O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em Drosophila Larvas
7 de fevereiro de 2014
Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado "chip larva 'para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila.
O objetivo geral do experimento a seguir é imobilizar larvas de drosófila de forma não invasiva para imagens ao vivo usando uma câmara microfluídica modificada. Um terço em larvas de estrela é posicionado no chip com um pouco de óleo para ajudar a selar as larvas. Em seguida, o chip é colocado em cima das larvas de forma que seu corpo caiba dentro da câmara.
O chip é conectado a uma seringa para que um vácuo possa ser aplicado. A motilidade das larvas torna-se restrita e as estruturas na parte ventral do animal são empurradas para perto da lamínula. Usando um microscópio confocal, as estruturas são facilmente visualizadas, como os detalhes dos terminais do axônio do neurônio sensorial e a regeneração dos nervos segmentares após danos induzidos nos nervos.
Outros métodos para imobilizar josepha para imagens ao vivo, éter clorofórmio enorme ou anestésicos ISO. A principal vantagem dessa técnica é que ela evita a enorme quantidade de toxinas, que interferem na fisiologia do animal. E o benefício adicional da ausência de toxinas é que a larva GB segura e para trabalhar com A imobilização robusta permite a imagem de eventos rápidos, como transporte axonal mais rápido e alterações no cálcio intracelular.
Uma única larva pode ser imobilizada e fotografada no chip várias vezes. Isso permite que o tempo viva. Imagens de processos que ocorrem ao longo de até 72 horas Comece obtendo um chip PDMS de amostra para experimentar este protocolo.
As instruções sobre como fazer o chip APDMS a partir de um molde SU oito podem ser lidas no protocolo de texto usando uma agulha dispensadora de calibre 21. Faça um furo na porta de vácuo do chip PDMS para um microscópio invertido. Remova uma agulha de calibre 23 de sua base, o cubo de trava usando algumas torções.
Em seguida, insira a ponta da agulha em um pequeno pedaço de tubo de polietileno para que o tubo cubra pelo menos um milímetro da agulha. Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de tubo. Isso deixa um anel de plástico que pode fazer uma vedação.
Insira a ponta da agulha de calibre 23 no orifício da porta de vácuo. Para um microscópio vertical, faça um segundo orifício na lateral do chip PDMS com uma agulha dispensadora de calibre 21. Este orifício fornecerá acesso ao primeiro orifício lateral.
Em seguida, insira a ponta da agulha de calibre 23 e o anel do tubo no orifício lateral. Coloque um pedaço de fita dupla-face sobre a parte superior do chip PDMS para selar o orifício superior. Conecte um tubo de polietileno de 20 centímetros de comprimento entre a ponta da agulha inserida na porta de vácuo do chip e uma das portas de uma válvula de três vias.
Em seguida, conecte uma seringa de 20 mililitros em uma das duas portas restantes da válvula, deixando a última porta aberta. Limpe o chip PDMS com fita adesiva transparente. Prenda um pedaço de fita adesiva na parte inferior do chip.
Certifique-se de que a fita esteja tocando toda a superfície do PDMS e, em seguida, retire a fita. Repita este método de limpeza três vezes. Como o chip PDMS é reutilizável, é muito importante remover os resíduos de óleo, pois pode afetar a adesão do PDM ao vidro Transferência precoce de forrageamento.
Larvas de terceiro ínstar do alimento para uma placa de Petri contendo água. Deve ter entre 3,5 e quatro milímetros de comprimento para caber corretamente no chip. Banhe as larvas para remover o meio de cultura.
Em seguida, joga uma pequena gota de óleo de halo carbono 700 no centro de uma lamínula de vidro usando uma pinça para pegar suavemente uma larva lavada. Coloque-o brevemente em um lenço leve para enxugá-lo com uma toalha e, em seguida, mova-o para o óleo por 10 segundos. A gota deve ser pequena o suficiente para que a traqueia das larvas não seja revestida.
Em seguida, coloque as larvas em uma lamínula de vidro limpa brevemente e mova-a para outra lamínula. Removendo assim um pouco mais de óleo. Preste atenção à orientação das larvas para obter imagens do cordão neural e dos nervos segmentares.
O lado ventral deve estar voltado para baixo. Os tubos traqueais prontamente identificados devem estar para cima. Agora coloque delicadamente o chip PDMS em cima das larvas.
Alinhe as larvas ao centro da microcâmara. Com a parte posterior orientada para a porta de vácuo, a larva não deve tocar as bordas da câmara. Uma vez alinhado, empurre o chip PDMS contra a lamínula da tampa de vidro para obter uma boa vedação.
Em seguida, verifique se as larvas estão totalmente fechadas na microcâmara. Agora mude a válvula de três vias para a seringa. Segure o conjunto PDMS com firmeza e puxe o êmbolo da seringa para retirar de dois a 2.5 milímetros de ar até sentir resistência.
Criando assim um vácuo. Em seguida, desligue a válvula. Para manter o vácuo com cuidado, verifique novamente as larvas.
Seu corpo deve ser imobilizado dentro da microcâmara e a traqueia deve ser visível. O resto do chip PDMS deve estar em contato com a lamínula Orientações como essas não estão corretas. Agora imagine as larvas.
Se estiver usando um microscópio vertical, fixe a parte superior do chip no palco com fita dupla-face. Quando a imagem estiver concluída, solte o vácuo. Em seguida, retire o chip PDMS da lamínula.
A larva deve ser imediatamente móvel usando uma pinça. Retorne as larvas a um prato de ágar suco de uva para recuperação. Coloque uma única larva anestesiada em um prato de ágar suco de uva.
Sob o microscópio estéreo, vire o lado ventral do animal para cima. Para visualizar o cordão nervoso ventral e os nervos segmentares, certifique-se de que a larva esteja completamente imóvel. Localize o cordão nervoso e as glândulas salivares.
É importante não danificar essas estruturas. Localize a extremidade do terceiro segmento abdominal. A lesão aqui danifica a maioria dos nervos e é a mais fácil de reproduzir sem matar o animal.
A lesão também pode ser realizada em segmentos mais posteriores usando uma estrela dupla número cinco, fórceps. Aperte os nervos segmentares firmemente através da cutícula por cinco a 10 segundos. Quando feito corretamente, a cutícula permanece intacta e a parede do corpo não é perfurada.
A maestria exigirá prática depois que a lesão colocar o lado ventral do animal para baixo na grande placa. Deve ser capaz de mover a cabeça e comer. Se a lesão for bem-sucedida, a metade posterior das larvas ficará paralisada.
O chip de larva foi usado para visualizar o transporte mediado por cinesina de vesículas sinápticas dentro de axônios periféricos individuais. O movimento de grau entero dessas vesículas foi medido em cerca de 1,0 mícrons por segundo. O movimento retrógrado foi cronometrado em 0,8 mícrons por segundo.
A técnica de imobilização foi utilizada para microcirurgia a laser usando um laser de corante UV pulsado. Os níveis de cálcio foram observados em neurônios específicos graças a um indicador geneticamente codificado. G camp 3.0 um pico de cálcio é detectado após um neurônio sensorial.
O dendrito é seccionado. Permitir que o animal descanse entre as sessões de imagem permite que os eventos celulares sejam visualizados ao longo do tempo. Depois de esmagar os axônios dos neurônios motores eméricos, o coto do axônio proximal sofreu nova brotação.
Enquanto isso, os axônios distais formaram varicosidades e se fragmentaram através do processo de degeneração walleriana. Também é possível usar o chip de larva rastreando proteínas fluorescentes convertidas por foto in vivo. Uma proteína de fusão DRA duas alfa tubulina expressa em neurônios sensoriais de classe quatro foi fotoconvertida nos corpos celulares.
Em dois dias, uma quantidade significativa de proteína fotoconvertida foi realocada para os terminais axônicos dos neurônios sensoriais a cerca de um milímetro de distância do local original no corpo celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar o chip de larvas para imagens ao vivo de larvas de drosófila e como conduzir uma lesão por esmagamento de nervo. Uma vez que essas técnicas são dominadas, as larvas podem ser posicionadas no microscópio em apenas alguns minutos.
O esmagamento do nervo é tão rápido quanto. Portanto, esses procedimentos podem ser utilizados para experimentos em larga escala, como graus genéticos. O chip pode ser utilizado para obter imagens de estruturas no lado ventral das larvas de drosófila.
Estes incluem, mas não estão limitados a músculos, sinapses da junção neuromuscular, neurônios sensoriais, nervos periféricos e cordão nervoso ventral. Este procedimento também pode ser usado para realizar imagens ao vivo do coração larval, glândulas salivares e traqueia. O chip de larva usado neste vídeo é dimensionado para animais entre 3,5 e quatro milímetros de comprimento.
Para imagens menores ou maiores, chips de animais com uma câmara menor ou maior podem ser facilmente feitos. Consulte o arquivo de design suplementar e as instruções para fazer chips PDMS. As instruções para fazer os chips PDMS estão incluídas no protocolo escrito.
Podemos enviar-lhe um chip de amostra se você entrar em contato conosco.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para imobilizar larvas de Drosophila de forma não invasiva para imageamento em tempo real, utilizando uma câmara microfluídica modificada. A técnica permite a observação de processos celulares em neurônios, particularmente no contexto de transporte axonal e regeneração nervosa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Técnicas de Imagem em Tempo Real
Antecedentes
- As larvas de Drosophila são um modelo valioso para o estudo de processos neuronais devido à sua transparência e manipulabilidade genética.
- A imagem em tempo real pode fornecer informações sobre eventos celulares dinâmicos em tempo real.
- Métodos tradicionais de imobilização geralmente envolvem anestésicos prejudiciais que podem afetar a fisiologia.
- Este protocolo tem como objetivo oferecer uma alternativa mais segura para a obtenção de imagens, sem o uso de substâncias tóxicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método não invasivo para imobilizar larvas de Drosophila para obtenção de imagens.
- Facilitar a observação de estruturas e processos neuronais.
- Permitir a realização de imagens repetidas da mesma larva ao longo de períodos prolongados.
Métodos Utilizados
- Utilização de um dispositivo microfluídico de PDMS para imobilizar larvas.
- Aplicação de vácuo para restringir a motilidade larval.
- Obtenção de imagens por microscopia confocal para visualizar estruturas neuronais.
- Preparação detalhada do chip de PDMS e posicionamento das larvas para imagem ideal.
Resultados Principais
- Imobilização bem-sucedida de larvas sem o uso de anestésicos tóxicos.
- Obtenção de imagens nítidas dos terminais axonais de neurônios sensoriais e da regeneração de nervos segmentares.
- Capacidade de realizar imagens em lapso de tempo durante 72 horas.
- Demonstração do transporte mediado por quinesina de vesículas sinápticas.
Conclusões
- A câmara microfluídica modificada fornece um método seguro e eficaz para a imagem em tempo real de larvas de Drosophila.
- Essa abordagem permite o estudo de eventos neuronais rápidos e processos de recuperação.
- O protocolo pode ser adaptado para diversas aplicações de imagem na pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O imobilização não invasiva de organismos modelo permite a obtenção de imagens longitudinais de processos celulares dinâmicos sem interferentes farmacológicos, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos. O chip para larvas facilita sessões repetidas de imagem ao longo de 72 horas, permitindo a avaliação do transporte axonal, das respostas a lesões e da regeneração em um sistema fisiologicamente relevante. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao preservar a biologia nativa durante a observação da dinâmica neuronal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização direta do transporte axonal e da sinalização de cálcio em neurônios.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a realização repetida de imagens no mesmo larva para avaliar o engajamento do alvo e a modulação da via ao longo do tempo.
- Valor Preditivo: Fornece leituras quantitativas do tráfego de organelas e das respostas induzidas por lesão, aumentando a confiança no alvo no descobrimento em neurociência.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente ao imobilizar larvas para obtenção de imagens de alta resolução e consistentes de estruturas ventrais.
- Reprodutibilidade: Permite a preparação e vedação padronizadas de larvas em microcâmaras de PDMS, reduzindo a variabilidade em ensaios de imagem em tempo real.
- Escalabilidade: Facilita ciclos rápidos de imobilização e aquisição de imagens, permitindo a avaliação em média escala de perturbações genéticas ou farmacológicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela processos de lesão e regeneração axonal relevantes para mecanismos de doenças neurodegenerativas.
- Continuidade Translacional: Conecta o imagemamento de descoberta com a validação pré-clínica ao permitir estudos temporais da degeneração walleriana e brotamento axonal.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir/não prosseguir ao quantificar respostas regenerativas versus degenerativas frente à lesão por esmagamento do nervo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O chip de larva integra-se a fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a imagem em tempo real de processos neuronais antes da identificação do composto líder, apoiando a testagem de hipóteses e a clarificação de vias em modelos baseados em Drosophila.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da imagem direta do transporte de vesículas mediado por quinesina e dos fluxos de cálcio em neurônios sensoriais.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de imobilização reprodutível e proximidade do lado ventral com a lamínula, permitindo imagens consistentes.
- Análises: Permite a medição quantitativa das taxas de transporte axonal (1,0 µm/s anterógrado, 0,8 µm/s retrógrado) e a detecção de picos de cálcio utilizando indicadores geneticamente codificados.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com trabalhos pré-clínicos ao modelar respostas a lesões axonais, incluindo brotamento e fragmentação, ao longo de períodos prolongados.
- Reutilização Empresarial: Posiciona o chip microfluídico de PDMS como uma plataforma reutilizável para estudos longitudinais em múltiplas sessões experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao permitir a observação de eventos neuronais rápidos sem interrupção fisiológica induzida por anestésicos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da padronização da preparação do chip, imobilização baseada em vácuo e protocolos de limpeza para prevenir interferência por resíduos de óleo.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir o reuso repetido de larvas individuais, reduzindo o número de animais necessários para estudos longitudinais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco mediante imagem quantificável de métricas de degeneração e regeneração após lesão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de dispositivos microfluídicos, operação de sistema a vácuo e microscopia confocal para obtenção de imagens ideais.
- Depende do acesso a ferramentas para moldagem de PDMS, portas de vácuo baseadas em seringas e tubos de polietileno para vedação e conexões fluídicas.
- Necessita padronização entre equipes no preparo das larvas, aplicação de óleo e alinhamento da câmara para garantir imobilização consistente.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos larvais, exigindo ajustes nas dimensões do chip com base no comprimento corporal (3,5–4 mm para o chip padrão).
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de evitar o revestimento com óleo nas traqueias e garantir a orientação correta com o lado ventral para visualização da cadeia nervosa.
