Isolamento e caracterização de proteínas quimricas que expressam fc humanos usando adsorbers de membrana de proteína e um fluxo de trabalho simplificado

O objetivo geral deste procedimento é isolar e caracterizar de forma eficiente e eficaz proteínas quiméricas humanas que expressam FC utilizando proteína A, absorvedores de membrana e um fluxo de trabalho simplificado. Isso é realizado primeiramente pela clarificação do sobrenadante do cultivo celular com um filtro de 0,22 mícrons. O segundo passo consiste em montar o sistema de fluxo e iniciar a perfusão do sobrenadante do cultivo celular através do absorvedor de membrana de proteína A.

Em seguida, a proteína expressando FC humana é eluída do absorvedor de membrana, concentrando-se o EIT resultante por ultrafiltração, seguido de troca de tampão por diálise. Os passos finais consistem em utilizar citometria de fluxo e western blotting para determinar a qualidade e quantidade da proteína concentrada. Em última análise, absorvedores de membrana de proteína A, juntamente com um fluxo de trabalho simplificado, demonstram uma redução no tempo de processamento e um aumento potencial no rendimento proteico em comparação com a cromatografia de afinidade tradicional com colunas empacotadas de proteína A aro speed.

Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a cromatografia de afinidade em coluna, é que o absorvedor em membrana permite rendimentos potencialmente maiores da proteína com menor tempo de processamento. A seleção de métodos apropriados de caracterização também pode reduzir o tempo de processamento. Prepare o absorvedor em membrana seguindo as instruções do fabricante, garantindo que todas as soluções perfundidas estejam à temperatura ambiente e pré-filtradas através de um filtro de 0,22 mícron. Para começar, preencha uma seringa de 10 mililitros com solução salina tamponada com fosfato de KO ou DPBS filtrada em 0,22 mícron e elimine todas as bolhas de ar.

Certifique-se de que o ar nunca entre no absorvedor de membrana; perfunda com DPBS para remover a solução de armazenamento e equilibrar o absorvedor de membrana imediatamente antes do uso. Filtre imediatamente o sobrenadante do cultivo celular antes da perfusão através do absorvedor de membrana utilizando uma unidade de filtração estéril a vácuo com poro de 0,22 mícrons para carregar o absorvedor de membrana de proteína A; aspire o sobrenadante do cultivo celular para dentro de uma seringa com conexão tipo lure lock e elimine todas as bolhas de ar para montar os materiais e equipamentos. Primeiro, conecte a seringa à entrada do absorvedor de membrana.

Conecte uma tubulação flexível à saída do absorvedor de membrana, se desejar. Coloque um filtro de seringa de 0,22 mícron entre a seringa e o absorvedor de membrana. Utilize um frasco ou garrafa para coletar o efluente proveniente do absorvedor.

Configure a bomba de seringa na vazão volumétrica desejada, mas não exceda a vazão recomendada pelo fabricante. Filtre o sobrenadante do cultivo celular através do absorvedor de membrana, coletando o fluxo de saída. Recarregue a seringa com sobrenadante conforme necessário.

Se desejar, teste o fluxo passante quanto à presença de proteína utilizando citometria de fluxo, western blot ou ELISA, conforme preferência do laboratório; normalmente, não é necessário refazer a perfusão do fluxo passante para eluir a proteína do absorvedor de membrana. Primeiro, lave o absorvedor de membrana com 10 mililitros de DPBS para remover qualquer proteína não ligada. Elua a proteína do absorvedor de membrana na taxa de fluxo desejada.

Utilizando de 10 a 15 mililitros de tampão de eluição. Colete o EIT em um tubo contendo tampão neutralizante em 10% do volume de eluição. Após a eluição da proteína, regenere o absorvedor de membrana de acordo com as instruções do fabricante.

Preencha o absorvedor de membrana com etanol 20% em DPBS para armazenamento de longo prazo a quatro graus Celsius. Deposite todo o EIT em uma unidade de filtro centrífugo com corte de peso molecular de 10 kilodaltons.

Siga as instruções do fabricante para a diálise por centrifugação. O retenhato. Em uma unidade de diálise de pequeno volume com um limite de peso molecular de 10 kilodaltons, contra o tampão de escolha, pode ser necessário adicionar tampão ao material dialisado.

Se a precipitação de proteínas for uma preocupação, resolva as proteínas purificadas e os padrões de FC no gel de escolha por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras, conforme desejado. Utilize um gel mini em vez de um gel grande para minimizar o tempo de corrida; carregue múltiplas quantidades de amostra da proteína purificada, incluindo amostras diluídas com DPBS, para garantir que os sinais das bandas da proteína purificada estejam dentro da faixa linear de sinal dos padrões de FC. Na análise da imagem após a separação no gel, transfira as proteínas do gel para uma membrana de fluoreto de poliolefina em um sistema de tampão descontínuo utilizando um blotter semi-seco, seguindo as instruções do fabricante; o tempo de transferência é tipicamente de cinco a 10 minutos.

Manche o gel após a transferência para verificar a eficiência da transferência. Realize o imunoblot com anti-FC ou anti-IgG conjugado à fosfatase alcalina ou peroxidase do rabanete (horseradish peroxidase) utilizando uma detecção proteica assistida por vácuo. O tempo de imunoblot é tipicamente inferior a uma hora.

Desenvolva o blot imunológico utilizando o substrato e o método de escolha. Quantifique a proteína purificada por meio de análise de imagem. Realize uma regressão linear nos sinais das bandas provenientes dos padrões de FC.

Se o R quadrado for maior que 0,90, utilize a equação da reta para calcular a quantidade de proteína a partir do sinal da banda, levando em consideração a diluição da amostra, se necessário. Como a quantificação da proteína é realizada com base no fc, ajuste o valor para as diferenças de peso molecular entre a proteína e o fc. Se o R quadrado for menor que 0,90, repita o procedimento de western blot acelerado.

Finalmente, valide a proteína utilizando ensaios funcionais ou métodos para detectar FC por citometria de fluxo. A imunoblotagem ou a citometria de fluxo EISA foi utilizada para testar a presença de GAL um HFC funcional no sobrenadante da cultura celular inicial, conforme indicado pelo histograma azul. O meio de cultura celular fresco, mostrado aqui em vermelho, serviu como controle negativo. Sobrepondo este histograma em verde está o fluxo contínuo, indicando que o absorvedor de membrana capturou e reteve eficientemente GAL um HFC. GAL um HFC foi eluído do absorvedor de membrana em incrementos de um mililitro, a uma taxa de um mililitro por minuto, utilizando um tampão ácido baseado em amina, e as frações de eluição neutralizadas foram subsequentemente testadas quanto à presença de GAL um HFC funcional por meio de citometria de fluxo. O sinal de GAL um HFC aumentou sequencialmente a partir da eluição um, aproximadamente igual ao controle negativo, até um máximo na EE3, e depois diminuiu para um nível quase constante nas eluições nove e dez.

O EEU final 10 não alcançou equivalência ao sinal do controle negativo devido à retenção residual do adsorvedor de GL um HFC. A quantificação e caracterização do GL um HFC purificado foram realizadas por meio de um procedimento de western blotting, acelerado por transferência semi-úmida e imunomarcção assistida a vácuo. Por meio da comparação do sinal de GA um HFC com padrões de quantificação de HFC, tanto a quantidade quanto a qualidade do material purificado foram determinadas.

Os sinais de GAL um HFC e de GAL um HFC degradado estavam dentro da faixa dos padrões. As intensidades dos sinais das bandas padrão de HFC apresentaram relação linear com a quantidade de HFC presente. A concentração de GAL um HFC purificado com base no HFC foi determinada como sendo 450 microgramas por mililitro por meio de processamento de imagem.

Ajustando pelo peso molecular de G uma HFC. A concentração do material purificado foi de 720 microgramas por mililitro. Em contraste, foi carregada quantidade excessiva de GAL purificada uma HFC nas linhas seis e sete do blot ocidental mostrado aqui, o que gerou sinais que saturaram ou excederam a faixa dos padrões de HFC, impedindo assim a quantificação.

Uma alternativa ao western blot é a coloração de géis Kumasi, que pode servir como uma verificação rápida de controle de qualidade e/ou método de quantificação. Observe que uma faixa em aproximadamente 10 quilodaltons, além de faixas em aproximadamente 25 quilodaltons e 40 quilodaltons, estava presente na amostra degradada de GAL um HFC. Essa faixa corresponde ao GAL um HFC degradado que foi não reativo com o anticorpo de detecção utilizado nos western blots.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar proteínas quiméricas humanas que expressam FC utilizando absorvedores de membrana e como caracterizar essas proteínas em apenas quatro horas.