A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um sistema de cultura que recapitule de perto o microambiente celular e intracelular da medula óssea humana. Primeiro, a superfície de um poço de cultura de tecidos é revestida com a matriz industrial. Em seguida, as células mononucleares da medula óssea ou outras células de interesse são misturadas com a matriz da medula óssea.

Posteriormente, a matriz industrial é removida e a mistura da matriz celular é adicionada ao poço. Uma vez que a matriz tenha gelatinizado, ela é revestida com meio de crescimento. Em última análise, as células podem ser visualizadas diretamente na matriz ou podem ser isoladas para análises a jusante em comparação com os métodos existentes para cultura de células.

Por exemplo, métodos padrão de cultura de tecidos ou os modelos de co-cultura em que as células são cultivadas em plástico. O principal benefício de usar um método de cultura 3D é que as células são cultivadas dentro do microambiente fisiológico e, portanto, permite estudar as células dentro das condições nativas do tecido. Prepare uma placa de 48 poços na qual as células serão banhadas.

Ao adicionar primeiro 65 microlitros de solução de revestimento industrial em cada um, espalhe a solução uniformemente para cobrir toda a superfície do poço. Esse método também é escalável para outras superfícies. Deixe as placas incubarem em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.

Enquanto isso, prepare a suspensão celular de 50.000 células por microlitro de PBS. Prepare o suficiente para adicionar 10 microlitros a cada poço e, em seguida, em um tubo einor, misture a suspensão celular com 100 microlitros de matriz óssea reconstruída. Misture delicadamente e evite introduzir bolhas.

Mantenha a mistura no gelo para que a matriz não gelifique quando a placa terminar. Incubando, remova todo o líquido e dote a solução de revestimento por aspiração. Em seguida, adicione 100 microlitros de suspensão de células bem misturadas com matriz a cada um.

Incline rapidamente a placa usando uma pipeta para cobrir toda a superfície do poço uniformemente. Continue misturando a suspensão entre os preenchimentos de poços, pois as células se aglomerarão quando estiverem totalmente carregadas. Incubar a placa por 30 a 60 minutos sem agitação até que a matriz solidifique.

Em seguida, pré-aqueça o meio de crescimento da medula óssea em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius. Após 30 minutos de incubação, verifique se a matriz está configurada corretamente. Uma boa matriz forma uma camada macia semelhante a um gel que não se move quando a placa é inclinada.

Quando a matriz estiver pronta, cubra-a suavemente com um mililitro de meio gota a gota usando uma pipeta sorológica. Em seguida, retorne a cultura da matriz óssea reconstruída montada para a incubadora por até 30 dias sem alterações de meio. Se for necessária uma mudança de meio, troque apenas metade do meio de uma vez.

Remova o meio suavemente sem perturbar a camada da matriz. Incline o prato e escorra o meio suavemente usando uma pipeta. Não aspire a mídia sobre a matriz posteriormente.

Ao colorir as células. Use essa técnica para alterações de solução. Para remover a mídia dos poços de uma cultura 3D, é muito importante que ela seja removida da lateral do poço.

Caso contrário, a matriz será perturbada e as células podem ser perdidas Aderindo à mesma técnica. Lave as células duas vezes com um XPBS estéril. Em seguida, adicione meio mililitro de solução de recuperação de células geladas a cada um.

Bem, remova toda a camada da matriz junto com as células, pipetando vigorosamente para cima e para baixo. Para cada um, transfira a coleção para um tubo de microcentrífuga e coloque-a no gelo. Em seguida, adicione mais meio mililitro de solução de recuperação ao mesmo poço e colete todo o material restante.

Vortex todas as coleções e incube-as por uma hora no gelo. Durante a hora, vórtice os tubos a cada 15 minutos para facilitar a liberação celular da matriz. Após uma hora, verifique se há aglomerados visíveis de matriz na mistura.

Nenhum deve estar presente, mas se houver, transfira a mistura para um tubo maior e adicione mais dois a cinco mililitros de solução de recuperação celular. Em seguida, incube as células por mais 30 a 60 minutos. Vórtice periodicamente e verifique novamente a ausência de aglomerados de matriz.

Quando a matriz não está mais agrupada. Centrifugue a mistura a 1000 RPM por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de XPBS frio.

Repita a centrifugação. Substitua o sobrenadante por PBS novo e repita a lavagem. Uma terceira vez.

Após a terceira lavagem com PBS, recupere as células na solução apropriada para o próximo procedimento. As células da medula óssea foram cultivadas em matriz óssea reconstruída por 30 dias e fotografadas periodicamente por microscopia de luz com aumento de 200 vezes. Os elementos estromais foram detectados pela primeira vez no quinto dia, mas eram claramente evidentes no dia 14.

Ao longo do período de cultivo, as células migraram através da matriz e se agregaram em clusters distintos. Massas de células malignas se expandiram ao longo do tempo para avaliar a composição dos componentes estromais que crescem em RBM. Avaliou-se a morfologia das células na transição entre o RBM e o revestimento industrial.

As células foram coradas para fibronectina, actina e núcleos. Células de visualização com morfologia estromal mostraram-se pré-osteoblastos com altos níveis de atividade da fosfatase alcalina. Eles foram capazes de mineralizar o cálcio, conforme determinado pela coloração de zarin, as células vermelhas com uma presença visível de gotículas lipídicas foram identificadas como adipócitos com base na coloração positiva com óleo.

Os glóbulos vermelhos com múltiplos núcleos ocasionais foram reconhecidos como pré-osteoclastos e foram positivos para fosfatase ácida resistente ao tartarato. Após o isolamento de células de uma cultura 3D, você pode fazer uma variedade de coisas. Por exemplo, você pode estudar os fenótipos celulares de várias células cultivadas no microambiente.

Você pode estudar a expressão gênica e proteica e pode até determinar que tipo de moléculas são secretadas por essas células em condições 3D.