Name: Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a produzir nanopartículas de PLGA com tamanho ajustável usando emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS como emulsificante. Este método permite controlar o diâmetro das partículas variando a concentração do emulsificante.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Preparação de nanopartículas
Todas as etapas envolvendo solvente ou polímero dissolvido/emulsionado devem ser executadas em uma capela de exaustão química.
<ol>
	<li>Pesar 100 mg (+/- 5 mg) de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e colocar num tubo de ensaio de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Transferir 1 ml de solvente [acetato de etilo (EtAc) ou diclorometano (DCM)] para a amostra com uma pipeta serológica de vidro.</li>
	<li>Cubra a parte superior do tubo com um pequeno pedaço de papel alumínio e coloque o filme com parafilme firme, certificando-se de enrolar o parafilme firmemente na borda superior do frasco, bem como na borda inferior do papel alumínio.</li>
	<li>Marque o nível do solvente na parte externa do tubo de ensaio. Deixe o polímero dissolver durante a noite, adicionando solvente adicional no dia seguinte se ocorrer evaporação. 
	Nota: O polímero também pode ser dissolvido no dia da preparação da nanopartícula, se necessário. Siga as etapas 1.1-1.3 e, em seguida, bata em alta até que todo o polímero esteja completamente dissolvido (~ 10 min).</li>
	<li>Preparar uma área de trabalho na hotte com os seguintes equipamentos/materiais junto ao ultrassónico: um vórtice, duas pequenas pipetas Pasteur de vidro com lâmpadas de borracha e uma placa de agitação magnética. Coloque um copo grande cheio de água gelada em um suporte abaixo do ultrassom.</li>
	<li>Adicione 45 ml de vitamina E-TPGS a 0,3% p/v a um copo de vidro de 200 ml com uma barra de agitação magnética e ajuste a velocidade de agitação para 360 rpm.</li>
	<li>Adicione 2 ml de vitamina E-TPGS a 0,3% p/v a um tubo de ensaio de vidro de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Adicionar medicamento: 
	Para agentes hidrofóbicos: adicione encapsulante diretamente à solução polimérica (tomando cuidado para evitar as paredes do tubo de ensaio) e vortex o tubo até que o encapsulante esteja homogeneamente disperso. 
	Para agentes hidrofílicos: emulsionar o encapsulante com a solução polimérica antes de prosseguir. Adicione até 50 μl de medicamento em água ou tampão à superfície da solução polimérica. Ultrassonicar brevemente para emulsionar o medicamento com polímero (normalmente 10 segundos ou conforme necessário para obter uma solução homogênea e opaca). Esta etapa de sonicação deve ser realizada no gelo.</li>
	<li>Coloque o polímero/encapsulante de tubo aberto próximo ao vórtice. Enquanto segura o tubo de ensaio contendo vitamina E-TPGS verticalmente e em vórtice alto, use uma pipeta de vidro Pasteur para adicionar a solução de polímero / encapsulante gota a gota. Tenha cuidado para evitar as laterais do tubo e soltar a solução de polímero diretamente na superfície do emulsificante de vórtice. Depois que todo o 1 ml de solução de polímero tiver sido adicionado ao TPGS de vitamina E, continue agitando a solução (agora uma emulsão) por mais 15 segundos.</li>
	<li>Transfira imediatamente o polímero emulsionado para o ultrassom. Mantenha o tubo de ensaio imerso em água gelada e sonice a emulsão em três rajadas de 10 segundos (amplitude de 40% para um sonicador de 700 W, tamanho da ponta da sonda de 1/8 pol.). Mova a emulsão para cima e para baixo na sonda para garantir uma sonicação uniforme, tomando cuidado para evitar tocar na sonda nas laterais ou no fundo do tubo de ensaio. Faça uma pausa entre cada sonicação de dez segundos para permitir que a solução esfrie antes de prosseguir.</li>
	<li>Adicione 1-2 ml de Vitamina E-TPGS a 0,3% da solução de agitação à emulsão com uma pipeta Pasteur de vidro, que dilui o polímero emulsionado para que ele seja derramado mais facilmente. Esvazie a emulsão na solução de agitação. Repita esta etapa para lavar qualquer solução restante do tubo de ensaio para a solução de agitação.</li>
	<li>Deixe as nanopartículas endurecerem enquanto mexe por três horas. Se o encapsulante for sensível à luz, o béquer pode ser envolto em papel alumínio, deixando a parte superior aberta para facilitar a evaporação do solvente.</li>
</ol>
2. Coleta de nanopartículas
<ol>
	<li>Divida as nanopartículas endurecidas em dois tubos de centrífuga Oak Ridge (volume nominal de 30 ml) e equilibre com 0,1 g.</li>
	<li>Centrifugue as nanopartículas em um rotor de ângulo fixo por 15 min a 17.000 x g. Tempos de centrifugação mais longos resultarão na coleta de uma fração maior de nanopartículas menores.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet de nanopartículas (a água pode ser derramada ou pipetada). Adicionar 15 ml de diH2O e utilizar um sonicador e/ou vórtice em banho-maria para ressuspender completamente as nanopartículas.</li>
	<li>Combine o conteúdo dos dois tubos de centrífuga em um e repita as etapas 2,1-2,3 2x mais, para um total de três lavagens em 30 ml de diH2O de cada vez. O volume de fluido da última ressuspensão do pellet deve ser de 4-5 ml. 
	Uma proporção de peso de 1:2 trealose:polímero pode ser adicionada neste ponto como um crioprotetor (congelar uma pequena alíquota de nanopartículas sem trealose para imagens de MEV). Os cristais de gelo que se formam durante o processo de congelamento podem danificar a superfície da partícula e induzir a agregação, e a inclusão de trealose demonstrou melhorar a ressuspensão uniforme e completa das nanopartículas de PLGA13.</li>
	<li>Transferir as nanopartículas para um tubo de centrifugação de 5 ml previamente pesado e congelar a -80 °C durante um mínimo de 30 min.</li>
	<li>Movendo-se rapidamente para não deixar o conteúdo congelado derreter, destampe o tubo e cubra a parte superior prendendo o tecido de laboratório na parte superior com um elástico. ** Se ocorrer algum derretimento, congele novamente antes de colocar no liofilizador.</li>
	<li>Liofiliza 72 horas para um volume de 5 ml. Armazenar as partículas liofilizadas em tubo envolto em parafilme a -80 °C.</li>
</ol>
3. Dimensionamento e morfologia da superfície
Microscopia Eletrônica de Varredura
<ol>
	<li>As amostras para MEV devem ser preparadas no dia da imagem. Coloque uma tira de fita de carbono dupla face em um stub SEM. Um marcador permanente pode ser usado para rotular a parte metálica do toco para referência posterior.</li>
	<li>Use uma espátula de metal para coletar uma pequena quantidade de nanopartículas liofilizadas e espalhe-as suavemente pela superfície da fita. Escove a superfície do toco com um lenço de laboratório ou use ar comprimido para remover nanopartículas soltas.</li>
	<li>Cubra a amostra com paladium dourado por 30-120 segundos. Um tempo de pulverização mais longo produzirá uma superfície mais lisa para a geração de imagens, embora isso possa resultar na perda de detalhes finos da superfície.</li>
	<li>Os parâmetros típicos para visualização de partículas são uma distância de trabalho de 5 a 15 mm, intensidade do feixe de 5 a 12 kV e um tamanho de ponto de 1 a 3. Intensidades de feixe mais altas podem resultar em aquecimento regional da amostra, o que alterará a morfologia da superfície das partículas. As micropartículas são observadas com ampliação de 100X e as nanopartículas serão distinguíveis com ampliação de 3.000X.</li>
	<li>A amostra ideal consistirá em um revestimento uniforme de partículas na superfície plana do toco. Ocasionalmente, estruturas secundárias (incluindo flocos ou esferas) podem resultar da liofilização. Focar na borda de um floco, onde o floco encontra a fita, ou no topo de uma esfera ajudará a localizar partículas que podem ser facilmente visualizadas com SEM. Colete pelo menos três imagens por lote para obter uma amostra representativa do tamanho e morfologia das partículas.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As partículas de PLGA são comumente preparadas por emulsão simples ou dupla, um método que fornece a capacidade de personalizar as características das partículas, como tamanho, encapsulante e propriedades de superfície7. Essas propriedades e outras dependem de muitas variáveis, incluindo tipo de solvente, proporções de alimentação, método de emulsificação e tipo de emulsificante. No entanto, em nossa experiência, é possível que um único experimentador produza partículas com propriedades consistentes. Usando o mesmo protocolo, um experimentador bem treinado produziu sete lotes separados de nanopartículas com os seguintes diâmetros médios: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 e 364 nm±110. A média dos lotes do experimentador bem treinado produz um diâmetro médio de 340 nm±25 e um desvio padrão médio dentro do lote de 110 nm±8. Um segundo experimentador, treinado pelo primeiro, usou o mesmo protocolo para produzir nanopartículas com diâmetro médio de 328 nm±138. No entanto, um terceiro experimentador, que vinha fabricando nanopartículas de forma independente há vários meses, seguiu o mesmo protocolo para produzir nanopartículas com um diâmetro médio de 220 nm±70. Assim, é possível fazer partículas com uma faixa esperada de diâmetros, mas isso depende da replicação exata da técnica experimental sutil. O agrupamento de lotes pode permitir a produção de grandes quantidades de nanopartículas com propriedades agregadas idênticas. Por exemplo, quando modificamos a superfície de nanopartículas para estudo in vitro ou in vivo , vários (até 6) lotes de 200 mg são preparados, lavados, coletados, misturados em um único tubo e, em seguida, divididos para modificação de superfície. Isso garante que o tamanho da nanopartícula, a carga do medicamento, a carga e a fração dos locais de superfície disponíveis para modificação sejam comparáveis entre dois grupos de tratamento. Em outro exemplo, se a variável de interesse é a eficácia do medicamento com diferentes agentes sendo carregados em diferentes lotes de nanopartículas, é importante medir e controlar a variabilidade na carga do medicamento. É fundamental que as propriedades das partículas sejam medidas para cada lote de partículas produzidas e que os experimentos sejam projetados e replicados para controlar a variabilidade de lote para lote.
A emulsão completa das fases orgânica e aquosa é fundamental para a formação de pequenas partículas. O poli (álcool vinílico) (PVA) é talvez o emulsificante mais comumente usado. Nós e outros usamos uma variedade de agentes emulsificantes e estabilizantes, incluindo vitamina E-TPGS9, PVA14, spans15 e poloxâmeros16 (para uma discussão completa da ampla gama de agentes usados para a produção de partículas de PLGA, consulte a revisão de Wischke et al.17). O polímero devidamente emulsionado aparecerá como uma solução homogênea, branca leitosa/opaca. Uma emulsão pobre (ou "quebrada") mostrará heterogeneidade ou granularidade macroscópica e pode até se separar em duas camadas visualmente distintas no tubo. Isso geralmente indica uma falha na formação de nanopartículas. A emulsão pode quebrar seguindo a etapa 1.9 se não for imediatamente transferida para o ultrassom. Se isso ocorrer, vórtice novamente até ficar homogêneo e prossiga imediatamente para o sonicador. A separação não deve ocorrer após a etapa de sonicação (1.10). Uma vez que as partículas tenham sido dispersas em um volume aquoso maior (etapa 1.11), a solução deve ser uniformemente opaca a ligeiramente translúcida. A qualidade translúcida aumentará à medida que o tamanho das partículas diminui, e uma tonalidade azul pode ser observada para nanopartículas muito pequenas. Essa tonalidade pode não ser observada se as partículas encapsularem um medicamento. Se a emulsão não se dispersar uniformemente no grande volume aquoso ou parecer granular, o experimento não deve prosseguir. É normal observar alguma variação na aparência do pellet de partículas, bem como em sua coesão. Alguns pellets podem ressuspender após vórtice leve, enquanto outros podem levar vários minutos de sonicação em banho-maria. A ressuspensão não deve demorar mais de 5 minutos. As partículas liofilizadas podem assumir uma variedade de texturas, desde o algodão até o fluxo livre.
Uma das muitas vantagens do PLGA como material de nanopartículas é a capacidade de otimizar o processo de fabricação para criar o tamanho desejado de partícula para a aplicação pretendida. Nanopartículas maiores encapsularão uma fração maior de fármaco hidrofóbico (em relação ao peso do polímero) do que nanopartículas pequenas, no entanto, a cinética de liberação do fármaco também pode ser afetada18-20. O tamanho das nanopartículas tem um efeito direto nos mecanismos de internalização de partículas pelas células, bem como sua distribuição no tecido, o que pode resultar em diferenças dramáticas na eficácia da entrega. Por exemplo, o sistema de fagócitos mononucleares marcará e removerá agentes na circulação sistêmica maiores que 1 μm. Pequenas nanopartículas podem ser de interesse para infusão direta no cérebro, onde nanopartículas maiores ficariam presas na matriz extracelular apertada; A entrega de pequenas nanopartículas também pode facilitar o direcionamento passivo de tumores por meio do efeito aprimorado de permeação e retenção. A eficiência de encapsulamento do medicamento varia amplamente, dependendo das propriedades do medicamento específico, do tamanho da partícula e do emulsificante (ou seja, sua solubilidade em água versus solvente). A emulsão simples versus dupla também afetará o carregamento do medicamento e o tamanho das nanopartículas. O encapsulamento de agentes hidrofóbicos via emulsão única pode auxiliar na produção de nanopartículas ultrapequenas, em comparação com o método de emulsão dupla. Direcionamos o leitor para outros recursos para uma discussão extensa deste tópico23-28. Por fim, métodos alternativos de emulsificação estão disponíveis, incluindo homogeneização de alta velocidade, e essas outras abordagens podem fornecer vantagens para tipos específicos de medicamentos ou aplicações de administração de medicamentos29.
O método de emulsão única apresenta uma oportunidade de variação de uma ampla gama de variáveis de formulação, cada uma das quais é capaz de alterar as propriedades das nanopartículas. Por exemplo, o uso de diclorometano (DCM) como solvente geralmente produzirá nanopartículas maiores com uma distribuição de tamanho mais ampla. Como o acetato de etila (EtAc) é miscível em água, a tensão superficial da gota de polímero na emulsão primária é diminuída, produzindo nanopartículas menores. O DCM pode ser substituído pelo mesmo volume de EtAc. Solventes alternativos ou misturas de solventes podem ser usados para otimizar o encapsulamento de medicamentos e as propriedades das partículas. Outros parâmetros de formulação também são capazes de alterar o tamanho das partículas: por exemplo, aumentar o volume do solvente, a proporção solvente:polímero, a intensidade da sonicação ou a velocidade/duração da centrifugação resultarão em uma diminuição no tamanho das partículas coletadas. É possível dimensionar partículas fracionadas realizando centrifugação sequencial (por exemplo, uma centrifugação rápida e de baixa velocidade para remover primeiro partículas maiores, seguida por uma centrifugação mais longa para coletar partículas ultrapequenas) ou filtragem.
Aqui, descrevemos parâmetros de formulação que permitem a preparação de partículas de PLGA com diâmetros médios variando de 220 nm a 1,98 μm. Esses métodos para a produção de partículas compostas de PLGA podem ser usados para otimizar o design de partículas (tamanho, encapsulante e propriedades de superfície) para futuras aplicações de entrega de medicamentos in vitro ou in vivo.

Os polímeros tornaram-se veículos de administração de medicamentos cada vez mais populares nas últimas décadas para aplicações que vão desde a terapia direcionada de tumores1 até a modulação do sistema imunológico2. Os medicamentos encapsulados ou conjugados com polímeros são frequentemente mais eficazes do que seus equivalentes entregues livremente, uma vez que o medicamento associado ao polímero é protegido contra degradação. Essa proteção se traduz em uma meia-vida biológica mais longa e eficácia potencialmente melhorada com efeitos colaterais sistêmicos reduzidos3-5.
Poly(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) exibe muitas das propriedades ideais de um sistema de entrega em nanoescala, proporcionando liberação a longo prazo do agente encapsulado e degradando-se nos produtos biocompatíveis de ácido lático e glicólico. Pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucléicos encapsulados em PLGA demonstraram atividade aumentada em uma variedade de aplicações de doenças8. É importante ressaltar que a plataforma de materiais facilita a personalização fácil de recursos como tamanho, carga e exibição de superfície de ligantes para direcionar partículas para tecidos específicos ou para fins de imagem. Como o PLGA já é usado em humanos na forma de suturas biodegradáveis (por exemplo, Purasorb, Purac Biomaterials e Vicryl, Ethicon Inc.), o potencial de tradução clínica é alto.
A emulsão óleo-água (simples) ou água-óleo-água (dupla) é um método pelo qual o PLGA pode ser usado para encapsular drogas hidrofóbicas e hidrofílicas em micro ou nanoescala Resumidamente, o PLGA é dissolvido em uma fase orgânica (óleo) que é emulsionada com um surfactante ou estabilizante (água). Os medicamentos hidrofóbicos são adicionados diretamente à fase oleosa, enquanto os medicamentos hidrofílicos (água) podem ser primeiro emulsionados com a solução polimérica antes da formação das partículas. As explosões de sonicação de alta intensidade facilitam a formação de pequenas gotículas de polímero. A emulsão resultante é adicionada a uma fase aquosa maior e agitada por várias horas, o que permite que o solvente evapore. As nanopartículas endurecidas são coletadas e lavadas por centrifugação (Figura 1).
Aqui, descrevemos uma técnica para confecção de nanopartículas de PLGA utilizando emulsão simples e dupla, com acetato de etila (EtAc) como solvente e succinato de polietilenoglicol de vitamina E-D-α-Tocoferol (TPGS) como agente emulsificante. O uso de vitamina E-TPGS oferece várias vantagens possíveis sobre outros tipos de agentes estabilizadores (por exemplo, poli (álcool vinílico), PVA), incluindo emulsificação aprimorada e eficiência de encapsulamento. Outros grupos relataram vantagens da vitamina E-TPGS, incluindo a inibição da P-gp, uma proteína de efluxo transmembrana, que é comumente superexpressa em células cancerígenas e conhecida por contribuir para a resistência aos medicamentos, transportando os medicamentos para fora das células-alvo. Além disso, demonstramos como caracterizar e dimensionar as partículas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e fornecemos mais orientações sobre a modificação de tamanho por meio da alteração do protocolo.

<table><tbody><tr><td>Ácido poli(lático-co-glicólico) &amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Viscosidade inerente: 0,55-0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Acetato de etila (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de metileno (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPGS de vitamina E</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Álcool polivinílico</td><td></td><td></td><td>87-89% hidrolisado, 30.000-70.000 Da</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dismembrador sônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Modelo 705</td><td>700 W (ultrassonicator)</td></tr><tr><td>Ponta do ultrassom</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 pol.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitador multiposição</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartículas de plga formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) é um membro biocompatível da família de polímeros biodegradáveis de poliéster alifático. O PLGA tem sido uma escolha popular para aplicações de administração de medicamentos, principalmente porque já é aprovado pela FDA para uso em humanos na forma de suturas reabsorvíveis. Drogas hidrofóbicas e hidrofílicas são encapsuladas em partículas de PLGA por meio de emulsão simples ou dupla. Resumidamente, o medicamento é dissolvido com polímero ou emulsionado com polímero em uma fase orgânica que é então emulsionada com a fase aquosa. Após a evaporação do solvente, as partículas são lavadas e coletadas por centrifugação para liofilização e armazenamento de longo prazo. O PLGA se degrada lentamente por hidrólise em ambientes aquosos, e os agentes encapsulados são liberados durante um período de semanas a meses. Embora o PLGA seja um material que possui muitas vantagens para a administração de medicamentos, a formação reprodutível de nanopartículas pode ser um desafio; Considerável variabilidade é introduzida pelo uso de diferentes equipamentos, lote de reagentes e método preciso de emulsificação. Aqui, descrevemos detalhadamente a formação e caracterização de micropartículas e nanopartículas formadas por emulsão simples ou dupla usando o agente emulsificante vitamina E-TPGS. A morfologia e o tamanho das partículas são determinados com microscopia eletrônica de varredura (MEV). Fornecemos imagens SEM representativas para nanopartículas produzidas com concentração variável de emulsificante, bem como exemplos de artefatos de imagem e emulsificações com falha. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para usar emulsificantes alternativos (por exemplo, poli(álcool vinílico), PVA) ou solventes (por exemplo, diclorometano, DCM).

Imagens representativas de micro e nanopartículas de PLGA obtidas com este protocolo são mostradas nas Figuras 2a e 2b. As partículas aparecerão como esferas individuais, não fundidas, com morfologia de superfície lisa e uma ampla faixa de tamanhos distribuída por toda a amostra.
Para determinar o diâmetro médio de cada lote, são realizadas medições diretamente nas imagens de MEV utilizando a função "medir" do ImageJ. Deve-se realizar um mínimo de 150 medições do diâmetro de partículas selecionadas aleatoriamente no campo de visão para obter uma distribuição de tamanho representativa. O tamanho médio de um lote de partículas depende dos parâmetros da formulação. Por exemplo, na Figura 2a, micropartículas (diâmetro médio de 730 nm±370) foram formadas com 1 ml de solvente para 100 mg de PLGA, utilizando 0,05% de Vitamin E-TPGS na fase emulsificante, enquanto na Figura 2b, nanopartículas (diâmetro médio de 340 nm±70) foram formadas com 4 ml de solvente para 200 mg de PLGA, encapsulando o fármaco hidrofóbico camptotecina e utilizando 0,3% de Vitamin E-TPGS na fase emulsificante (os parâmetros completos da formulação estão descritos na legenda da figura). De modo geral, uma concentração mais elevada de emulsificante produz partículas menores, sendo possível obter diâmetros médios na faixa de 220 a 2.000 nm ao variar a concentração do emulsificante de 0,3 a 0,01% (Figura 3).
Nossos rendimentos variam de 74-98% (22 lotes de nanopartículas com diferentes solventes, emulsificantes e condições de emulsificação, preparados por um único pesquisador). Rendimentos melhores podem ser observados em lotes maiores (&gt;150 nm), já que nanopartículas pequenas são facilmente perdidas durante a centrifugação e a etapa de lavagem, especialmente quando o sobrenadante de lavagem é decantado do pellet. Uma pipetagem cuidadosa do líquido pode ajudar a evitar esse problema. Velocidades mais altas e/ou tempos mais longos de centrifugação também podem melhorar o rendimento, tanto pela melhor coleta da fração ultrafina de nanopartículas quanto pela compactação do pellet, de modo que menos material seja perdido na etapa de lavagem. O protocolo descrito aqui concentra-se na produção de partículas utilizando TPGS como agente emulsificante e EtAc como solvente; entretanto, são possíveis solventes e/ou agentes emulsificantes alternativos. Em geral, observamos que o EtAc produz nanopartículas menores e mais uniformes em tamanho do que o DCM (ex. diâmetros de 540 nm±190 versus 2.160 nm±1.530 para EtAc versus DCM, 100 mg/ml de PLGA no solvente, emulsificado em 2 ml de TPGS 0,1%), presumivelmente porque o EtAc é miscível em água, ao passo que o DCM não é. O PVA é um agente emulsificante amplamente utilizado, empregado extensivamente por nosso grupo e outros. Observamos variabilidade nas nanopartículas preparadas a partir de diferentes lotes de PVA comercialmente disponível. É aconselhável, portanto, utilizar o mesmo estoque de PVA sempre que possível, a fim de melhorar a reprodutibilidade. Em nossa experiência, o PVA atua como emulsificante mais eficaz em concentrações muito mais altas do que o TPGS (ex. diâmetro de 140 nm±48, 100 mg/ml de PLGA em DCM, emulsificado em 2 ml de PVA 5%).
Caracterizar nanopartículas com MEV pode ser desafiador devido às diferenças em equipamentos e no processo de imageamento. É, portanto, importante distinguir características morfológicas que indiquem problemas na formação das partículas de artefatos que são introduzidos inadvertidamente durante o imageamento. A fusão (Figuras 4a e 4b), a formação de covas (Figura 4c) ou rachaduras (Figura 4f) das partículas é ocasionalmente observada nas imagens de MEV. Esses artefatos às vezes indicam partículas mal formadas (por exemplo, na Figura 4a, a concentração do emulsificante era muito alta para formar partículas discretas), mas também podem resultar de artefatos introduzidos pelo método de caracterização (por exemplo, na Figura 4b, a amostra aqueceu durante o revestimento por pulverização catódica, e na Figura 4c, o aquecimento local provocado pelo feixe do MEV alterou a morfologia da superfície das partículas durante o imageamento). Para evitar artefatos de imageamento, o tempo de pulverização catódica deve ser minimizado e a potência do feixe mantida baixa. Morfologias mais suaves são observadas com tempos mais longos de pulverização catódica; no entanto, isso pode induzir a fusão das partículas. Tempos de pulverização muito curtos podem dificultar o imageamento, pois as partículas ficarão carregadas e se moverão durante a captura da imagem. Capturar imagens rapidamente ajudará a evitar exposição prolongada ao feixe e distorção das imagens (Figuras 4d e 4e). Exposições elevadas ao feixe também podem resultar em expansão e rachaduras na superfície da nanopartícula (Figura 4f). Se os artefatos morfológicos não puderem ser minimizados pela alteração dos parâmetros de caracterização, é possível que representem problemas reais nas próprias nanopartículas. Durante o processo de fabricação, a fusão pode resultar de superaquecimento devido à alta potência de ultrassonicação, evaporação incompleta do solvente, ressuspendimento incompleto durante a fase de lavagem ou liofilização mal sucedida.
<img alt="Processo de separação de óleo e água; sonicação, evaporação, coleta; diagrama de liofilização." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Esquema da fabricação de nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.
<img alt="Estrutura de nanopartículas (MEV) e distribuição de tamanho (μm, nm), gráfico de análise comparativa." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Imagens de MEV e distribuições de tamanho correspondentes de micropartículas e nanopartículas de PLGA produzidas pelo método de emulsão simples. Em (A), as partículas foram formadas emulsionando 100 mg de PLGA dissolvidos em 1 ml de acetato de etila em 2 ml de Vitamina E-TPGS 0,05%, e endurecidas em 45 ml de Vitamina E-TPGS 0,01%. A distribuição de tamanho correspondente é mostrada em (C). Em (B), as partículas foram formadas emulsionando 200 mg de PLGA e 40 mg de camptotecina dissolvidos em 4 ml de acetato de etila em 4 ml de Vitamina E-TPGS 0,3%, e endurecidas em 90 ml de Vitamina E-TPGS 0,3%. A distribuição de tamanho correspondente é mostrada em (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho</a>.
<img alt="Análise de tamanho de partículas; gráfico de barras e imagens de MEV mostram o efeito da porcentagem de TPGS no tamanho das microesferas." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. O tamanho das partículas depende da concentração do emulsificante. O aumento da concentração de Vitamina E-TPGS resultou em nanopartículas menores. São apresentados os diâmetros médios e as imagens correspondentes de MEV de partículas preparadas por emulsificação de 100 mg de PLGA dissolvido em 1 ml de acetato de etila em soluções contendo (A) 0,01%, (B) 0,05%, (C) 0,1% ou (D) 0,3% de Vitamina E-TPGS e posterior endurecimento em 45 ml de solução 0,3% de Vitamina E-TPGS. As barras de erro representam o desvio padrão de 200 medições de diâmetro realizadas em 2 imagens de um único lote. A escala representa 5 μm (A-C) e 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.
<img alt="Micrografia de MEV mostrando a morfologia das partículas e agregação. Análise da microestrutura do pó." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Artefatos da morfologia da superfície observados por MEV. Em (A), houve fusão acentuada e estruturas semelhantes a lâminas presentes em toda a amostra. A concentração de Vitamina E-TPGS era excessiva (1%) para formar partículas discretas. Em (B), algumas regiões da amostra estavam fundidas, contudo, grandes bolsões de nanopartículas discretas existiam, particularmente onde havia falhas na camada de pulverização. Acreditamos que esses artefatos de fusão sejam decorrentes do aquecimento durante o processo de pulverização. Em (C), as partículas inicialmente pareciam lisas, contudo, a exposição prolongada da amostra ao feixe de MEV resultou em formação de covinhas e enrugamento. (D) mostra uma imagem de baixa resolução obtida com exposição mínima da amostra ao feixe de MEV; as partículas parecem lisas com morfologia arredondada. Em (E), a mesma amostra é exposta por um período mais longo, e observa-se distorção evidente de sua morfologia original. Em (F), uma exposição prolongada ao feixe com alta tensão (12 kV) provocou aquecimento e fissuração das partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.

Descrevemos a produção e caracterização de nanopartículas e micropartículas compostas por poli(ácido lático-co-glicólico) utilizando a vitamina E-TPGS como emulsificante. Variando os parâmetros de formulação, como a concentração do emulsificante, é possível produzir nanopartículas com diâmetros médios que variam de 220 nm a 1,98 μm.

Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

O objetivo geral deste procedimento é formar nanopartículas poliméricas de tamanho ajustável. Isso é conseguido primeiramente dissolvendo-se o polímero em um solvente orgânico e adicionando o fármaco ou agente encapsulante fluorescente. O segundo passo consiste em emulsionar o polímero com uma fase aquosa contendo o agente emulsionante e, em seguida, permitir que as partículas se solidifiquem em um volume aquoso maior à medida que o solvente evapora.Em seguida, as partículas são lavadas, coletadas por centrifugação e liofilizadas para armazenamento de longo prazo. O passo final consiste em caracterizar o tamanho das nanopartículas e a morfologia da superfície por meio de microscopia eletrônica de varredura ou imagem de MEV. Em última análise, a MEV é utilizada para demonstrar que o tamanho das nanopartículas pode ser controlado mediante a variação da concentração do emulsificante.As implicações desta técnica estendem-se à terapia de uma variedade de doenças humanas, pois as partículas podem ser personalizadas para encapsular e liberar uma ampla gama de agentes terapêuticos com ação prolongada. No tecido-alvo. A demonstração visual deste método é essencial.Os passos de emulsificação são difíceis de aprender porque aspectos sutis da formação da emulsão podem ter um impacto significativo nas propriedades das partículas. Para iniciar o preparo das nanopartículas, coloque aproximadamente 100 miligramas de ácido polilático co glicólico, também conhecido como PLGA, em um tubo de ensaio de 13 por 100 milímetros. Em seguida, usando uma pipeta serológica de vidro, transfira um mililitro de acetato de etila para a amostra, cubra a boca do tubo com folha de alumínio e depois feche bem com filme adesivo parafilm.Certifique-se de envolver firmemente o parafina ao longo da borda superior do frasco e da borda inferior do papel alumínio para evitar a evaporação do solvente. Marque o nível do solvente no tubo de ensaio e deixe o polímero dissolver durante a noite. No dia seguinte, adicione solvente adicional se ocorrer alguma evaporação.Prepare o seguinte equipamento e materiais em uma capela próxima ao ultrassom. Vortex duas pequenas pipetas de vidro com bolas de borracha e uma placa de agitação magnética. Além disso, coloque um béquer grande cheio de água com gelo sobre um suporte abaixo do ultrassom.Em seguida, adicione 45 mililitros de T-P-G-S de vitamina E a 0,3% peso por volume a um béquer de vidro de 200 mililitros e ajuste a velocidade de agitação para 360 rpm. Em seguida, adicione dois mililitros do T-P-G-S de vitamina E a 0,3% peso por volume a um tubo de ensaio de vidro de 13 por 100 milímetros. Para misturar agentes hidrofóbicos, adicione o encapsulante diretamente à solução polimérica, tomando cuidado para evitar as paredes do tubo de ensaio, e vortexe o tubo até que o encapsulante esteja homogeneamente disperso.Para agentes hidrofílicos, emulsifique o encapsulante com a solução polimérica. Adicione até 50 microlitros de fármaco em tampão à superfície da solução polimérica. Submeta a mistura à ultrassonicação em gelo por aproximadamente 10 segundos ou até que a solução fique opaca e homogênea.Em seguida, agite o tubo de ensaio contendo a vitamina E-T-P-G-S em vórtex na velocidade alta, mantendo o tubo de ensaio na posição vertical. Mantenha a pipeta de vidro a um ou dois centímetros acima do topo do tubo em vórtex e adicione lentamente a solução polimérica gota a gota sobre a superfície do líquido em vórtex. Tenha cuidado para que a pipeta não toque nas paredes do tubo após a adição completa da solução polimérica.Continue agitando a solução em vórtice. Agora, forme uma emulsão por 15 segundos. Transfira imediatamente o polímero emulsionado para o ultrassônico.Mantenha o tubo de ensaio imerso em banho de gelo e sonique a emulsão em três períodos de dez segundos. Mova a emulsão para cima e para baixo ao longo da sonda para garantir uma sonicação uniforme e evite tocar a sonda nas paredes ou no fundo do tubo de ensaio. Pausar de cinco a dez segundos entre cada sonicação de dez segundos para permitir que a solução esfrie antes de prosseguir.Em seguida, adicione um a dois mililitros de T-P-G-S com 0,3% de vitamina E da solução sob agitação à emulsão. Isso irá diluir o polímero emulsionado, facilitando a sua transferência; despeje a emulsão na solução sob agitação. Lave com a solução qualquer resíduo remanescente no tubo de ensaio, transferindo-o para a solução sob agitação.Deixe as nanopartículas endurecerem sob agitação por três horas. Se o encapsulante for sensível à luz, envolva o béquer com folha de alumínio e deixe a parte superior aberta para facilitar a evaporação do solvente para coleta das nanopartículas; comece dividindo o conteúdo em duas tubos de centrífuga de Oak Ridge com volume nominal de 30 mililitros e equilibre-os dentro de 0,1 grama um do outro. Em seguida, centrifugue as nanopartículas em um rotor de ângulo fixo por 15 minutos a 17.000.RC f. Tempos mais longos de centrifugação resultarão na coleta de uma fração maior de nanopartículas menores. Descarte o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet de nanopartículas.Adicione cinco mililitros de água destilada e utilize um banho-maria, um agitador magnético e um vórtex para suspender completamente as nanopartículas. Combine o conteúdo dos dois tubos de centrífuga em um único tubo e adicione 20 mililitros de água destilada, obtendo um volume total de 30 mililitros. Em seguida, repita os passos de centrifugação e lavagem mais duas vezes, totalizando três lavagens.O volume do fluido da última suspensão do pellet deve ser de quatro a cinco mililitros. Congele uma pequena alíquota de nanopartículas livres de telos para imagem em MEV, reservando o restante. Adicione uma proporção ponderal de um para dois de TLO em relação ao polímero como crioprotetor, para garantir uma suspensão completa e uniforme de nanopartículas de PLGA.Isso evitará a formação de cristais de gelo, os quais podem danificar a superfície das partículas e induzir agregação. Transfira as nanopartículas para um tubo de centrífuga de cinco mililitros previamente pesado e, em seguida, congele a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Em seguida, remova a tampa do tubo e cubra a abertura fixando um pedaço de tecido de laboratório sobre o topo com um elástico.Proceda rapidamente para que o conteúdo não derreta, caso haja derretimento. Recongele antes de colocar no liofilizador, liofilize a amostra de cinco mililitros por 72 horas. Em seguida, recoloque a tampa e enrole o tubo para armazenar as partículas liofilizadas a menos 80 graus Celsius.No dia da imagem, coloque uma tira de fita adesiva de carbono dupla-face sobre um suporte para MEV. Rotule a parte metálica do suporte com marcador permanente para referência posterior. Utilize uma espátula metálica para coletar uma pequena quantidade de nanopartículas liofilizadas e espalhe-as suavemente sobre a superfície da fita.Escove a superfície do suporte com tecido de laboratório ou use ar comprimido para remover nanopartículas soltas. Visualize as partículas utilizando uma distância de trabalho de cinco a 15 milímetros do feixe, intensidade de cinco a 12 quilovolts e tamanho de ponto de um a três; intensidades de feixe mais altas podem resultar em aquecimento regional da amostra, o que alterará a morfologia superficial das partículas. Micropartículas são observadas em 100 vezes de magnificação e nanopartículas serão distinguíveis em 3000 vezes.Aumente a ampliação focando o topo de uma esfera para localizar partículas que possam ser facilmente visualizadas com MEV; colete pelo menos três imagens por lote para obter uma amostra representativa da distribuição de tamanho e morfologia das partículas. Utilizando este método, as partículas podem ser criadas por uma única emulsão, apresentando-se como esferas individuais não fundidas, com superfície lisa e uma ampla variação de tamanhos distribuídos ao longo da amostra. As micropartículas exibidas aqui possuem um diâmetro médio de 730 nanômetros.Mostram-se aqui nanopartículas criadas por uma única emulsificação que estão encapsulando o fármaco hidrofóbico campin. Essas partículas acabaram por ser ainda menores, com um diâmetro médio de 340 nanômetros. Concentrações mais altas de emulsificante produziram partículas menores, com diâmetros médios decrescendo de 2000 para 200 nanômetros.À medida que a concentração do emulsificante aumentou de 0,01 a 0,3%, conforme mostrado pelas imagens de MEV aqui. No entanto, quando a concentração de vitamina E-T-P-G-S era muito alta, partículas discretas não se formaram; ao utilizar 1% de vitamina E-T-P-G-S, observou-se fusão acentuada e estruturas semelhantes a lâminas presentes em toda a estrutura. Verdadeiro. Uma vez que você tenha aprendido como fabricar nanopartículas de PLG por emulsificação, outros métodos, como modificação de superfície, podem ser realizados para projetar nanopartículas destinadas à interação com tipos celulares específicos ou regiões do corpo.Após assistir a este Vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar partículas com tamanho reprodutível e ajustável por meio de emulsificação.

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Nanopartículas de PLGA formadas por uma ou duas emulsões com Vitamina E-TPGS

Insonação de microbolhas é uma estratégia promissora para a ablação do tumor em reduzido tempo médio poderes acústica, bem como para a entrega prevista para terapêutica. O objetivo do presente estudo é desenvolver estratégias de ciclo de baixa dever de ultra-som pulsante e nanocarriers para maximizar a não-térmicos ablação microvascular e entrega de carga útil para subcutânea C6 gliomas.

O ultra-som contraste Targeted Tratamento de Gliomas em camundongos através de Drogas Levando-entrega de nanopartículas e Ablação Microvascular

Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Fonte: Zhu, J., et. al., Preparação e Caracterização de Novas Nanopartículas que Mimetizam HDL para Encapsulamento do Fator de Crescimento Nervoso. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a montagem passo a passo de nanopartículas que imitam HDL carregadas com NGF usando encapsulamento assistido por protamina e automontagem à base de lipídios para possíveis aplicações de entrega neurotrófica.

Fator de crescimento nervoso encapsulante em nanopartículas que imitam lipoproteínas de alta densidade

O objetivo deste protocolo é descrever a preparação e caracterização de fármacos fisicamente aprisionados e pouco solúveis em água em sistemas micelares de liberação de fármacos compostos por copolímeros em bloco anfifílico.

Preparação e caracterização de Individual e Multi-carregadas com droga Fisicamente Entrapped poliméricos Micelles

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de sulfato de condroitina placentária A peptídeo de vinculação (plCSA-BP)-conjugados lipid-polímero nanopartículas através de etapa única sonication e bioconjugate técnicas. Estas partículas constituem uma nova ferramenta para a entrega de alvo da terapêutica de tumores mais humanos e trophoblasts da placenta para tratar cancros e anormalidades da placenta.

Síntese e caracterização de placentária Condroitina sulfato de uma (plCSA) - Targeting Lipid - nanopartículas de polímero

Flash NanoPrecipitation (FNP) é uma abordagem dimensionável para produzir nanopartículas poliméricas de núcleo-casca. Formulações de laboratório-escala para o encapsulamento de hidrofóbico ou hidrofílico terapêuticas são descritas.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

Este artigo descreve o encapsulamento de falcarindiol em revestidos de lipídeos 74 nm nanopartículas. A absorção celular das nanopartículas por células-tronco humanas em gotículas lipídicas é monitorada por imagem fluorescente e confocal. Nanopartículas são fabricadas pelo método de injeção rápida do solvente de movimento, e seu tamanho é medido com a técnica de espalhamento de luz dinâmica.

Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.

Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.

Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

Hidrogéis de polímero supramolecular injetável para aplicações de entrega de células e medicamentos

Para projetar racionalmente adjuvantes eficientes, desenvolvemos emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-láticas-co-glicólicas (PNPE). O PNPE possuía maciez única e uma interface hidrofóbica para contato celular potente e oferecia carga de antígenos de alto conteúdo, melhorando a afinidade celular do sistema de entrega às células apresentadoras de antígenos e induzindo a internalização eficiente de antígenos.

Afinidade celular da emulsão estabilizada por partículas para aumentar a internalização de antígenos

Aprenda a produzir nanopartículas de PLGA com tamanho ajustável usando emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS como emulsificante. Este método permite controlar o diâmetro das partículas variando a concentração do emulsificante.

Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

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