Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

O objetivo geral deste procedimento é gerar macrófagos a partir de culturas de células derivadas da urina e da medula óssea. Isso é feito primeiro extraindo a medula óssea das patas traseiras do camundongo. Na segunda etapa, os macrófagos residentes na medula óssea são removidos e, em seguida, as células da medula óssea são cultivadas em condições de diferenciação de macrófagos.

Então, quando as células da medula óssea se diferenciam em macrófagos, elas podem ser coletadas para análise experimental. Em última análise, a microscopia confocal pode ser usada para demonstrar a localização de LPS bacteriano dentro de macrófagos derivados da medula óssea, compartimentos ácidos finais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o cultivo de macrófagos, linhagens celulares, é esse grande número, de modo que os macrófagos primários podem ser obtidos.

A demonstração visual do método é crítica, pois as etapas de autoprodução são difíceis de aprender e exigem prática e, para obter sucesso, desinfete a pele de um camundongo sacrificado com 70% de etanol. Faça uma incisão na parte superior de cada pata traseira e puxe a pele para baixo em direção ao pé para expor o músculo. Em seguida, corte as patas traseiras e use tesouras e pinças estéreis.

Para remover a pele, coloque as pernas em uma placa de Petri estéril de 35 milímetros contendo cinco mililitros de gelo estéril. PBS frio. Remova qualquer pele e músculo ligado aos ossos e, em seguida, transfira os ossos para uma nova placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de gelo.

PBS frio e estéril. Lave os ossos duas vezes com mais cinco mililitros de PBS e depois transfira-os para uma argamassa estéril contendo cinco mililitros de gelo. PBS frio e estéril.

Agora corte a tíbia do fêmur na articulação e use um pilão para esmagar suavemente os ossos. Recolha o sobrenadante em tubos gelados de 15 mililitros três vezes. Em seguida, filtre a suspensão de tecido através de um filtro de células de náilon de 70 mícrons.

Para remover os fragmentos sólidos, gire o filtrado e descarte suavemente o sobrenadante. Dissocie o pellet com tampão de lise de glóbulos vermelhos, adicionando 20 mililitros de DMEM completo gelado após 30 segundos para interromper a reação após centrifugar as células, suspendemos o pellet em 20 mililitros de 37 graus Celsius, DMEM completo e, em seguida, dividimos a suspensão celular entre duas placas de Petri de 100 milímetros. Incube os pratos por quatro horas a 37 graus Celsius e, em seguida, colete os sobrenadantes em tubos de 50 mililitros em temperatura ambiente.

Depois de girar os sobrenadantes, suspenda novamente o pellet em 10 mililitros de DMEM completo suplementado com o sobrenadante de células L 9 29 previamente preparado e, em seguida, filtre as células através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons. Adicione o filtrado a 140 mililitros de DMEM completo e meio de célula L 9 29 e, em seguida, distribua 10 mililitros da suspensão celular por placa em 15 placas de Petri de 100 milímetros. Depois de incubar as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 10 mililitros de DMEM completo mais L 9 29 sobrenadante e incubar as células por mais quatro dias.

Monitorando o crescimento celular periodicamente com um microscópio invertido para colher os macrófagos derivados da medula óssea, primeiro aspirar e descartar o sobrenadante. Em seguida, lave as placas de Petri duas vezes com DMEM completo. Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM completo de 37 graus Celsius e use um policial de borracha para separar suavemente as células, colete os macrófagos derivados da medula óssea em tubos de 50 mililitros e, em seguida, gire as células.

Resus suspendendo os pellets em 20 mililitros de DMEM completo. Finalmente, conte as células por exclusão triam blue. Usando este método, um grande número de macrófagos pode ser obtido em apenas alguns dias após o isolamento e plaqueamento das células redondas da medula óssea não aderentes, menos os macrófagos residentes na medula óssea, como acabamos de demonstrar.

Essas células precursoras representativas do BMDM foram incubadas com G-M-C-S-F. Após três dias, as células começaram a aderir e se diferenciar em macrófagos. Após sete dias, foi observada uma monocamada confluente de macrófagos derivados da medula óssea.

A análise por citometria de fluxo para F quatro 80 e H-L-A-D-R revelou que os macrófagos derivados da medula óssea expressaram ambos os marcadores, confirmando a diferenciação das células da medula óssea em macrófagos. Avaliar as capacidades ácidas de PHA dos macrófagos derivados da medula óssea. A capacidade das células de internalizar as velocidades do látex foi monitorada conforme o esperado.

O número de grânulos por célula foi determinado para aumentar ao longo do tempo para avaliar seu potencial endocítico. Os macrófagos derivados da medula óssea também foram co-cultivados com Coxiella. Observou-se que o LPS do olho de Burnett em vermelho estava localizado em um compartimento que abriga a proteína de membrana associada ao lisossomo um em azul, mas não a catepsina D em verde, demonstrando que o LPS estava presente nos endossomos tardios, que são incapazes de se fundir com os lisossomos como esperado macrófagos derivados da medula óssea.

As interações bacterianas do patógeno foram analisadas por meio de sua infecção pelo olho de TMA Wiley. Como esperado, as bactérias em vermelho não estavam localizadas no compartimento que abriga KPS e D, que aparece novamente em verde. Neste immunoblot representativo, as vias de transdução de sinal de macrófagos derivados da medula óssea foram avaliadas, demonstrando que macrófagos derivados da medula óssea, como tecido, macrófagos isolados regulam positivamente os níveis de P 38 alfa da quinase fosforilada em resposta à estimulação de ESIA coli LPS.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia celular, como qual compartimento intracelular microlocalizado.