Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

O objetivo geral do experimento de queda é entregar macromoléculas sem o uso de vetores às células-alvo utilizando a perturbação mecânica. Isso é alcançado primeiramente colocando o tipo celular-alvo em suspensão com o material de entrega desejado e carregando-o no reservatório de um dispositivo microfluídico especialmente projetado. Em um segundo passo, o dispositivo microfluídico é pressurizado e as células são impulsionadas através de um conjunto de canais microfluídicos que comprimem as células para facilitar a perturbação transitória da membrana.

Em seguida, as células são mantidas em incubação na presença do material de entrega alvo para facilitar o transporte difusivo do material para o citoplasma celular. Enquanto a membrana celular é reparada, são obtidos resultados que demonstram a entrega eficaz de macromoléculas por meio da citometria de fluxo.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a transfeção e a lipofecção, é a sua capacidade de abordar tipos celulares e materiais desafiadores que não podem ser efetivamente entregues por outros métodos. Este método pode responder a questões fundamentais no campo biológico, como a forma de melhorar o reprogramamento celular. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia e o diagnóstico do câncer, porque o sistema permite a manipulação de células imunes para aumentar a sua eficácia antitumoral.

Para começar, fabrique ou adquira o dispositivo microfluídico, o suporte do dispositivo, os reservatórios plásticos de fluido e as juntas de vedação (O-rings) mostrados aqui e listados com detalhes no protocolo textual complementar, em seguida encha parcialmente três recipientes herméticos com etanol a 70%. Coloque os dispositivos no primeiro recipiente, os reservatórios e as juntas de vedação no segundo recipiente e os suportes no terceiro. Em seguida, complete o restante do volume dos recipientes com etanol a 70%.

Em seguida, coloque o recipiente que contém os reservatórios e as juntas O-ring, bem como o recipiente que contém os suportes, em um banho de ultrassom por cinco a 10 minutos antes do uso. Isso ajudará a remover quaisquer partículas contaminantes provenientes de experimentos anteriores, enquanto os componentes são submetidos à sonicação. Limpe a área de trabalho em uma cabine de segurança biológica com etanol a 70%. Em seguida, esterilize todos os materiais necessários, incluindo os três recipientes e um par de pinças, limpando-os com etanol a 70%, e coloque-os dentro da cabine de segurança biológica para iniciar a montagem.

Primeiro, coloque duas a três toalhas descartáveis de baixa geração de fiapos na área de trabalho. Em seguida, remova os reservatórios plásticos do recipiente de etanol com pinça e coloque-os sobre as toalhas para facilitar a absorção e evaporação do etanol de sua superfície interna. Bata suavemente nos reservatórios para auxiliar na remoção da solução de etanol.

Se necessário, use gás pressurizado para esvaziar completamente o reservatório. Depois que os reservatórios tiverem secado, insira as juntas toroidais nas ranhuras apropriadas nos reservatórios. Em seguida, use pinças para colocar o chip com a face voltada para cima no suporte do dispositivo.

Certifique-se de que o chip está posicionado planamente no suporte e ajuste conforme necessário usando a pinça. Se o dispositivo não se encaixar adequadamente no suporte, há risco de quebrar nas etapas subsequentes. Em seguida, coloque suavemente os reservatórios no suporte e alinhe-os com os clipes.

Certifique-se de que as juntas toroidais não saiam de seus encaixes. Durante esse processo, pressione suavemente os reservatórios até que encaixem com um clique. Certifique-se de que ambos os lados dos reservatórios estejam firmes e de que o chip pareça estar na posição correta.

Não pressione os reservatórios com força excessiva, pois a pressão poderá quebrar os chips para cultura primária ou aderência. Linhagens celulares devem ser semeadas um ou dois dias antes do experimento, de modo que apresentem no máximo 80% de confluência.

No dia do experimento. Imediatamente antes do experimento, colete as células e re-suspenda-as em meio ou outro tampão desejado na concentração de um a dez milhões de células por mililitro. Em seguida, passe cuidadosamente a suspensão celular por uma peneira de células de 40 mícrons para evitar que agregados de células e matriz entupam o dispositivo.

Após a filtração, misture 300 microlitros da suspensão celular com a concentração desejada do material de entrega em um tubo separado. Para esta demonstração, adicionam-se dois microlitros de dextrina a cinco miligramas por mililitro e dois microlitros do anticorpo controle isotópico Alexa 488 por 50 microlitros de suspensão celular.

Em seguida, misture suavemente 100 microlitros das células por pipetagem. Depois, utilizando ponteiras para carregamento de géis, pipete as células e o material de entrega em um dos reservatórios, conecte a tubulação de pressão ao reservatório preenchido e aperte com os dedos o nó para garantir um vedamento adequado. Em seguida, ajuste a pressão do ar para 70 PSI no regulador para controlar a velocidade com que as células percorrem o dispositivo.

A pressão deve ser otimizada para a combinação específica de célula e chip microfluídico utilizada em cada experimento. Com tudo preparado, eleve o dispositivo até a altura dos olhos e oriente-o de modo que o líquido no reservatório seja facilmente visível. Em seguida, pressione a válvula de botão para pressurizar o reservatório e iniciar o fluxo celular.

Observe a velocidade com que o fluido está fluindo do reservatório. Se o fluido diminuir significativamente em relação à sua taxa inicial de fluxo, o dispositivo montado provavelmente está obstruído e precisa ser substituído. O aumento da tensão de cisalhamento causado pelo bloqueio provocará uma morte celular maior que a normal.

Quando o nível do líquido estiver aproximadamente a dois milímetros do fundo do reservatório, gire rapidamente o regulador para zero PSI para interromper o fluxo. É importante interromper o fluxo de ar antes que o reservatório seja esvaziado, caso contrário a amostra poderá ser ejetada do reservatório de coleta. Em seguida, colete as células tratadas do reservatório de saída e coloque-as em um tubo de microcentrífuga.

À temperatura ambiente, as células marcadas continuarão a absorver material por até 10 minutos. Após 10 minutos, plaque as células com meio adicional ou prossiga com o uso das células conforme necessário para o experimento. Repita esses passos para coletar tantas células tratadas quanto forem necessárias e troque os chips conforme necessário se entupirem, descartando os dispositivos entupidos para cada amostra subsequente.

Altere o sentido do fluxo para minimizar os efeitos de entupimento. Ao finalizar a coleta de células, desconecte suavemente os reservatórios do suporte principal empurrando as abas do clipe para o lado. Em seguida, coloque cada peça a ser reutilizada no recipiente de armazenamento apropriado e preencha-os com etanol 70% fresco.

Por fim, coloque todos os chips usados em um recipiente separado para descarte adequado. A eficiência de entrega e a viabilidade celular de células HeLa foram medidas. Após uma série de experimentos, três chips microfluídicos diferentes foram testados em uma faixa de velocidades de até 600 milímetros por segundo.

Esses testes mostraram que velocidades de fluxo mais altas melhoraram a entrega de dextrina fluorescentemente conjugada de três kilodaltons nas células para cada um dos chips testados. Além disso, velocidades aumentadas também causaram uma queda na viabilidade celular de cerca de 20% nos dispositivos testados. Essa quantidade de morte celular é relativamente baixa e frequentemente é muito maior em dispositivos inadequadamente projetados.

A captação de dextrina conjugada com azul do Pacífico pela população de células controle mostrada à esquerda é resultado de efeitos limitados de ligação superficial e endocíticos. Como as células são expostas ao material de entrega pelo mesmo período de tempo que as células tratadas. À direita está a população de células vivas que passam pelo dispositivo microfluídico enquanto expostas à mesma concentração de dextrina que as células controle.

As células na região sombreada são consideradas não entregues, e as células à direita da linha são definidas como entregues. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de uma hora, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, vida pós-optometria podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas adicionais, como eficiência de entrega e funcionalidade do material após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de medicina regenerativa explorarem a programação celular em células primárias adultas utilizando a entrega direta de proteínas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar e operar o sistema de auto-compressão para sua aplicação desejada.