Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

O objetivo geral do experimento de queda é fornecer macromoléculas livres de vetores para as células-alvo usando interrupção mecânica. Isso é conseguido colocando primeiro o tipo de célula-alvo em suspensão com o material de entrega desejado e carregando no reservatório de um dispositivo microfluídico especialmente projetado. Como segunda etapa, o dispositivo microfluídico é pressurizado e as células são conduzidas através de uma série de canais microfluídicos que comprimem as células para facilitar a ruptura transitória da membrana.

Em seguida, as células podem incubar na presença do material de entrega alvo para facilitar o transporte difusivo do material para o citoplasma da célula. Enquanto a membrana celular é reparada. Obtém-se resultados que mostram a entrega efetiva de macromoléculas através do uso de citometria de fluxo.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como ação e lipoperfeição, é que ela é capaz de lidar com tipos de células e materiais desafiadores que não podem ser efetivamente fornecidos por outros métodos. Este método pode responder a questões-chave no campo biológico, como como melhorar a reprogramação celular. As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico do câncer, pois o sistema permite a manipulação de células imunes para aumentar sua eficácia antitumoral.

Para começar, fabrique ou compre o dispositivo microfluídico, o suporte do dispositivo, os reservatórios de fluido plástico e os anéis de vedação mostrados aqui e listados com detalhes no protocolo de texto que o acompanha, encha três recipientes seláveis parcialmente com etanol a 70%. Coloque os dispositivos no primeiro recipiente, os reservatórios e anéis de vedação no segundo recipiente e os suportes no terceiro. Em seguida, encha os recipientes o resto do caminho com etanol 70%.

Em seguida, coloque o recipiente contendo os reservatórios e O-rings, bem como aquele que contém os suportes em um banho de ultrassom por cinco a 10 minutos antes do uso. Isso ajudará a remover quaisquer partículas contaminantes de experimentos anteriores, enquanto o sonicado componente limpa o espaço de trabalho em um gabinete de biossegurança com 70% de etanol. Em seguida, esterilize todos os materiais necessários, incluindo os três recipientes e uma pinça, limpando-os com etanol 70% e coloque-os dentro do gabinete de biossegurança para iniciar a montagem.

Primeiro, coloque dois a três lenços umedecidos na área de trabalho. Em seguida, remova os reservatórios de plástico do recipiente de etanol com uma pinça e coloque-os nos lenços para facilitar a absorção e a evaporação do etanol de sua superfície interna. Bata suavemente nos reservatórios para auxiliar na remoção da solução de etanol.

Se necessário, use gás pressurizado para purgar totalmente o reservatório. Depois que os reservatórios estiverem secos, insira os anéis de vedação nas ranhuras apropriadas nos reservatórios. Em seguida, use uma pinça para colocar o chip voltado para cima no suporte do dispositivo.

Certifique-se de que o chip esteja plano no suporte e ajuste, se necessário, usando a pinça. Se o dispositivo não se encaixar corretamente em seu suporte, existe o risco de quebrar durante as etapas subsequentes. Em seguida, coloque cuidadosamente os reservatórios no suporte e alinhe-os com os clipes.

Certifique-se de que os anéis de vedação não caiam de suas ranhuras. Durante este processo, pressione suavemente os reservatórios até que eles se encaixem no lugar. Certifique-se de que ambos os lados dos reservatórios estejam seguros e que o chip pareça estar na posição correta.

Não pressione os reservatórios com força excessiva. Como a pressão pode quebrar os chips para primário ou adesão. Linhagens celulares, coloque as células um a dois dias antes do experimento para que não sejam mais do que 80% confluentes.

No dia do experimento. Imediatamente antes do experimento, colha as células e resus, suspenda-as em meio ou outro tampão desejado entre um e 10 milhões de células por mililitro. Em seguida, passe cuidadosamente a suspensão celular por uma malha de filtro de células de 40 mícrons para evitar aglomerados de células e matriz

Uma vez coado, misture 300 microlitros da suspensão celular com a concentração desejada de material de entrega em um tubo separado. Para esta demonstração, dois microlitros de dextrina a cinco miligramas por mililitro e dois microlitros de Alexa. 4 88 anticorpos de controle de isótopos são adicionados por 50 microlitros de suspensão celular.

Em seguida, misture suavemente 100 microlitros das células pipetando. Em seguida, usando pontas de carregamento de gel, pipete as células e o material de entrega em qualquer um dos reservatórios, conecte a tubulação de pressão ao reservatório cheio e aperte o nó com os dedos para garantir o teto adequado. Em seguida, ajuste a pressão do ar para 70 PSI no regulador para controlar a velocidade com que as células viajam pelo dispositivo.

A pressão deve ser otimizada para a combinação específica de célula e chip microfluídico usada em cada experimento. Com tudo preparado, levante o dispositivo até o nível dos olhos e oriente-o para que o líquido no reservatório seja facilmente visível. Em seguida, pressione a válvula de botão para pressurizar o reservatório e iniciar o fluxo da célula.

Observe a velocidade com que o fluido está fluindo do reservatório. Se o fluido diminuir substancialmente em relação à sua taxa de fluxo inicial, o dispositivo montado provavelmente está entupido e precisa ser trocado. O aumento do cisalhamento causado pelo bloqueio causará uma morte celular maior do que o normal.

Quando o nível do líquido estiver a aproximadamente dois milímetros do fundo do reservatório, gire rapidamente o regulador para zero PSI para interromper o fluxo. É importante interromper o fluxo de ar antes que o reservatório seja esvaziado, ou a amostra pode ser ejetada do reservatório de coleta. Em seguida, colete as células tratadas do reservatório de saída e coloque-as em um tubo de microcentrífuga.

À temperatura ambiente, as células nominais continuarão a absorver material por até 10 minutos. Após 10 minutos, coloque as células em placas com meios adicionais ou continue a usar as células de acordo com as necessidades experimentais. Repita essas etapas para coletar quantas células tratadas forem necessárias e troque os chips conforme necessário se eles entupirem e descartar os dispositivos entupidos C para cada amostra subsequente.

Altere a direção do fluxo para minimizar os efeitos de entupimento. Quando terminar de coletar as células, desconecte cuidadosamente os reservatórios do suporte principal empurrando os braços do clipe para o lado. Em seguida, coloque cada peça a ser reutilizada no recipiente de armazenamento apropriado e encha-as com etanol 70% fresco.

Por fim, coloque todos os chips usados em um recipiente separado para descarte adequado. A eficiência de entrega e a viabilidade celular das células hela foram medidas. Após uma série de experimentos, três chips microfluídicos diferentes foram testados em uma faixa de velocidades de até 600 milímetros por segundo.

Esses testes mostraram que o aumento da velocidade de fluxo melhorou a entrega de dextrina de três quilodaltons conjugada com fluorescência nas células para cada um dos chips testados. Além disso, o aumento das velocidades também fez com que a viabilidade celular caísse cerca de 20% nos dispositivos testados. Essa quantidade de morte celular é relativamente baixa e geralmente é muito maior em dispositivos projetados de forma inadequada.

A absorção da dextrina conjugada com azul do Pacífico na população de células de controle mostrada à esquerda é o resultado de efeitos endocíticos e de ligação superficial limitados. Como as células são expostas ao material de entrega pelo mesmo período de tempo que as células tratadas. À direita está a população de células vivas que passam pelo dispositivo microfluídico enquanto expostas à mesma concentração de dextrina que as células de controle.

As células na região sombreada são consideradas não entregues e as células à direita da linha são definidas como entregues. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de uma hora se for executada corretamente. Seguindo este procedimento, outros métodos, a optometria pós-vida podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como eficiência de entrega e funcionalidade do material após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da medicina regenerativa explorarem a programação celular em células primárias adultas usando a entrega direta de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e operar o sistema de autocompressão para a aplicação desejada.