Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

O objetivo geral deste procedimento é formar nanopartículas poliméricas de tamanho ajustável. Isso é conseguido primeiramente dissolvendo-se o polímero em um solvente orgânico e adicionando o fármaco ou agente encapsulante fluorescente. O segundo passo consiste em emulsionar o polímero com uma fase aquosa contendo o agente emulsionante e, em seguida, permitir que as partículas se solidifiquem em um volume aquoso maior à medida que o solvente evapora.

Em seguida, as partículas são lavadas, coletadas por centrifugação e liofilizadas para armazenamento de longo prazo. O passo final consiste em caracterizar o tamanho das nanopartículas e a morfologia da superfície por meio de microscopia eletrônica de varredura ou imagem de MEV. Em última análise, a MEV é utilizada para demonstrar que o tamanho das nanopartículas pode ser controlado mediante a variação da concentração do emulsificante.

As implicações desta técnica estendem-se à terapia de uma variedade de doenças humanas, pois as partículas podem ser personalizadas para encapsular e liberar uma ampla gama de agentes terapêuticos com ação prolongada. No tecido-alvo. A demonstração visual deste método é essencial.

Os passos de emulsificação são difíceis de aprender porque aspectos sutis da formação da emulsão podem ter um impacto significativo nas propriedades das partículas. Para iniciar o preparo das nanopartículas, coloque aproximadamente 100 miligramas de ácido polilático co glicólico, também conhecido como PLGA, em um tubo de ensaio de 13 por 100 milímetros. Em seguida, usando uma pipeta serológica de vidro, transfira um mililitro de acetato de etila para a amostra, cubra a boca do tubo com folha de alumínio e depois feche bem com filme adesivo parafilm.

Certifique-se de envolver firmemente o parafina ao longo da borda superior do frasco e da borda inferior do papel alumínio para evitar a evaporação do solvente. Marque o nível do solvente no tubo de ensaio e deixe o polímero dissolver durante a noite. No dia seguinte, adicione solvente adicional se ocorrer alguma evaporação.

Prepare o seguinte equipamento e materiais em uma capela próxima ao ultrassom. Vortex duas pequenas pipetas de vidro com bolas de borracha e uma placa de agitação magnética. Além disso, coloque um béquer grande cheio de água com gelo sobre um suporte abaixo do ultrassom.

Em seguida, adicione 45 mililitros de T-P-G-S de vitamina E a 0,3% peso por volume a um béquer de vidro de 200 mililitros e ajuste a velocidade de agitação para 360 rpm. Em seguida, adicione dois mililitros do T-P-G-S de vitamina E a 0,3% peso por volume a um tubo de ensaio de vidro de 13 por 100 milímetros. Para misturar agentes hidrofóbicos, adicione o encapsulante diretamente à solução polimérica, tomando cuidado para evitar as paredes do tubo de ensaio, e vortexe o tubo até que o encapsulante esteja homogeneamente disperso.

Para agentes hidrofílicos, emulsifique o encapsulante com a solução polimérica. Adicione até 50 microlitros de fármaco em tampão à superfície da solução polimérica. Submeta a mistura à ultrassonicação em gelo por aproximadamente 10 segundos ou até que a solução fique opaca e homogênea.

Em seguida, agite o tubo de ensaio contendo a vitamina E-T-P-G-S em vórtex na velocidade alta, mantendo o tubo de ensaio na posição vertical. Mantenha a pipeta de vidro a um ou dois centímetros acima do topo do tubo em vórtex e adicione lentamente a solução polimérica gota a gota sobre a superfície do líquido em vórtex. Tenha cuidado para que a pipeta não toque nas paredes do tubo após a adição completa da solução polimérica.

Continue agitando a solução em vórtice. Agora, forme uma emulsão por 15 segundos. Transfira imediatamente o polímero emulsionado para o ultrassônico.

Mantenha o tubo de ensaio imerso em banho de gelo e sonique a emulsão em três períodos de dez segundos. Mova a emulsão para cima e para baixo ao longo da sonda para garantir uma sonicação uniforme e evite tocar a sonda nas paredes ou no fundo do tubo de ensaio. Pausar de cinco a dez segundos entre cada sonicação de dez segundos para permitir que a solução esfrie antes de prosseguir.

Em seguida, adicione um a dois mililitros de T-P-G-S com 0,3% de vitamina E da solução sob agitação à emulsão. Isso irá diluir o polímero emulsionado, facilitando a sua transferência; despeje a emulsão na solução sob agitação. Lave com a solução qualquer resíduo remanescente no tubo de ensaio, transferindo-o para a solução sob agitação.

Deixe as nanopartículas endurecerem sob agitação por três horas. Se o encapsulante for sensível à luz, envolva o béquer com folha de alumínio e deixe a parte superior aberta para facilitar a evaporação do solvente para coleta das nanopartículas; comece dividindo o conteúdo em duas tubos de centrífuga de Oak Ridge com volume nominal de 30 mililitros e equilibre-os dentro de 0,1 grama um do outro. Em seguida, centrifugue as nanopartículas em um rotor de ângulo fixo por 15 minutos a 17.000.

RC f. Tempos mais longos de centrifugação resultarão na coleta de uma fração maior de nanopartículas menores. Descarte o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet de nanopartículas.

Adicione cinco mililitros de água destilada e utilize um banho-maria, um agitador magnético e um vórtex para suspender completamente as nanopartículas. Combine o conteúdo dos dois tubos de centrífuga em um único tubo e adicione 20 mililitros de água destilada, obtendo um volume total de 30 mililitros. Em seguida, repita os passos de centrifugação e lavagem mais duas vezes, totalizando três lavagens.

O volume do fluido da última suspensão do pellet deve ser de quatro a cinco mililitros. Congele uma pequena alíquota de nanopartículas livres de telos para imagem em MEV, reservando o restante. Adicione uma proporção ponderal de um para dois de TLO em relação ao polímero como crioprotetor, para garantir uma suspensão completa e uniforme de nanopartículas de PLGA.

Isso evitará a formação de cristais de gelo, os quais podem danificar a superfície das partículas e induzir agregação. Transfira as nanopartículas para um tubo de centrífuga de cinco mililitros previamente pesado e, em seguida, congele a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Em seguida, remova a tampa do tubo e cubra a abertura fixando um pedaço de tecido de laboratório sobre o topo com um elástico.

Proceda rapidamente para que o conteúdo não derreta, caso haja derretimento. Recongele antes de colocar no liofilizador, liofilize a amostra de cinco mililitros por 72 horas. Em seguida, recoloque a tampa e enrole o tubo para armazenar as partículas liofilizadas a menos 80 graus Celsius.

No dia da imagem, coloque uma tira de fita adesiva de carbono dupla-face sobre um suporte para MEV. Rotule a parte metálica do suporte com marcador permanente para referência posterior. Utilize uma espátula metálica para coletar uma pequena quantidade de nanopartículas liofilizadas e espalhe-as suavemente sobre a superfície da fita.

Escove a superfície do suporte com tecido de laboratório ou use ar comprimido para remover nanopartículas soltas. Visualize as partículas utilizando uma distância de trabalho de cinco a 15 milímetros do feixe, intensidade de cinco a 12 quilovolts e tamanho de ponto de um a três; intensidades de feixe mais altas podem resultar em aquecimento regional da amostra, o que alterará a morfologia superficial das partículas. Micropartículas são observadas em 100 vezes de magnificação e nanopartículas serão distinguíveis em 3000 vezes.

Aumente a ampliação focando o topo de uma esfera para localizar partículas que possam ser facilmente visualizadas com MEV; colete pelo menos três imagens por lote para obter uma amostra representativa da distribuição de tamanho e morfologia das partículas. Utilizando este método, as partículas podem ser criadas por uma única emulsão, apresentando-se como esferas individuais não fundidas, com superfície lisa e uma ampla variação de tamanhos distribuídos ao longo da amostra. As micropartículas exibidas aqui possuem um diâmetro médio de 730 nanômetros.

Mostram-se aqui nanopartículas criadas por uma única emulsificação que estão encapsulando o fármaco hidrofóbico campin. Essas partículas acabaram por ser ainda menores, com um diâmetro médio de 340 nanômetros. Concentrações mais altas de emulsificante produziram partículas menores, com diâmetros médios decrescendo de 2000 para 200 nanômetros.

À medida que a concentração do emulsificante aumentou de 0,01 a 0,3%, conforme mostrado pelas imagens de MEV aqui. No entanto, quando a concentração de vitamina E-T-P-G-S era muito alta, partículas discretas não se formaram; ao utilizar 1% de vitamina E-T-P-G-S, observou-se fusão acentuada e estruturas semelhantes a lâminas presentes em toda a estrutura. Verdadeiro. Uma vez que você tenha aprendido como fabricar nanopartículas de PLG por emulsificação, outros métodos, como modificação de superfície, podem ser realizados para projetar nanopartículas destinadas à interação com tipos celulares específicos ou regiões do corpo.

Após assistir a este Vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar partículas com tamanho reprodutível e ajustável por meio de emulsificação.