Name: O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em Drosophila Larvas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprenda a imobilizar larvas de Drosophila sem anestésicos tóxicos usando câmaras microfluídicas de PDMS. Este método permite imagens ao vivo de neurônios, transporte axonal e regeneração nervosa por até 72 horas.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, (número de concessão IOS-0842701 para CAC) e do Instituto Nacional de Saúde (R00MH080599 a BY, R21 NS062313 a NC, e NS069844 para CAC). Gostaríamos de reconhecer James Schutt, Emily Han, e Leni Truong para suporte técnico, eo Banco Centro Bloomington para linhas de voar. Todos os chips foram fabricados no Centro de Lurie Nanofabricação da Universidade de Michigan.

1. Fazer o Chip PDMS Para fazer com que um chip de PDMS do molde SU-8, siga os passos de 1,1-1,7. Se um chip é na mão, mas precisa montado para uso, pule para o passo 1.8. <ol><li> Misture 45 g de base de PDMS e 4,5 g de agente (proporção 10:1) a cura de um kit de PDMS em um pequeno recipiente de plástico descartável e misture-os cuidadosamente, com uma vareta de plástico. </li><li> Colocar o recipiente num recipiente de vácuo (por exemplo, um secador) durante 10 minutos para remover quaisquer bolhas. </li><li> Coloque o molde SU-8, na parte inferior de um diâmetro de 150 mm de prato plástico e verter lentamente a mistura de PDMS no molde. Tome cuidado para não gerar bolhas ao derramar o PDMS. </li><li> Curar o PDMS no forno (ou um incubador) a 650 ° C durante 4 h. </li><li> Retire o molde PDMS/SU-8 curado do forno e deixe esfriar por alguns minutos. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar o PDMS curados ao longo da borda do molde SU-8 e retirá-la da SU-8 molde. </li><li> Divida a laje PDMSPDMS em fichas individuais, usando uma lâmina de barbear. </li><li> Usando uma agulha de distribuição de 21 L, fazer um buraco na porta de vácuo (ilustrado na Figura 1A) do chip de PDMS. </li><li> Dê uma distribuição agulha 23 G e torça a ponta da agulha de sua base algumas vezes para quebrar a agulha ponta fora do cubo de bloqueio. </li><li> Inserir a agulha da ponta 23 L em um pequeno pedaço de tubo de polietileno de modo a que o tubo de cobre, pelo menos, um milímetro da agulha. Em seguida, utilizar uma lâmina de barbear para cortar o excesso de tubo para longe da agulha. Isto cria um anel de plástico em torno de uma extremidade da agulha, o que vai criar um selo, quando inserido na porta de admissão de vácuo. </li><li> Para uso com um microscópio invertido (Figuras 1B e 2A-B): inserir a ponta de agulha 23 G no orifício do canal de vácuo. Para uso com um microscópio vertical (Figuras 1C e 2C-D): picar um segundo furo no lado do chip PDMS com uma dispe 21 Lnsing agulha, o buraco vai fornecer acesso para o primeiro buraco do lado. Em seguida, insira a agulha ponta 23 G com anel de tubulação no orifício lateral. Coloque um pedaço de fita adesiva de dupla face sobre a parte superior do chip PDMS para vedar o orifício superior (Figura 1C). </li><li> Pegue um pedaço de tubo de polietileno que é de aproximadamente 20 cm de comprimento. Conectar um lado do tubo para a ponta da agulha que é inserida dentro do orifício de vácuo. </li><li> Conecte o outro lado da tubulação para uma das portas de uma válvula de 3 vias (ver &#39;3-way torneira &#39;na lista de materiais) </li><li> Anexar uma seringa de 20 ml em uma das duas portas restantes. A última porta é aberta para o ambiente. </li></ol> 2. Usando o Chip Zergling de Imagens ao vivo <ol><li> Limpe o chip PDMS com fita adesiva transparente. Fixe um pedaço de fita para o fundo do chip. Verifique se a fita está tocando toda a superfície de PDMS e, em seguida, retire a fita. </li><li> Repita o passo acima de 2 a 3 vezes para garantir que nãoexistem partículas de óleo (ou retidos a partir de experiências anteriores) sobre a superfície do chip PDMS. Uma vez que o chip PDMS é reutilizável, isto é muito importante para remover os resíduos de óleo, uma vez que podem afectar a adesão do PDMS de vidro e resultar em selagem inadequada. </li><li> A transferência precoce (isto é forrageamento) larvas 3 º a uma placa de Petri contendo água. (O rd larvas fase A alimentar 3 instar são os alimentos, ao invés de a parede do frasco de cultura). Lavar os larvas em água para remover o meio de cultura. </li><li> Dê uma lamela de vidro limpa e coloque uma pequena gota de óleo halocarbônico 700 em seu centro. </li><li> Utilizando uma pinça, escolher com cuidado um limpo, early-encenado 3 º instar larva da água (a larva deve ser ~ 3,5-4 mm de comprimento). Colocar o animal brevemente em um leve limpa ou papel toalha para remover o excesso de água, e, em seguida, coloque-o sobre a queda do petróleo. A redução deve ser suficientemente pequeno de tal modo que a traqueia de larvas não são revestidos. Deixe o sta larvay sobre a gota de óleo por 10 segundos. </li><li> Retire a larva da gota de óleo e, em seguida, coloque-o sobre uma lamela de vidro limpo. </li><li> Transfira a larva para outra lamela de vidro limpo. Esta etapa remove o excesso de óleo. </li><li> Preste atenção à orientação larva. For Imaging o cabo e os nervos segmentares neurais, o lado ventral de larva deve sentar-se na lamela. Seu lado dorsal, caracterizada por dois tubos traqueais longitudinais, deve estar voltado para cima. Nota: esta é a orientação da larva prefere naturalmente. </li><li> Suavemente colocar o chip PDMS no topo da larva. A larva deve estar alinhado ao meio centro da MicroChamber, com a cauda voltada para a porta de vácuo. Tenha cuidado para que a larva não toque nas bordas da câmara. Isto é especialmente importante para os terminais anterior e posterior da traqueia. Nota: este passo é o melhor feito sob microscópio estereoscópico. </li><li> Empurre o chip PDMS contra a lamela de vidro para conseguir uma boa vedação. Certifique-se de que a larva é totalmentedelimitada pela MicroChamber quando o chip PDMS está tocando a lamela de vidro. </li><li> Alternar a válvula de 3 vias em tais que a seringa pode extrair o ar da microcâmara de PDMS (através da tubagem) para criar um vácuo. </li><li> Com uma mão, segure a lamela chip de PDMS / vidro com firmeza. Use a outra mão para puxar o êmbolo da seringa. Retire 2-2,5 ml de ar, até sentir resistência no punho seringa, para criar vácuo. O vácuo produz um vedante estanque entre o chip de PDMS, óleo, e interfaces de lamela e restringe a mobilidade da larva. </li><li> Alternar a válvula de modo a que o chip PDMS é isolado a partir da seringa e do ambiente. Como resultado, o nível de vácuo relativamente estável é mantida na microcâmara, sem a necessidade de segurar o êmbolo da seringa. </li><li> Verifique a larva sob o estereoscópio para certificar-se que a totalidade do corpo do animal é colocado no interior da microcâmara, e que o animal permanece imóvel. A traquéia deve ser visível. O resto doChip de PDMS deve estar em contato com a lamela. Nota: Ver Figuras 2E e 2F para exemplos de animais corretamente imobilizadas no chip. Algumas orientações incorretas são mostrados nas Figuras 2G e 2H. </li><li> Colocar o chip larva (chip PDMS + lamela de vidro) sobre o microscópio. O chip de larva, a tubulação ea seringa deve ser manuseado com cuidado para evitar desprendimento do chip PDMS da lamela. Para um microscópio vertical, fixe o lado &#39;top&#39; do chip para o palco microscópio com fita dupla face (Figura 1C). </li><li> Utilize uma objectiva de grande ampliação (de imersão em óleo, 40-63X é recomendado) para localizar a estrutura (s) do animal de interesse e realizar a imagem. Em alguns casos, um aumento inferior pode ser necessária para identificar a região desejada para imagiologia antes de mudar para uma ampliação maior. </li><li> Quando imagem está completado, libertar o vácuo pela comutação da válvula para a posiçãoque é aberto para o ambiente. </li><li> Retire o chip PDMS da lamela. A larva deve ser imediatamente móveis. </li><li> Fórceps para remover a larva da microcâmara e colocar gentilmente a larva em uma placa de agar de uva-suco para recuperação. </li></ol> 3. Induzir uma lesão do nervo esmagamento de nervos larval segmentares <ol><li> Siga o passo 2.3 para isolar cedo encenado 3 ª larvas do genótipo desejado. Tal como descrito no passo 2.3 banhar as larvas em água para remover o alimento. </li><li> Use uma mosca CO 2 estação anesthetization padrão, com CO 2 pad mantidos sob um microscópio estereoscópico dissecação, para subjugar as larvas. As larvas devem se tornar immotile após a colocação em CO 2 pad para 1-2 min. </li><li> Agora coloque uma única larva anestesiado em uma placa de ágar suco de uva sob o microscópio estereoscópico. Vire animais lado ventral até visualizar o cordão nervoso ventral e segmentar os nervos através da cutícula ( <strong&gt; Figura 3). Certifique-se de que a larva é completamente imóveis. </li><li> Usando Dumostar número 5 fórceps, beliscar os nervos segmentares firmemente através da cutícula para 5-10 seg. Quando isto é feito correctamente, a cutícula permanece intacta e a parede do corpo não é perfurada. Nota: A lesão pode ser realizada em diferentes posições ao longo do eixo ântero-posterior do corpo, enquanto o cabo de nervo ventral, glândulas salivares, intestino e não está danificado. O local da lesão é mais eficaz para o fim do segmento abdominal 3 rd, como mostrado na Figura 3D. Lesão neste local danos a maioria dos nervos e é o mais fácil de se reproduzir sem matar o animal. </li><li> Após a lesão, gire o animal para que seu lado ventral para baixo a placa de uva. Ele deve ser capaz de mover a cabeça e comer. Se a lesão foi bem sucedida, então a metade posterior da larva será paralisado. </li><li> Manter os animais feridos na placa de ágar suco de uva a 25 e# 176; C para o tempo desejado de acordo com o objetivo experimental. Para motoneurônios, o coto proximal começa a brotar dentro de 8-10 horas de lesão 14, e do coto distal começa a degenerar dentro de 6-8 hr 15. Para a classe IV da neurônios sensoriais, o coto proximal começa a brotar dentro de 4-6 horas, eo início do coto distal a degenerar dentro de 3-4 horas após a lesão. Nota: com drivers adequados Gal4 e repórteres fluorescentes, o surgimento e degeneração pode ser observado no chip larva (por exemplo, ver a Figura 6). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Fazer ou obter o chip larva: O chip larva consiste num bloco de PDMS (denominado o &quot;chip PDMS &#39;) ligado a uma lamela de vidro. O protocolo no passo 1 descreve o procedimento para fazer e usar chips de larva, assumindo um molde de SU-8 está disponível. O molde SU-8 é microfabricados por photolithographically padronização uma espessa camada de SU-8 photoresist 140 mM em uma pastilha de silício (para detalhes, ver 12 Ghannad-Rezaie et al.). Como a microfabricação do molde SU-8 exige o acesso a equipamento especializado, recomendamos requisitá-lo a partir de uma instalação de microfabricação (por exemplo. A facilidade LNF na Universidade de Michigan 14), ou a partir de uma fundição, enviando-lhes o design de chips que é fornecido como arquivo suplementar. Se alguém deseja mudar o design do chip PDMS (por exemplo, para uso com larvas de diferentes tamanhos), um software CAD que lida com arquivos DXF (ex. Autocad) pode ser usado. Uma SU-8 molde também pode ser feita em casa seguindo as instruções na Mondal et al. 27 Muitos leitores podem achar que é conveniente para simplesmente obter um chip PDMS amostra para experimentar a técnica antes de fabricar seus próprios chips. Este será disponibilizado gratuitamente, mediante solicitação. O uso do micro &quot;chip larva&quot; para imagens ao vivo: O método de imobilização no chip larva evita a utilização de anestésicos, e envolve, em vez da pressão, através da aplicação de um vácuo, para restringir o movimento do animal. Enquanto os animais podem sobreviver imobilização no chip para várias horas de 12, um período curto de imobilização (5-15 min) é recomendado. Isso é tempo suficiente para a imagem de muitos eventos celulares de interesse, incluindo alterações de cálcio intracelular, ou transporte axonal rápido. Este também é o tempo suficiente para manipulações desejados em animais vivos, como base de laser microcirurgia, fotodegradação e photoconverSion. Para estudar eventos longitudinalmente ao longo de um período de tempo maior em um único animal, os animais podem ser colocados no chip e fotografada várias vezes, separadas por períodos de repouso. Placas de ágar suco de uva são ideais para o descanso entre as sessões de imagem, uma vez que proporcionam uma fonte de alimento fácil e umidade. Várias sessões de imagem afetam a sobrevivência larval até certo ponto, uma vez que cada sessão acarreta alguns riscos para danificar o animal (ver parte 2 na solução de problemas, abaixo). Os animais podem ser rotineiramente fotografada&gt; 5 vezes ao longo de dois dias, com uma taxa de sobrevivência superior a 50%. Uma vez que os animais não são anestesiados, são saudáveis ​​e móveis imediatamente após a libertação do vácuo no chip. Assim, não há necessidade de tempo de recuperação entre as sessões de imagem, de modo que o espaçamento de tempo entre as sessões é flexível e pode ser ajustada para os objetivos do experimento. Solução de problemas: A técnica mais comum éprocessa com chip de larva e soluções recomendadas são as seguintes: (1) O animal está se movendo muito. Muita mobilidade pode interferir com os objetivos de imagem. As razões mais comuns para este no chip larva são a) o animal é muito pequeno para o chip, ou b) a pressão de vácuo aplicado durante a fase de imobilização está comprometida. O chip larva descrita neste protocolo é projetado para o início de encenou larvas 3 º. O tamanho ideal para o animal é 3,5-4 mm de comprimento (ao longo do eixo ântero-posterior). Para garantir que a pressão de vácuo é suficiente puxar a seringa 2-2,5 ml, ou até se sentir resistência no punho. Uma indicação de que o vácuo está em funcionamento é que pequenas bolhas no canal de perímetro pode ser visto movendo lentamente para a fonte de vácuo. Outra indicação é que a lamela deve sempre viajar com o chip quando o chip é levantada a partir do topo (e este é o método recomendado para o transporte da câmarauma vez que as larvas é posicionada e o vácuo é ligado). O vácuo pode ser comprometida se há fissuras no tubo, ou se houver óleo na tubagem. Isto pode ser facilmente resolvidas por substituição do 23 L de distribuição de ponta de agulha e de polietileno de 50 tubos (de passos 1,6-1,14). (2) O animal morre depois de imagem no chip. O processo destina-se a causar o mínimo de stress sobre o animal, e animais de genótipo de tipo selvagem tem uma taxa de sobrevivência de&gt; 90%, mesmo após uma hora de imobilização sobre o chip 12. Uma vez que alguns genótipos podem ser menos resistentes ao estresse do chip, verifique primeiro que tipo selvagem animais (por exemplo, Canton S) sobreviver à técnica de imobilização. a) A causa mais comum para a letalidade é o posicionamento incorreto da larva (ver Figuras 2G-H). Se partes da cutícula, cabeça ou traquéia não são inteiramente dentro da câmara, então eles podem ser danificados durante a imobilização, e umalarva que é demasiado grande para o chip (&gt; 4 mm) é menor probabilidade de sobrevivência. b) Uma causa menos comum para a letalidade é a utilização de um excesso de pressão ou de vácuo, quando o carregamento do chip. Quando posicionado adequadamente no chip, a pressão gerada pelo vácuo é bem tolerada. No entanto o excesso de pressão, quer do vácuo ou na fase inicial de posicionar o animal pode ser um problema. É melhor aprender o grau de pressão necessária empiricamente por testes com tipo selvagem larvas do tamanho correto. c) Se muito óleo halocarbônico cobre traquéia do animal o animal pode, potencialmente, ter problemas com a sobrevivência a longo prazo. O óleo desempenha vários papéis importantes no chip: é importante para a criação do vácuo, as ópticas durante o exame, e neutraliza a dessecação no chip. No entanto óleo excessivo deve ser evitado. (Isto pode também levar a óleo no tubo e seringa comprometer a vácuo). Os casacos protocolo sugerido apenas o lado ventral da larva com óleo, então removes excesso de óleo por colocação da larva em uma lamela limpa antes de se transferir para a lamela final para geração de imagens. d) fototoxicidade pode ser experimentado a partir da sessão de imagem. Como acontece com qualquer aplicativo de imagem ao vivo, é ideal para usar os tempos de exposição de curta duração, com baixa intensidade de luz laser, o que é melhor alcançada usando uma câmera de alta sensibilidade ou detector. Tentar minimizar iluminação com luz UV, incluindo a luz de amplo espectro criado por fontes de luz de Hg. Outras questões e direções futuras: Uma vez que este método não utiliza anestésicos, coração do animal continua a bater. Isso cria alguma mobilidade inevitável, o que afeta de imagem em alguns locais mais do que outros. Os exemplos aqui apresentados demonstram que o cabo ventral do nervo, nervos segmentais, e da parede do corpo pode ser facilmente trabalhada, sem a interferência do batimento cardíaco. Nos casos em que o batimento cardíaco afeta imagem, os movimentos regulares às vezes pode ser corrigido para comem software de análise (por exemplo, o Estabilizador de Imagem plugin para o ImageJ). Isso funciona bem quando os objetos individuais estão se movendo em uma escala de tempo rápido (por exemplo, ~ 1 mícron / seg para o transporte axonal rápido) ou em uma escala de tempo muito lento (minutos a horas). No entanto, quando o objecto (s) de interesse com o movimento de uma gama de velocidades e direcções, pode ser mais difícil de corrigir para os movimentos de batimento cardíaco induzido. Outra questão é pequena variabilidade na óptica de animal para animal, ou entre várias sessões de imagem do mesmo animal no chip. Quanto mais profundo o objeto de interesse está dentro do animal, maior será essa variação será. Nervos segmentares e cordão nervoso ventral são normalmente muito profundo dentro de então animal para ser trabalhada em um microscópio regular. No entanto, a pressão moderada com experiência no chip de larva empurra estas estruturas muito próximo da cutícula e lamela. A distância exata destas estruturas da lamela terá pequenas variações de trial a julgamento. A variação para objetos fechar a cutícula, como os corpos celulares dos neurônios sensoriais, é menor. Por conseguinte, é importante, em particular para fazer as medições de intensidade, para utilizar um grande número de animais e ensaios independentes para explicar a variabilidade em óptica. Enquanto os exemplos mostrados aqui têm-se centrado sobre os processos dentro dos neurônios, a abordagem deve ser passíveis de imagiologia qualquer estrutura no animal que pode ser trazido dentro da profundidade de focagem da objetiva do microscópio. Isto inclui a cutícula, músculos da parede do corpo, e seus NMJs. Traqueia no lado ventral do animal e, potencialmente, partes do tracto digestivo, também pode ser convertido em imagem. O animal pode igualmente ser posicionada com o lado dorsal para a lamela para imagiologia de curto prazo das estruturas perto da superfície dorsal. A capacidade de estruturas de profundidade da imagem dentro do animal é limitada pela distância de trabalho do objectivo microscópio utilizado. Estruturas como imdiscos aginal são inacessíveis para grande ampliação (por exemplo, 40x) objetivos. Os chips larva descritos neste protocolo são projetados para as larvas no início da 3 ª etapa instar (que variam em tamanho 3,5-4 mm). No entanto, muitas questões interessantes exigem imagens em diferentes estágios larvais. Chips menores para acomodar 2 ª larvas instar, ou chips maiores para acomodar final 3 ª estádios podem ser facilmente projetados usando o mesmo princípio. (Figura Suplementar 1 contém um arquivo DXF facilmente modificável para fazer moldes de silicone com tamanhos de câmara alterados). O simples princípio da vedação reversível pode mesmo ser aplicado a outros microorganismos, tais como C. elegans ou peixe-zebra, com a variante principal é o tamanho da câmara. A futura direção útil é criar um chip que pode imobilizar muitos animais ao mesmo tempo, a utilização para fins de triagem. No entanto, para isso, o desenho teria de ser significativamente diferentea partir do dispositivo atual, em que as questões de posicionamento do animal em o chip precisa ser tratada por cada animal de forma independente. O ensaio esmagamento do nervo para o estudo de respostas de lesões nos nervos periféricos das larvas: O ensaio esmagamento do nervo descrito aqui para nervos segmentares larval é um método simples para a introdução de uma lesão axônios periféricos em Drosophila. As vantagens deste método são: a) é simples de conduzir com ferramentas padrão encontrados em um laboratório de Drosophila (a fonte de CO 2 e fórceps estereoscópico), b) pode ser realizada rapidamente para muitos animais, fazendo com que a análise bioquímica de cordões nervosos após a lesão viável 14, c) as respostas celulares e moleculares para esta lesão são altamente reprodutível 14,15,28 e pode ser utilizado para descobrir processos que também são importantes em vertebrados neurónios 29,30. Métodos alternativos para ferir os neurônios é focusa laser de alta potência, por exemplo, um-UV pulsada ou laser de femtosegundos, para cortar um axônio via microcirurgia a laser 17,31-33. O chip larva é um método ideal para o posicionamento do animal para tal microcirurgia. No entanto, por causa das pequenas diferenças na óptica entre ensaios, discutidas acima, o método à base de laser pode ser mais difícil de reproduzir de larvas, especialmente nos nervos segmentares larvares. Além disso, a base de laser lesão axonal requer mais tempo para posicionar cada um dos animais, por conseguinte, é mais difícil de realizar em grande escala (com um grande número de animais). Solução de problemas: A questão técnica mais comumente encontradas a partir do esmagamento do nervo é a morte de danos aos órgãos internos. Ao realizar a paixão, é importante para não prender o cabo ventral do nervo, glândulas salivares, ou intestinos. Também é importante não perfurar a cutícula. Estas questões devem ser evitados, trazendo a pinça em um ângulo de 45 ° para a sup cutículae (ver Figura 3). A qualidade da pinça tem um grande impacto sobre a eficácia do esmagamento e sobrevivência depois. Recomendamos número Dumostar 5 fórceps. Para manter a sua nitidez, a pinça deve ser manuseado com cuidado, não utilizados para outros fins, e substituído, uma vez que tornam-se sem corte ou dobrados. O tamanho do animal também pode influenciar a eficácia do esmagamento. Pequenos animais (menos de 3 mm de comprimento) são muito menos propensos a sobreviver à lesão. Com grandes animais, (3 rd errante estádios), é mais difícil localizar os nervos e evitar danos para as maiores glândulas salivares e intestino, e há menos tempo para estudar as respostas de lesão antes pupation. O esmagamento do nervo é mais eficazmente conduzida em larvas cedo instar 3 º (que são ~ 3-4,5 mm de comprimento ao longo do eixo ântero-posterior). A fonte de alimentação que o animal é levantado em cima podem afectar oforça da cutícula e sobrevivência após a queda. Recomenda-se a criação de animais em alimentos feitos a partir de uma receita de levedura-glicose padrão. O melhor método para aprender a fazer o esmagamento de forma eficaz é a prática em muitos animais, primeiro com o objetivo principal de conseguir a sobrevivência (e não pupation) 24 horas após a queda. Iniciantes normalmente têm uma taxa de sobrevivência de baixo (por exemplo, 10%), mas uma vez que a técnica é aprendida, as taxas de sobrevivência pode chegar a 90%. Outras questões e direções futuras: O ensaio de esmagamento fornece um método poderoso para estudar o surgimento de axônio proximal ao local da lesão e degeneração de axônios e sinapses distais ao local da lesão. Enquanto as taxas de degeneração variar entre diferentes tipos de neurónios, que são altamente reprodutíveis dentro de um determinado tipo de neurónio, fornecendo prova da reprodutibilidade do ensaio de lesão. Em contraste, o &quot;regenerativa&quot; brotandoresposta observada nos axônios proximais é mais difícil de estudo. Todos os axônios no nervo segmentar iniciar extensa brotando perto do local da lesão (por exemplo, veja a Figura 6 e Figura 3). No entanto, o grau de germinação pode variar de neurônio para neurônio, e é difícil de quantificar. Um grau semelhante e variabilidade na germinação pode ser observado após lesões mais focais de neurónios motores individuais em nervos segmentares introduzidas por meio de um laser de corante pulsado UV. Nós interpretamos que a direcionalidade nondiscriminate do surgimento deve-se à ausência de pistas de orientação nos nervos segmentares. Em contraste, os axônios dos neurônios sensoriais feridas por laser de perto de seus corpos celulares passam por um novo crescimento axonal na mesma direção que o axônio perdeu 34. Os axônios nesta região do animal são provavelmente expostos a informação posicional mais específica para orientação dos axônios em regeneração. O ambiente dentro de nervos segmentares é improvável que tenha muito resemblanCE para o ambiente que os axônios originalmente navegou durante a sua orientação no embrião, portanto, não se espera que tenha informações para orientar os axônios em regeneração. Outra limitação para o estudo da regeneração utilizando o ensaio de esmagamento do nervo segmentar é que axônios sensitivos e neurónios motores feridos ainda tem uma distância significativa para cobrir (0,25-1 mm) para atingir a sua meta, e um período de tempo limitado (&lt;3 dias) antes que os animais sofre pupação. Um estudo recente identificou uma manipulação genética do receptor da hormona prothoraciotropic que triplica a duração do 3o estádio larval 35. Esta manipulação vai estender o período de tempo para estudar a recuperação e degeneração dos neurônios após a lesão de forma significativa, a 9 em vez de 3 dias. Este pode ser o tempo suficiente para observar os novos eventos, como religação de um axônio ferido com seu alvo pós-sináptica, especialmente se a lesão é induzida perto do final sináptica.

A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido utilizada como um organismo modelo para mais de 100 anos, e tem-se revelado fundamental na definição de sinalização fundamental e as vias de desenvolvimento que são conservados a partir de invertebrados para humano. Imagens ao vivo é uma abordagem importante para o estudo dos mecanismos celulares, eo plano corporal simples e cutícula translúcida da larva Drosophila torna um sistema atraente para geração de imagens ao vivo, especialmente porque há muitas ferramentas genéticas disponíveis para expressar proteínas fluorescente etiquetado em tipos específicos de células. Um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal para microscopia de forma não invasiva. Abordagens de imobilização convencionais incluem a dissecção 1,2 ou a utilização de clorofórmio, as quais matam o animal. Os anestésicos éter 4 e isofluorano 5-8 também têm sido utilizados. Embora os anestésicos proporcionar muitas vantagens, Eles também inibem a atividade neural e fisiologia importante (incluindo o coração) 9-11, portanto, pode afetar o processo de estudo e criar stress no animal. Também há preocupações de segurança humanos para trabalhar com éter e isofluorano. Nós desenvolvemos um método livre de drogas para imobilizar larvas Drosophila em um único dispositivo micro camada de PDMS, que chamamos de &quot;chip larva &#39;12. Este protocolo irá descrever como obter ou fazer o chip larva, e como utilizá-lo para imagens ao vivo no início de encenou larvas 3 º. O chip é composto de um microcâmara confortável-encaixe, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, imobiliza o animal por meio de força mecânica suave. O método de imobilização traz estruturas ventral como o cordão nervoso, os nervos segmentares e músculos da parede do corpo, nas proximidades de uma lamela de vidro. Isso permite que imagens de alta resolução de tais estruturas com alta aper numéricatura objetivos (alta ampliação). Vantagens do chip larva sobre outras técnicas convencionais incluem o seguinte: (i) O uso do chip larva substitui o uso de produtos químicos, permitindo a visualização in vivo dos animais não anestesiados. (Ii) As larvas se recuperar imediatamente após o lançamento do chip (em contraste com um período de recuperação de 2 horas para isofluorano 8,13). Isto permite uma imagem em escalas de tempo grandes, que variam de milissegundos a minutos, a horas e dias. (Iii) A utilização de PDMS, o que é um material permeável ao gás, permite a difusão contínua de oxigénio / ar do ambiente para dentro do corpo da praga. (Iv) O chip é fácil e seguro de usar, e (v) é reutilizável e pode ser fabricado a um custo mínimo. Além de instruções para usar o chip de larva, este protocolo prevê vários exemplos de seu uso para estudar eventos neuronais no 3 º larvas. Estes incluem imagens ao vivo de Axonal transporte, as respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo. Outra aplicação do chip é para estudar as respostas neuronais a lesão axonal. Por este um procedimento adicional é descrito (em parte 3) para ferir os axônios dentro nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar. Este ensaio simples pode ser realizada tanto de forma rápida e reprodutível sob um estereomicroscópio dissecção padrão, o que permite que muitos animais a serem tratados ao mesmo tempo. As respostas celulares à lesão pode ser estudada por imagens ao vivo no chip larva.

<table><tbody><tr><td>Tubo de polietileno de 0,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Tubo de polietileno, ID = 0,023 pol. Diâmetro externo = 0,038 pol</td></tr>. <tr><td>Tubo de poliuretano de 1 mm</td> Tubo de poliuretano <td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>, diâmetro interno = 0,063 pol. Diâmetro externo = 0,125 pol</td></tr>. <tr><td>Conector de farpa para barb Bio</td><td>Rad</td><td>732-8300</td><td>Conector de barb para barb de 0,8 mm</td></tr><tr><td>Válvula de torneira de 3 vias</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>Válvula de rosca para a seringa</td></tr><tr><td>Seringa (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Seringa de 20 ml de rosca para gerar vácuo</td></tr><tr><td>Dispensando agulhas, 23 G (0,4 mm I.D., 0,6 mm O.D.)</td><td>Agulha para conexão de saída</td> <td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td></tr><tr><td>Agulhas de dispensação, 21 G, (0,6 mm de diâmetro interno,&nbsp; 0,8 mm de diâmetro externo)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Agulha para conexão de saída</td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Óleo de halocarbono 700</td></tr><tr><td>Dumostar Número 5 Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>Para esmagamento de nervo</td></tr><tr><td>Kit PDMS (Base e agente de cura)</td> <td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Encapsulante de silicone 0,5 kg Kit de</td></tr><tr><td>lamínulas de vidro</td> transparente <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (espessura de acordo com a recomendação para o seu objetivo de microscópio)</td></tr> <tr><td>Copo de plástico descartável (9 onças)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Vareta</td><td></td><td></td><td></td>de café de plástico</tr><tr><td>Lâmina</td><td></td><td></td><td></td>de barbear</tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td> <td>de ágar suco de uvaVeja <a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a> para a receita</td></tr></tbody></table>

o uso de chips microfluídicos para imagens ao vivo e estudo das respostas lesão em<em&gt; drosophila</em&gt; larvas

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Imagens ao vivo é uma técnica importante para o estudo de processos biológicos celulares, no entanto, isso pode ser um desafio em animais vivos. A cutícula translúcida da larva Drosophila o torna um organismo modelo atraente para estudos de imagem ao vivo. No entanto, um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal no microscópio de forma não invasiva. Este protocolo apresenta um método simples e fácil de usar para a imobilização e imagem larvas Drosophila em um polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivo micro, o que chamamos de &quot;chip larva. O chip larva é composta por uma microcâmara de PDMS-encaixe perfeito que está ligada a uma lamela de vidro fina, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, para imobilizar o animal e traz estruturas ventrais, tais como o cabo de nervo, nervos segmentais, e corpo músculos da parede, próximo à lamela. Isso permite que imagens de alta resolução, e mais importante, evita o uso de anesthetics e produtos químicos, o que facilita o estudo de uma ampla variedade de processos fisiológicos. Uma vez que as larvas recuperar facilmente a imobilização, que pode ser facilmente submetido a múltiplas sessões de imagem. Isto permite estudos longitudinais mais cursos de tempo variando de horas a dias. Este protocolo descreve passo-a-passo como preparar o chip e como utilizar o chip para imagens ao vivo de eventos neuronais no 3 º larvas. Estes eventos incluem o rápido transporte de organelas em axônios, respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo. Outra aplicação do chip é estudar regenerativa e respostas degenerativas lesão axonal, por isso, a segunda parte deste protocolo descreve um procedimento novo e simples para ferir axônios dentro de nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar.

Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado &quot;chip larva &#39;para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é imobilizar de forma não invasiva larvas de drosófila para imageamento em tempo real, utilizando uma câmara microfluídica modificada. Uma larva de terceiro estágio é posicionada no chip com um pouco de óleo para ajudar a selar a larva. Em seguida, o chip é colocado sobre a larva de modo que seu corpo fique acomodado dentro da câmara.O chip é conectado a uma seringa para que um vácuo possa ser aplicado. A locomoção das larvas fica restrita e as estruturas na parte ventral do animal são empurradas em direção à lamínula. Utilizando um microscópio confocal, é possível obter imagens facilmente de estruturas como os detalhes dos terminais axonais dos neurônios sensoriais e a regeneração dos nervos segmentares após dano nervoso induzido.Outros métodos para imobilizar josepha para imagem em tempo real, grandes quantidades de éter clorofórmico ou anestésicos ISO. A principal vantagem dessa técnica é que ela evita o uso de grandes quantidades de tais toxinas, que interferem na fisiologia do animal. Um benefício adicional decorrente da ausência de toxinas é que a larva GB é segura para manipulação. A imobilização robusta permite a obtenção de imagens de eventos rápidos, como o transporte axonal rápido e alterações no cálcio intracelular.Uma única larva pode ser imobilizada e imageada no chip múltiplas vezes. Isso permite acompanhar processos ao longo do tempo. A aquisição de imagens de processos que ocorrem ao longo de até 72 horas começa com a obtenção de um chip PDMS de amostra para testar este protocolo.As instruções sobre como fabricar um chip A-P-D-M-S a partir de um molde SU oito podem ser lidas no protocolo textual utilizando uma agulha de dispensação de calibre 21. Faça um furo no orifício de vácuo do chip de PDMS para um microscópio invertido. Remova uma agulha de calibre 23 de sua base, desprendendo o hub de travamento com alguns giros.Em seguida, insira a ponta da agulha em um pequeno pedaço de tubo de polietileno de modo que o tubo cubra pelo menos um milímetro da agulha. Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de tubo. Isso deixa um anel de plástico que pode formar um selo.Insira a ponta da agulha de 23 gauge no orifício do duto de vácuo. Para um microscópio ereto, faça um segundo orifício na lateral do chip de PDMS com uma agulha dispensadora de 21 gauge. Esse orifício fornecerá acesso ao primeiro orifício pelo lado.Em seguida, insira a ponta da agulha de 23 calibres e o anel de tubo no orifício lateral. Coloque um pedaço de fita adesiva dupla face sobre o topo do chip de PDMS para selar o orifício superior. Conecte um trecho de 20 centímetros de tubo de polietileno entre a ponta da agulha inserida na porta de vácuo do chip e uma das portas de uma válvula de três vias.Em seguida, conecte uma seringa de 20 mililitros a um dos dois orifícios restantes da válvula, deixando o último orifício aberto. Limpe o chip de PDMS com fita adesiva transparente. Ape um pedaço de fita na parte inferior do chip.Certifique-se de que a fita está tocando toda a superfície de PDMS e, em seguida, remova a fita. Repita este método de limpeza três vezes. Como o chip de PDMS é reutilizável, é muito importante remover resíduos de óleo, pois eles podem afetar a adesão do PDMS ao vidro. Transfira a forrageira precoce.Larvas de terceiro estádio da dieta para uma placa de Petri contendo água. Elas devem ter entre 3,5 e quatro milímetros de comprimento para se encaixarem corretamente no chip. Lave as larvas para remover o meio de cultura.A seguir, coloca-se uma pequena gota de óleo de carbono halo 700 no centro de um lamínula de vidro; com pinça, levanta-se suavemente uma larva lavada. Coloca-se brevemente sobre um lenço leve para secá-la e, em seguida, transfere-se para o óleo por 10 segundos. A gota deve ser pequena o suficiente para que a traqueia das larvas não fique revestida.Em seguida, coloque as larvas em uma lamínula de vidro limpa brevemente e transfira-a para outra lamínula, removendo assim um pouco mais de óleo. Preste atenção à orientação das larvas para imaginar a medula neural e os nervos segmentares.O lado ventral deve ficar voltado para baixo. Os tubos traqueais facilmente identificáveis devem ficar voltados para cima. Agora, coloque suavemente o chip de PDMS sobre as larvas.Alinhe as larvas ao centro da microcâmara. Com sua extremidade posterior voltada para a porta de vácuo, a larva não deve tocar nas bordas da câmara. Após o alinhamento, pressione o chip de PDMS contra a lamínula de vidro para obter um bom selamento.Em seguida, verifique novamente se a larva está completamente envolvida na microcâmara. Agora, gire a válvula de três vias para a seringa. Segure firmemente o conjunto de PDMS e puxe o êmbolo da seringa para retirar de dois a 2,5 milímetros de ar até sentir resistência.Assim criando um vácuo. Em seguida, feche a válvula. Para manter o vácuo com cuidado, verifique novamente as larvas.O corpo deve ser imobilizado dentro da microcâmara, e a traqueia deve estar visível. O restante do chip de PDMS deve estar em contato com a lamínula. Orientações como essas não estão corretas. Agora, obtenha imagens das larvas.Se estiver usando um microscópio ereto, fixe o lado superior do chip à platina com fita adesiva dupla face. Quando a aquisição de imagens for concluída, libere o vácuo. Em seguida, retire o chip de PDMS da lamínula.A larva deve estar imediatamente móvel ao ser manipulada com pinça. Devolva as larvas a uma placa de ágar suco de uva para recuperação. Coloque uma única larva anestesiada sobre uma placa de ágar suco de uva.Sob o microscópio estereoscópico, posicione o animal com o lado ventral voltado para cima. Para visualizar o cordão nervoso ventral e os nervos segmentares, certifique-se de que a larva esteja completamente imóvel. Localize o cordão nervoso e as glândulas salivares.É importante não danificar essas estruturas. Localize o fim do terceiro segmento abdominal. Lesões nessa região danificam o maior número de nervos e são as mais fáceis de reproduzir sem matar o animal.O procedimento também pode ser realizado em segmentos mais posteriores utilizando uma pinça duo star número cinco. Aperte firmemente os nervos segmentares através da cutícula por cinco a dez segundos. Quando realizado corretamente, a cutícula permanece intacta e a parede corporal não é perfurada.A recuperação exigirá prática após a lesão, na qual o animal é colocado com o lado ventral voltado para baixo sobre a placa grande. Ele deverá ser capaz de mover a cabeça e se alimentar. Se a lesão foi bem-sucedida, a metade posterior das larvas ficará paralisada.O chip de larva foi utilizado para imaginar o transporte mediado por quinesina de vesículas sinápticas dentro de axônios periféricos individuais. O movimento anterógrado dessas vesículas foi medido em cerca de 1,0 mícron por segundo. O movimento retrógrado foi registrado em 0,8 mícron por segundo.A técnica de imobilização foi utilizada para microcirurgia a laser usando um laser de corante UV pulsado. Os níveis de cálcio foram observados em neurônios específicos graças a um indicador codificado geneticamente. G camp 3.0 um pico de cálcio é detectado após um neurônio sensorial.O dendrito é seccionado. Permitir que o animal descanse entre as sessões de imagem permite visualizar eventos celulares ao longo do tempo. Após esmagar os axônios dos neurônios motores eméricos, o coto axonal proximal apresentou brotamento novo.Enquanto isso, os axônios distais formaram varicosidades e se fragmentaram através do processo de degeneração walleriana. Usando a fotoconversão de proteínas fluorescentes no chip de larva, é também possível realizar o rastreamento in vivo. Uma proteína de fusão DRA dois alfa tubulina expressa em neurônios sensoriais da classe quatro foi fotoconvertida nos corpos celulares.Em dois dias, uma quantidade significativa da proteína fotoconvertida foi relocada para os terminais axônicos dos neurônios sensoriais, a cerca de um milímetro de distância do local original no corpo celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o chip de larvas para imagens vivas de larvas de drosófila e de como realizar uma lesão por esmagamento nervoso. Uma vez dominadas essas técnicas, as larvas podem ser posicionadas no microscópio em apenas alguns minutos.A compressão do nervo é igualmente rápida. Portanto, esses procedimentos podem ser utilizados em experimentos em larga escala, como em estudos genéticos. O chip pode ser utilizado para imagens de estruturas no lado ventral das larvas de drosófila.Estes incluem, mas não se limitam a, músculos, sinapses da junção neuromuscular, neurônios sensoriais, nervos periféricos e a corda nervosa ventral. Este procedimento também pode ser usado para realizar imagens em tempo real do coração larval, glândulas salivares e traqueia. O chip para larva utilizado neste vídeo possui tamanho adequado para animais entre 3,5 e quatro milímetros de comprimento.Para a imagem, animais menores ou maiores podem ser analisados utilizando um chip com câmara menor ou maior, que pode ser facilmente produzido. Consulte o arquivo de design suplementar e as instruções para a fabricação de chips de PDMS. As instruções para a produção dos chips de PDMS estão incluídas no protocolo escrito.Podemos enviar um chip de amostra se você nos contatar.

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