Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção
November 22nd, 2013
Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.
O objetivo geral deste procedimento é gerar macrófagos a partir de culturas de células derivadas da urina e da medula óssea. Isso é feito primeiro extraindo a medula óssea das patas traseiras do camundongo. Na segunda etapa, os macrófagos residentes na medula óssea são removidos e, em seguida, as células da medula óssea são cultivadas em condições de diferenciação de macrófagos.
Então, quando as células da medula óssea se diferenciam em macrófagos, elas podem ser coletadas para análise experimental. Em última análise, a microscopia confocal pode ser usada para demonstrar a localização de LPS bacteriano dentro de macrófagos derivados da medula óssea, compartimentos ácidos finais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o cultivo de macrófagos, linhagens celulares, é esse grande número, de modo que os macrófagos primários podem ser obtidos.
A demonstração visual do método é crítica, pois as etapas de autoprodução são difíceis de aprender e exigem prática e, para obter sucesso, desinfete a pele de um camundongo sacrificado com 70% de etanol. Faça uma incisão na parte superior de cada pata traseira e puxe a pele para baixo em direção ao pé para expor o músculo. Em seguida, corte as patas traseiras e use tesouras e pinças estéreis.
Para remover a pele, coloque as pernas em uma placa de Petri estéril de 35 milímetros contendo cinco mililitros de gelo estéril. PBS frio. Remova qualquer pele e músculo ligado aos ossos e, em seguida, transfira os ossos para uma nova placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de gelo.
PBS frio e estéril. Lave os ossos duas vezes com mais cinco mililitros de PBS e depois transfira-os para uma argamassa estéril contendo cinco mililitros de gelo. PBS frio e estéril.
Agora corte a tíbia do fêmur na articulação e use um pilão para esmagar suavemente os ossos. Recolha o sobrenadante em tubos gelados de 15 mililitros três vezes. Em seguida, filtre a suspensão de tecido através de um filtro de células de náilon de 70 mícrons.
Para remover os fragmentos sólidos, gire o filtrado e descarte suavemente o sobrenadante. Dissocie o pellet com tampão de lise de glóbulos vermelhos, adicionando 20 mililitros de DMEM completo gelado após 30 segundos para interromper a reação após centrifugar as células, suspendemos o pellet em 20 mililitros de 37 graus Celsius, DMEM completo e, em seguida, dividimos a suspensão celular entre duas placas de Petri de 100 milímetros. Incube os pratos por quatro horas a 37 graus Celsius e, em seguida, colete os sobrenadantes em tubos de 50 mililitros em temperatura ambiente.
Depois de girar os sobrenadantes, suspenda novamente o pellet em 10 mililitros de DMEM completo suplementado com o sobrenadante de células L 9 29 previamente preparado e, em seguida, filtre as células através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons. Adicione o filtrado a 140 mililitros de DMEM completo e meio de célula L 9 29 e, em seguida, distribua 10 mililitros da suspensão celular por placa em 15 placas de Petri de 100 milímetros. Depois de incubar as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 10 mililitros de DMEM completo mais L 9 29 sobrenadante e incubar as células por mais quatro dias.
Monitorando o crescimento celular periodicamente com um microscópio invertido para colher os macrófagos derivados da medula óssea, primeiro aspirar e descartar o sobrenadante. Em seguida, lave as placas de Petri duas vezes com DMEM completo. Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM completo de 37 graus Celsius e use um policial de borracha para separar suavemente as células, colete os macrófagos derivados da medula óssea em tubos de 50 mililitros e, em seguida, gire as células.
Resus suspendendo os pellets em 20 mililitros de DMEM completo. Finalmente, conte as células por exclusão triam blue. Usando este método, um grande número de macrófagos pode ser obtido em apenas alguns dias após o isolamento e plaqueamento das células redondas da medula óssea não aderentes, menos os macrófagos residentes na medula óssea, como acabamos de demonstrar.
Essas células precursoras representativas do BMDM foram incubadas com G-M-C-S-F. Após três dias, as células começaram a aderir e se diferenciar em macrófagos. Após sete dias, foi observada uma monocamada confluente de macrófagos derivados da medula óssea.
A análise por citometria de fluxo para F quatro 80 e H-L-A-D-R revelou que os macrófagos derivados da medula óssea expressaram ambos os marcadores, confirmando a diferenciação das células da medula óssea em macrófagos. Avaliar as capacidades ácidas de PHA dos macrófagos derivados da medula óssea. A capacidade das células de internalizar as velocidades do látex foi monitorada conforme o esperado.
O número de grânulos por célula foi determinado para aumentar ao longo do tempo para avaliar seu potencial endocítico. Os macrófagos derivados da medula óssea também foram co-cultivados com Coxiella. Observou-se que o LPS do olho de Burnett em vermelho estava localizado em um compartimento que abriga a proteína de membrana associada ao lisossomo um em azul, mas não a catepsina D em verde, demonstrando que o LPS estava presente nos endossomos tardios, que são incapazes de se fundir com os lisossomos como esperado macrófagos derivados da medula óssea.
As interações bacterianas do patógeno foram analisadas por meio de sua infecção pelo olho de TMA Wiley. Como esperado, as bactérias em vermelho não estavam localizadas no compartimento que abriga KPS e D, que aparece novamente em verde. Neste immunoblot representativo, as vias de transdução de sinal de macrófagos derivados da medula óssea foram avaliadas, demonstrando que macrófagos derivados da medula óssea, como tecido, macrófagos isolados regulam positivamente os níveis de P 38 alfa da quinase fosforilada em resposta à estimulação de ESIA coli LPS.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia celular, como qual compartimento intracelular microlocalizado.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para diferenciar macrófagos da medula óssea de camundongo. O procedimento envolve a extração da medula óssea e o cultivo sob condições específicas para gerar macrófagos primários para análise experimental.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Microbiologia
Fundamentos
- Os macrófagos desempenham um papel crucial no sistema imunológico.
- Avanços recentes melhoraram a compreensão das interações macrófago-microbiota.
- Métodos para gerar macrófagos primários são essenciais para a pesquisa.
- Este estudo concentra-se em uma nova abordagem para obter macrófagos da medula óssea de camundongo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para diferenciar macrófagos da medula óssea de camundongo.
- Facilitar o estudo das funções e interações dos macrófagos.
- Fornecer uma técnica que produza um grande número de macrófagos primários.
Métodos Utilizados
- Extração da medula óssea das patas traseiras do camundongo.
- Remoção de macrófagos residentes da medula óssea.
- Cultivo de células da medula óssea sob condições de diferenciação de macrófagos.
- Utilização de microscopia confocal para analisar a localização do LPS bacteriano nos macrófagos.
Principais Resultados
- Diferenciação bem-sucedida de células da medula óssea em macrófagos.
- Demonstração da localização do LPS bacteriano nos macrófagos.
- Grandes quantidades de macrófagos primários obtidas em comparação com métodos tradicionais.
- Melhor compreensão do comportamento dos macrófagos em resposta a estímulos microbianos.
Conclusões
- O método fornece uma forma eficaz de gerar macrófagos primários.
- Essa abordagem pode ser aplicada a várias análises experimentais.
- Estudos futuros podem aproveitar esses macrófagos para explorar respostas imunológicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Obtaining primary macrophages from bone marrow enables physiologically relevant modeling of host-pathogen interactions and immune responses. This method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing scalable access to disease-relevant immune cells. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by reducing reliance on immortalized cell lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage-mediated pathways in infectious disease and inflammation models.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary macrophages for consistent target engagement studies.
- Scientific Value: Supports functional validation of immunomodulatory targets through phagocytosis and cytokine assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized macrophage populations for reproducible compound screening in immunology assays.
- Operational Value: Enables high-throughput preparation of differentiated cells for assay reproducibility across sites.
- Scientific Value: Facilitates quantitative readouts such as LPS localization and bead uptake for mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human macrophage behavior in preclinical studies of bacterial persistence and intracellular survival.
- Operational Value: Supports longitudinal infection models using pathogens like Coxiella to evaluate therapeutic candidates.
- Scientific Value: Enables biomarker-aligned readouts such as phosphorylated p38 MAPK activation in response to LPS.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, providing a scalable source of primary immune cells for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in host-pathogen interactions by enabling controlled macrophage-pathogen co-culture experiments.
- Screening: Delivers assay-ready macrophages with quantifiable outputs like internalization kinetics and signaling activation.
- Analytics: Enables confocal microscopy and flow cytometry for high-content analysis of macrophage phenotype and function.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through disease-relevant immune cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for generating primary macrophages across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive validity of immunology and infectious disease models through primary cell use.
- Operational Value: Reduces variability and enhances reproducibility in macrophage-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking target mechanisms in physiologically relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic tissue harvest and primary cell culture techniques.
- Depends on access to L929 cell supernatant or M-CSF for macrophage differentiation.
- Necessitates standardized protocols for bone marrow extraction and macrophage quantification across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to human or other species bone marrow sources.
- Limited by the need for sterile conditions and timed differentiation steps to ensure macrophage purity and yield.
