Um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em Exercício Capacidade e Cardiac Adaptação em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é acelerar o processo natural de atresia folicular nos ovários, resultando assim em falência ovariana, esgotamento do estrogênio e uma fêmea não cíclica, uma condição que imita de perto a menopausa. Isso é realizado primeiramente administrando-se, durante 15 a 20 dias consecutivos, a substância química industrial dióxido de vinilciclo (VCD), que demonstrou especificamente atingir e destruir folículos ovarianos primários e primordiais pequenos ao acelerar seu processo natural de atresia. O segundo passo consiste em determinar o ciclo estral e a ciclicidade ovariana por meio de citologia vaginal, iniciando-se aproximadamente seis semanas após o início das injeções de VCD.

Deve-se observar 15 a 20 dias de persistência de dste ou ausência de ciclos por meio de citologia vaginal para confirmar a perda dos ciclos e a falência ovariana. O passo final consiste em implementar uma intervenção que possa ser afetada pela menopausa ou pela transição para a menopausa, como o exercício voluntário em roda de gaiola e a adaptação cardíaca. Em última análise, a atividade voluntária na roda de gaiola e a adaptação cardíaca são utilizadas para verificar se a menopausa reduz a atividade na roda de gaiola.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a ooforectomia, é que a ooforectomia é um procedimento cirúrgico que resulta na depleção súbita de estrogênio, ao contrário da perda progressiva natural de estrogênio que ocorre durante a transição pré a pós-menopausa. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de doenças metabólicas e cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa, pois essas mulheres são particularmente mais suscetíveis à síndrome metabólica e suas comorbidades associadas, incluindo doenças cardiovasculares, em comparação com mulheres pré-menopausadas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos da citologia vaginal são difíceis de aprender, exigindo cuidado na execução da técnica adequada de esfregaço e na identificação do ciclo EST.

Quatro, o dióxido de vinilciclina ou VCD é armazenado a menos 20 graus Celsius. Para preparar o VCD para o protocolo de injeção, adicione 0,587 mililitros de VCD a um frasco limpo para dosagem e complete o volume final para 10 mililitros com óleo de gergelim, cubra e feche com parafina, e misture invertendo suavemente. Armazene a quatro graus Celsius por até sete dias.

Para iniciar o protocolo de injeção de VCD, pese dois camundongos com dois meses de idade durante 20 dias consecutivos, administrando injeções intraperitoneais diárias de VCD à temperatura ambiente na dose de 160 miligramas por quilograma, utilizando uma agulha de 27 graus durante o período de injeção. Tente alternar os locais de injeção para reduzir as chances de infecção local de maneira semelhante. Injete nos camundongos controle a solução veículo, óleo de gergelim, em um volume de 2,5 mililitros por quilograma após a conclusão do período de injeção.

Monitore o ciclo esra diariamente obtendo esfregaços vaginais. Um dos fatores críticos para o sucesso deste estudo é obter esfregaços vaginais de alta qualidade para a determinação citológica. Restrinja os camundongos utilizando o método de segurar a nuca.

Insira um conta-gotas com 0,2 mililitros de solução salina estéril na abertura vaginal até uma profundidade de 0,5 centímetros. Misture a solução salina injetada três vezes com o conta-gotas e, em seguida, coloque uma gota em uma lâmina em branco. Avalie imediatamente cada amostra microscopicamente utilizando um microscópio óptico padrão com ampliação de 100 x para confirmar a falência ovariana.

Posteriormente, os camundongos menopausados induzidos por VCD são utilizados para os experimentos de exercício. O equipamento de roda de gaiola consiste em uma roda com diâmetro de 11,5 centímetros e superfície de corrida com cinco centímetros de largura, equipada com um contador digital magnético ativado pela rotação da roda. Antes de cada teste de corrida em roda, calibre o equipamento de roda de gaiola de acordo com as orientações do fabricante.

Meça o diâmetro interno da roda giratória. Calcule a circunferência e insira esse valor no contador digital como tamanho da roda para montar a roda na gaiola, deslize a roda. Atravesse a grade superior da gaiola do animal.

Fixe o suporte da roda à grade da gaiola com clipes de papel. Os clipes devem estar na parte superior da grade, longe do animal. Passe a parte do computador e quaisquer cabos extras através da grade da gaiola.

Coloque o computador e o excesso de cabo fora do alcance do animal. Isso pode ser feito colocando um recipiente plástico de médio porte sobre os fios do compartimento para segurar o excesso de cabo do computador. Em seguida, fixe a parte do computador do contador digital magnético no suporte da roda.

Usando fita adesiva, prenda o ímã solto do contador magnético digital à barra central no mesmo lado do cabo do ímã que se conecta ao computador. Novamente, utilize fita suficiente para proteger o ímã contra danos por roedura. O ímã deve ser posicionado de modo que cada rotação da roda seja registrada pelo computador, sem qualquer interferência ou resistência ao giro completo da roda.

Conecte a roda giratória à roda. Fixe-a inserindo os pinos do suporte da roda nos orifícios de montagem nas barras centrais da roda. Certifique-se de que a roda possa girar livremente.

O equipamento deve ser monitorado diariamente quanto a danos por roedura e reparado conforme necessário durante o experimento. Sete camundongos fêmeas, da linhagem consanguínea C57, black six e B6C3F1, com sete meses de idade, provenientes de uma mesma ninhada, são aleatoriamente distribuídos para o regime de exercícios ou para o grupo controle sedentário. Como são mantidos individualmente os animais experimentais? Em gaiolas de 47 por 26 por 14,5 centímetros, com acesso irrestrito a uma roda para corrida, durante 28 dias. Os animais controle são mantidos em grupo em gaiolas sem roda.

Forneça água e ração padrão para roedores dura a todos os animais. Adicione lido manualmente e registre diariamente os valores da distância percorrida e do tempo total gasto correndo, fornecidos pelo contador magnético; registre os valores de distância e tempo dentro do mesmo período de uma hora todos os dias, para obter valores precisos e consistentes ao longo dos 28 dias do período de exercício. Após cada registro diário, limpe o contador magnético para garantir leituras precisas no dia seguinte.

Após o período específico de exercício, os pesos corporais dos animais eutanasiados são registrados antes da coleta dos tecidos. Para expor o coração, realize uma incisão mediana na face ventral, abra o diafragma e visualize rapidamente o coração. Resseque o coração na base e coloque-o em solução salina tamponada com fosfato gelada para lavar adequadamente o sangue ventricular residual. Remova os tecidos excessivos do coração, pese o órgão inteiro e congele rapidamente em nitrogênio líquido, se desejado.

Coletar tecidos excisados adicionais, lavar com uma solução modificada de salina tamponada com fosfato gelada e congelar rapidamente em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Neste estudo, a falência ovariana foi induzida pelo tratamento com VCD e confirmada mediante exame microscópico de esfregaços vaginais. A fase do ciclo estral é determinada pela proporção de células epiteliais, células epiteliais quantificadas e leucócitos em células epiteliais nucleadas PROEs, nas quais predominam as células epiteliais.

Aqui, as setas indicam células nucleadas durante o estro, em que predominam células epiteliais escamosas anucleadas quantificadas. O estro caracteriza-se por uma mistura de tipos celulares com predomínio de leucócitos. O diestro é dominado por leucócitos.

O ciclo estral em camundongos normalmente dura quatro dias antes da injeção de VCD. Os animais foram considerados acíclicos após 15 dias de diestro persistente. Esta figura mostra o comprimento médio em dias do ciclo estral dos grupos injetados com veículo e com VCD.

Um ciclo é medido a partir do primeiro dia do estro até o primeiro dia do próximo período. Na ES, a citologia vaginal começou aproximadamente seis semanas após o início das injeções. Observou-se que os ciclos de estro em animais injetados com VCD tornaram-se irregulares em comparação com os animais injetados com veículo, e após 12 ciclos de estro, a citologia de todos os animais injetados com VCD não indicava mais ciclagem ao final do protocolo de injeção de VCD. A coloração com hematoxilina e eosina (H e E) de cortes transversais do tecido ovariano revelou atrofia significativa no tecido ovariano tratado com VCD em comparação com os controles.

Quando analisado com aumento de 20x a 200x, observou-se uma depleção completa de folículos primários e primordiais no tecido tratado com VCD. Em contraste com o tecido tratado com veículo, o efeito da falência ovariana induzida por VCD sobre o desempenho no exercício foi testado em camundongos de sete meses de idade, tratados com VCD ou com veículo, de duas linhagens; os valores diários de exercício em roda de gaiola foram registrados quanto ao tempo e à distância percorrida por cada animal ao longo de um período de quatro semanas de exercício. Esta figura mostra as médias semanais dos valores diários de corrida em relação à distância, tempo e velocidade.

Para camundongos C57, black six tratados com veículo ou VCD, não foram observadas diferenças significativas no desempenho físico medido pela distância média diária percorrida e tempo gasto na roda entre os grupos tratados com VCD e com veículo, tanto na linhagem C57, black six quanto na linhagem B6C3F1. Isso indica que o impacto da falência ovariana induzida por VCD sobre o exercício voluntário na roda transcende pelo menos duas linhagens de camundongos após a duração do protocolo de exercício voluntário na gaiola. Os morfométricos corporais foram registrados e os corações foram rapidamente excisados e pesados, em concordância com observações anteriores.

Hipertrofia cardíaca em resposta ao exercício na roda de gaiola, medida pelo peso absoluto do coração e pelo peso cardíaco normalizado em relação ao comprimento da tíbia, foi observada. Embora a massa cardíaca absoluta e a relação entre peso cardíaco e comprimento da tíbia fossem significativamente maiores em camundongos tratados com veículo e VCD quando comparados aos seus pares sedentários, não houve diferenças mensuráveis na hipertrofia cardíaca entre o grupo controle e o grupo com falência ovariana induzida por VCD. Após o exercício voluntário na roda de gaiola, finalmente, os camundongos tratados com VCD e com veículo foram submetidos a corrida forçada em esteira para determinar as capacidades de exercício em alta e baixa intensidade.

No protocolo de alta intensidade, a velocidade média da esteira foi aumentada progressivamente a cada 10 minutos até que os camundongos apresentassem sinais de exaustão. Em média, a velocidade máxima de camundongos tratados com veículo foi de 26,7 ± 0,95 metros por minuto, e a velocidade máxima de camundongos tratados com VCD foi de 28 ± 1,4 metros por minuto antes da exaustão. A corrida de baixa intensidade a 20 metros por minuto foi utilizada para avaliar a capacidade de resistência.

Em média, o tempo máximo dos camundongos tratados com veículo foi de 28,3 mais ou menos 1,3 minutos, e o tempo máximo dos camundongos tratados com VCD foi de 29,7 mais ou menos 1,4 minutos antes da exaustão. Não foram encontradas diferenças significativas na capacidade de exercício de alta ou baixa intensidade entre os grupos tratados com veículo e com VCD, indicando que a falência ovariana induzida por VCD não teve efeito sobre a capacidade de exercício dos camundongos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas das ciências celulares, moleculares e fisiológicas explorarem o papel da menopausa em roedores.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar as injeções adequadas de VCD, executar a citologia vaginal e implementar uma intervenção fisiológica.