do linhagem de células de músculo liso atheroprone.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Os modelos murinos de aterosclerose são ferramentas úteis para investigar vias patogênicas em nível molecular, mas necessitam de quantificação padronizada do desenvolvimento da lesão. Este protocolo descreve um método aperfeiçoado para determinar o tamanho da lesão nos vasos arteriais principais que incluem a raiz aórtica, o arco aórtico, e a artéria braquiocefálico.

Quantificação da aterosclerose em camundongos

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para analisar a carga aterosclerótica em camundongos. Os investigadores podem usar este protocolo para comparar a abundância, localização e tamanho das lesões ateroscleróticas em diferentes animais.

Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma

Aqui, apresentamos protocolos otimizados de limpeza de tecido para obter imagens da aorta murina em três dimensões (3D). Delineamos procedimentos de última geração para imunocoloração, limpeza óptica e imagem com a intenção de definir a proximidade anatômica do sistema nervoso periférico com placas ateroscleróticas e a adventícia na aterosclerose.

Imagem tridimensional de tecidos aórticos na aterosclerose

Este protocolo fornece uma metodologia abrangente para a análise quantitativa de placas ateroscleróticas para facilitar pesquisas mais aprofundadas sobre os mecanismos e a progressão da aterosclerose.

Isolamento e análise de lesões do arco aórtico e da raiz em um modelo de camundongo aterosclerótico

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Aprenda a quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino usando técnicas histoquímicas e imuno-histoquímicas. Este método permite analisar o tamanho e a composição das lesões em modelos de doenças cardiovasculares.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

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