Name: Um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em Exercício Capacidade e Cardiac Adaptação em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda a induzir falência ovariana quimicamente em camundongos usando VCD para estudar capacidade de exercício e adaptação cardíaca. Este método reproduz progressão natural da menopausa para pesquisa cardiovascular.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder (HL 098256), por um Prêmio de Pesquisa de Desenvolvimento Ciência Mentored Nacional e (K01 AR052840) e Independente Scientist Award (K02 HL105799) do NIH concedido ao JP Konhilas eo Grant Formação Interdisciplinar em Ciências Cardiovasculares (HL007249 ). O apoio foi recebido do Centro Cardíaco Sarver, da Universidade do Arizona e do Steven M. Fundação Gootter.

Todos os experimentos, habitação e cuidados com os animais foi realizada por meio de protocolos que aderiram às diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade do Arizona, e para 2011 as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. O tratamento com 4-vinilciclohexeno diepóxido <ol><li> Protocolo de tratamento VCD: Em uma coifa química, adicionar 0,587 ml de VCD para um balão limpo e trazer o volume final para 10 ml com óleo de gergelim e misture invertendo suavemente, cobrir e selar com Parafilm. Transferir a solução para um frasco de dosagem, selar com Parafilm e armazenar a 4 ° C durante 7 dias. Certifique-se de todos os reagentes são estéreis. <ol><li> Use óleo de gergelim como controlo do veículo como VCD é dissolvido em óleo de sésamo. VCD loja (PM = 140,2 g / mol, densidade = 1,09 g / ml) a -20 ° C. </li><li> Protocolo de injeção VCD: Aos 2 meses de idade, pesar e administrar injeções intraperitoneais diárias de temperamento quartoVCD tura a uma dose de 160 mg / kg durante 20 dias consecutivos. Injectar ratinhos de controlo de uma forma semelhante com a solução do veículo, o óleo de sésamo, em um volume de 2,5 ml / kg. Nota: Durante o período de injeção, tente alternar os locais de injecção para reduzir as chances de infecção local. Utilize a seguinte equação para calcular o volume necessário para a injecção: Peso corporal (g) x kg / 1000 gx 2,5 ml / kg = volume (ml) de solução a injectar, resultando em cerca de 50 ml / injecção, utilizando uma agulha G 27. Devido ao tamanho da agulha de anestésicos locais que não são necessários. </li><li> Monitoramento do ciclo estral: Após o período de injeção é completa, monitorar os ciclos estrais diariamente pela obtenção de esfregaço vaginal. Contenha camundongos usando o método nuca dorso. Inserir um conta-gotas, com 0,2 ml de solução salina estéril no orifício vaginal, a uma profundidade de 0,5 cm. Triturar salina (3x) e coloque 1 gota em um slide em branco. Imediatamente avaliar amostras microscopicamente usando um microsc luz padrãoope em 100X magnitude. Nota:. Citologia vaginal é determinado para garantir a perda de ciclismo e, portanto, validar falência ovariana Figura 2A ilustra citologia vaginal típico em diferentes fases do ciclo estral em ratos, ou seja, proestro, estro, metaestro, diestro 17-19. Durante proestro, células incluem células epiteliais nucleadas (Figura 2A, as setas indicam as células nucleadas); durante o estro, as células são predominantemente cornified células epiteliais escamosas; Metaestro é caracterizado por uma mistura de tipos de células, com predomínio de leucócitos; Diestro é dominado por leucócitos. Ajustamento do plano focal podem ser necessários para a visualização de células e do núcleo ao longo da amostra. Tal como ilustrado na Figura 2B, um ciclo típico de estro murino é de 4-5 dias. Ratos são considerados acíclico após 15 dias consecutivos em diestro persistente. Monitorar continuamente ciclo estral durante toda a duração do estudo poriod para confirmar ausência de ciclo estral em VCD tratados camundongos. </li></ol></li></ol> 2. Voluntário Exercício Gaiola rodas Puras C57BL / 6 e B6C3F1 camundongos fêmeas, com idades entre 7 meses, estão expostos a voluntária roda gaiola em execução. Casa animais individualmente em uma gaiola (47 cm x 26 cm x 14.5 cm) com acesso livre a uma roda de gaiola por 28 dias. <ol><li> Configuração do equipamento: O aparelho roda gaiola consiste em uma roda de diâmetro 11,5 centímetros com 5,0 centímetros de largura em execução superfície equipado com um contador magnético digital que é ativado por rotação da roda. Antes de cada teste roda de corrida, calibrar a roda gaiola de acordo com as orientações do fabricante. Medir o diâmetro interno da roda de funcionamento, o cálculo da circunferência e introduzir este valor no contador digital, como o tamanho da roda. <ol><li> Prenda a parte do computador do contador magnético digital para o suporte da roda usando fita. </li><li> Conecte a porta do computadoríon do contador magnético digital para o suporte da roda usando fita. </li><li> Fixe o ímã livre do contador magnético digital para o bar central no mesmo lado como o ímã com cabo para o computador, gravando novamente o suficiente para proteger o ímã de mastigar danos. Os ímans devem ser posicionados de modo a que cada rotação da roda é registado pelo computador, sem qualquer interferência ou resistência para completar a rotação da roda. Nota: A fita adesiva foi usada com sucesso para fixar os componentes do contador magnética digital para a roda de funcionamento. A gravação deve ser suficiente para cobrir completamente o íman e prevenir danos a partir de mascar pelo animal. O ímã deve ser posicionado o mais próximo possível para a roda sem impedir seu movimento. No entanto, a configuração deve ser monitorada diariamente para mastigar danos e reparado, se necessário. </li><li> Montar o volante para a gaiola, deslizando a roda ficar pelo topo fiação da gaiola animal. Fixe o suporte da roda de tele fiação gaiola com grampos da pasta. Nota: O clipe deve estar na parte superior da fiação, de distância a partir do animal. Alimente a parte do computador e qualquer cabo extra através da fiação da gaiola. Posicione o computador eo excesso de cabo fora do alcance do animal. Isto pode ser conseguido através da colocação de um plástico de tamanho médio pesa prato em cima da fiação da gaiola para conter o computador e o excesso de cabo. </li></ol></li><li> Exercício: Para uma determinada maca, atribuir aleatoriamente ratos para tanto o controle sedentário ou regime de exercícios. Dê todos os animais de água e padrão ad libitum roedor duro comida. <ol><li> Gravar manualmente os valores diários para o correu a distância (km / dia) e tempo total gasto em funcionamento (h / dia), dado pelo contador magnético. Valores de distância e tempo recorde dentro do mesmo período de tempo de 1 hora por dia para valores precisos e consistentes durante toda a duração 28 dias do período de exercício. Clear (zero) o contador magnético após a gravação de cada dia para garantir leituras precisas a seguiring dia. </li><li> Calcular o valor médio da distância e da velocidade, para cada grupo. Calcular a velocidade com base nos valores dados da distância e do tempo em cada dia para cada rato. Os dados podem ser apresentados como médias diárias ou semanais para cada um dos parâmetros medidos. </li></ol></li><li> Colheita de tecidos: No final do período de exercício específico, eutanásia exercido e controles sedentários dentro de 30 min de remoção das gaiolas por deslocamento cervical sob anestesia inalatória. Pesar de massa corporal e os corações rapidamente especiais de consumo, músculo esquelético, e os ovários. <ol><li> No momento da colheita de tecido, de montagem e de manchar os ovários recolhidos com hemotoxilina e eosina (H &amp;A; Figura 2C). Sob ampliação, contar e classificar como folículos primordial, primário, secundário ou antral para cada animal tratado e controlar-VCD 20. Um folículo primordial contém uma pequena oócito primário, uma única camada de células da granulosa achatadas ou escamosas de perto que se opõem ao ovócito e um basallâmina. Um folículo primário é definida pela presença de uma ou mais células da granulosa cubóides que estão dispostos em uma única camada em torno do oócito. Um folículo secundário contém células da granulosa que formam várias camadas ao redor do oócito, e uma teca. Um folículos antrais é caracterizada por uma cavidade ou &quot;antro&quot; contendo fluido. </li><li> Para excisar o coração, fazer uma incisão média, no lado ventral e visualizar o coração após a abertura do diafragma. Rapidamente extirpar o coração na base e coloque em tampão fosfato suficientemente fria para lavar o sangue-out ventricular residual. Apare o coração do excesso de tecido, pese todo o coração e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Lave todos os outros tecidos excisados ​​com uma solução salina modificado gelada tamponada com fosfato (PBS), e encaixe por congelação em isopentano arrefecido em azoto líquido. </li></ol></li></ol> 3. Ergométrico Forçado <ol><li> Quando se emprega um exercício forçado paradigma to medir a capacidade de exercício, use uma esteira e configurado da seguinte forma: <ol><li> Coloque uma grade de choque elétrico na base da rampa de esteira. Este choque gerada serve como um estímulo para o exercício. A intensidade ea freqüência dos estímulos elétricos são controlados manualmente pelos usuários. As grades podem ser ativadas ou desativadas individualmente para cada pista. Toda a coleta de dados é feita manualmente. </li><li> Periodicamente, calibrar a esteira de acordo com as orientações do fabricante. <ol><li> Certifique-se de que o controlador da escada rolante frente alternância painel é definido como &quot;STOP&quot;. </li><li> Sensor de velocidade local em lane1 cinto de esteira e prenda com a porca de parafuso na posição mostrada abaixo. </li><li> Utilização do selector no painel frontal do controlador da escada rolante, ajustar a velocidade de 88,7 m / min Em seguida, defina a freqüência de estímulo elétrico para 2 Hz na escada rolante controlador do painel frontal. </li><li> Pressione o botão &quot;ODOMETER Reset&quot; para inicializar o procedimento de calibração. <strong&gt; Nota: Os grupos controle sedentário ou sem exercício deve ser incluído no projeto experimental. O grupo sedentário é a mesma faixa etária do grupo de exercícios. Nós mostramos anteriormente que a habitação os ratos sedentários individualmente em gaiolas de tamanho igual para os ratos exercitados não impactou os parâmetros de interesse, quando comparados aos ratos sedentários alojados com os irmãos. Portanto, ratos sedentários foram mantidos com os irmãos no mesmo quarto que os ratos exercitados. </li></ol></li></ol></li><li> Aclimatação: Aclimatar ratos para a esteira de 3-7 dias antes do experimento diariamente. Para fazer isso, os ratos lugar na esteira com as grades de imóvel e de choque da correia fora, mas com o motor cinto (ruído). Deixe camundongos sem ser perturbado por pelo menos 15 min. </li><li> Aquecimento: Aqueça passos, usado neste protocolo são as seguintes: <ol><li> Coloque cada rato na esteira. Desative a grade de choque e aumentar a velocidade da esteira para 4 m / min para 15 min. </li><li> Ativar a grade choque e manter a velocidade da esteira de4 velocidade de correia m / min durante 10 min adicionais. </li></ol></li><li> Regimes de treinamento Exercício <ol><li> Após aquecimento, manter as redes de choque sobre e aumentar a velocidade da esteira a 5 m / min para 15 min. </li><li> Aumentar a velocidade da correia de 15 m / min durante 15 min. </li><li> Depois do treinamento, transferência de ratos de volta para suas gaiolas. Nota: Neste estudo, o treinamento físico foi realizado diariamente por uma semana. </li><li> Aguda regime de exercícios: um regime aguda exercício foi concebido para determinar os efeitos de curto e longo prazo de extrema ergométrico. <ol><li> Seguindo aquecimento, aumentar a velocidade da correia de 5 m / min a 10, 15, 20, 25, e 30 m / min em intervalos de 10 min. Nota: Terminar exercício se os ratos são incapazes de continuar a execução ou mostrar sinais de cansaço ou angústia. No nosso estudo, a maioria dos animais foram parados a 25 m / min, e nenhum animal passou a 30 m / min fase. </li><li> Teste cada rato três vezes, permitindo 2-3 dias entre cada teste. Calcule os valores médios em todos os exercíciosCise sessões para cada rato. </li></ol></li><li> Regime de exercícios para a resistência: Um protocolo de exercícios de resistência é projetado para treinar os ratos para uma exposição prolongada ao exercício estímulo esteira. Este tipo de protocolo de testa a capacidade para tolerar os efeitos a longo prazo do stress de exercício moderado. <ol><li> Comece com a velocidade da esteira delineado durante o período de aquecimento, 4 m / min. </li><li> Aumentar gradualmente a velocidade da esteira por 1m/min até uma velocidade final de 20 m / min é atingido. Duração total de um protocolo de estudo típico é de 50 min. </li><li> Depois de regime de exercícios, transferir ratos de volta para suas gaiolas. Nota: A execução camundongos à exaustão é evitado. Se em algum momento durante o experimento um rato mostra sinais de esgotamento, desativar a grade de choque e permitir que o mouse para descansar e se recuperar. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Dados e análise estatística <ol><li> Apresentar os resultados como média ± EPM e usar 2-way ANOVA (grupo de tratamento e exercise como fatores principais), seguido por um teste hoc Student-Newman Keuls post ou teste t de um aluno para comparar as diferenças entre os valores médios. </li><li> Determinar a variação percentual da massa cardíaca com exercício, comparando a massa de cada animal exercido para a massa cardíaca média do grupo sedentário. A diferença de massa cardíaca é, então, expressa como uma variação percentual de animais sedentários para cada respectivo animal. valores de p &lt;0,05 são considerados estatisticamente significativos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Ambos roda gaiola exercício de corrida em esteira e regimes de exercício têm sido utilizados em nossos estudos anteriores 16,21,22. Todos os animais são mantidos em salas de ginástica dedicadas a minimizar as perturbações ambientais ou humanos. Qualquer perturbação dos animais &#39;ritmo biológico pode afetar significativamente o desempenho dos animais exercício. Portanto, os cuidados de todo animal, de monitoramento e gravação de desempenho e regimes de exercícios deve ser feito dentro de um mesmo período de tempo todos os dias. Os investigadores devem esforçar-se para evitar o estresse extra para os animais, exibindo precauções, tais como a limitação da duração da exposição ao estresse e cobrindo as gaiolas quando apropriado. Exercício roda gaiola Ao preparar o aparelho roda gaiola, a roda deve ser facilmente acessível para o mouse para montar e sair. Não deveria cama mínima no fundo da gaiola para evitar que os ratinhos de aninhamento em torno da roda e impedindo fremovimento e roda. O sensor magnético foi colocado sobre a parte fixa da roda e o íman fixado à roda livre, de modo a contar cada rotação da roda, como o rato exercido. O dispositivo de registo ligados ao sensor magnético deve ser colocado por cima da tampa de arame da gaiola, e que todos os fios expostos precisam ser gravado ou seja mantido fora do alcance dos ratos, de modo a proporcionar uma barreira contra os danos de mascar. Os sensores magnéticos e magnéticos também foram gravadas com as estruturas adequadas para prevenir os danos e movimento indesejado. Durante a coleta de dados por dia, todos os fios gravadas devem ser cuidadosamente verificados para garantir os fios permanecem intactos e deve ser retaped conforme necessário. Desde que pode exigir vários dias para ratos para se acostumar com o novo ambiente e começar a se exercitar regularmente, o registro de dados deve ser adaptado para cada animal. Embora os animais tendem a passar muitas horas na roda, a maior parte do funcionamento ocorre durante a noite. Portanto, alguns animais podem revelar high atividade desempenho, mesmo se eles aparecem latentes durante o dia. Além disso, não é incomum que alguns animais exibirão limitado roda gaiola em execução. Tipicamente, a actividade roda gaiola que equivale a uma média de 1 km / dia ou menos é o resultado da actividade de gaiola aleatório e não está relacionado com qualquer estímulo funcionamento significativo. Portanto, os animais cujos parâmetros de funcionamento são em 1 km / dia ou 1 hora / dia ou menos devem ser excluídos nos nonrunners finais de análise de dados. Dependendo dos efeitos específicos de um estudo individual e estirpes de ratinhos envolvidos, o comprimento de exercício pode ser modificado. Nosso estudo anterior mostrou que para ambas as linhagens de camundongos envolvidos, as velocidades médias de execução de roda e da duração do exercício na roda gaiola aumentada gradualmente ao longo do tempo e estabilizou por 4 semanas. Roda da gaiola de corrida é um tipo de exercício voluntário em modelos animais, o que é geralmente considerado como tendo sido realizadas em condições menos estressantes. Unlike exercício em esteira em que certos parâmetros podem ser predefinidos, todos rodando na gaiola teste é voluntária e facilmente afetado por estímulos ambientais ou comportamentais. Portanto, as comparações entre diferentes configurações experimentais são normalmente evitado a menos que um grande número de grupos experimentais são usados. Outras áreas potenciais de pesquisa que podem se beneficiar deste tipo de exercício paradigma são os estudos que incorporam respostas comportamentais com consequências fisiológicas, tais como a neurociência cognitiva. Para estudos que utilizam o paradigma roda gaiola voluntária, os passos mais críticos são configurar gaiola e monitoramento das atividades de exercício. Ergométrico Etapas de aclimatação são necessários para preparar os animais para o protocolo de exercício em esteira. Dependendo do propósito específico do estudo individual, a duração do período de aclimatação pode variar. Neste estudo, um período de uma semana foi escolhido para permitir que os animais acclimcomeu ao aparelho esteira e ruído do motor na gaiola, aquecer períodos são um passo importante do regime de treinamento físico. Semelhante ao homólogos humanos, os ratos devem ser aquecidos antes de entrar em quaisquer regimes de exercício intensivo para evitar lesões e artefatos de dados em potencial. Neste estudo, nós começamos o cinto na velocidade mais baixa possível (4 m / min) com as grades de choque desligado por 15 min. Todos os animais envolvidos começaram a correr dentro e fora do cinto. As grades de choque foram então ligado ea velocidade da esteira mantido a 4 m / min. Para evitar o excesso de enfatizar os ratos, vamos definir o choque elétrico em um nível leve (1 Hz). Dentro de poucos dias, todos os ratinhos adaptado para o cinto de esteira. A duração de funcionamento, bem como da aceleração pode também ser adaptado para cada experimento. A taxa de aceleração inicial recomendada é de 1 m / min. As pistas de esteira de ratos que mostram sinais de exaustão deve ser desligado imediatamente. Normalmente sinais de esgotamento exibidos por mice sobre o tapete rolante são os seguintes: <ol><li> A exposição contínua à rede de choque para&gt; 5-10 seg, </li><li> Perda da capacidade de execução, resultando em exposição grade choque&gt; 5x durante um único regime de exercícios e </li><li> Perda da capacidade de execução, resultando em exposição grade choque&gt; 2 seg pelo menos 3x durante um único regime de exercícios. </li></ol> Os valores listados acima devem ser usados ​​principalmente como orientações para uma experiência específica. Esses parâmetros devem ser determinados para cada protocolo de exercício, uma vez que varia de rato cepa para cepa mouse, experiência de experimentar, e investigador para investigador. Ao contrário do exercício roda gaiola, estudos de esteira deve ser repetido várias vezes para eliminar os efeitos de fatores ambientais e biológicos sobre a execução de desempenho. Não é incomum ver flutuações na performance de corrida entre os testes até para o mesmo animal. Uma vez que cada regime de exercícios expõe execução ratos para um stress, um intervalo de descanso adequado entre os testes é necessário. Em nossa experiência, 2-3 dias período de descanso entre cada teste foi suficiente para os ratos para se recuperar. Como exercício em esteira humana, a velocidade para o exercício de resistência é melhor determinado pela freqüência cardíaca e saturação de oxigênio no sangue, um feito tecnicamente difícil com os estudos do mouse. A etapa mais crítica de estudos de esteira é a determinação da exaustão, que normalmente varia entre camundongos individuais, e foi definido como 80% da velocidade máxima. Em nossa própria experiência a gravação de resultados podem diferir significativamente entre pesquisadores individuais, uma vez que os critérios para a exaustão são na maior parte subjetiva. Assim, a aplicação coerente dos mesmos critérios durante a gravação é crítica.

O aparecimento natural da menopausa é caracterizada pela diminuição dos folículos primordiais do ovário através de atresia, acabou resultando em senescência ovariana. Nos Estados Unidos, mais de 30% do tempo de vida das mulheres será gasto na pós-menopausa. Em resposta a uma diminuição da função ovariana, várias conseqüências fisiológicas e psicológicas podem ocorrer, incluindo o aumento da adiposidade, a instabilidade vascular e humor ou distúrbios do sono. Por causa do aumento da obesidade / adiposidade em comparação com os seus homólogos na pré-menopausa 1,2, as mulheres na pós-menopausa são particularmente mais suscetíveis à síndrome metabólica e comorbidades associadas, incluindo a doença cardiovascular (DCV) 3. Além disso, está se tornando cada vez mais evidente que a reabilitação cardíaca bem sucedida para os pacientes com doença cardiovascular inclui o exercício aeróbico regular, e que o exercício reduz a morbidade e mortalidade cardiovascular nesses indivíduos 4,5. No entanto, como a capacidade de exercício chaNGES durante a transição pré ao pós-menopausa não tem sido bem estudada. Mais importante ainda, o papel do exercício como uma medida preventiva para o risco de doenças cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa permanece notavelmente pouco estudado. O modelo induzida mais comumente usado para imitar a menopausa nas mulheres é a ovariectomia (OVX) roedor. Recentemente, o trabalho químico 4-vinilciclohexeno diepóxido (VCD) foi mostrado para alvejar especificamente folículos primários e primordiais pequenas, acelerando o processo natural de atresia, resultando em falha do ovário com nenhuma toxicidade óbvia encontrado em outros tecidos do 6. O ciclo do estro de ratos tratados com VCD, que é análogo a um ciclo menstrual humano, cessa dentro de 2-3 meses após a conclusão das injecções de VCD, que por sua vez, resulta em uma retirada gradual de estrogénio, imitando o peri-ao pós-menopausa transição. Assim, um folículo-esgotam, animal ovário intacto aproxima o humano naturalprogressão através do pré ao peri-a transição pós-menopausa 7-9. Além disso, fornece uma alternativa não-cirúrgica para o modelo OVX redução de complicações da cirurgia, como infecção. Neste estudo, foram empregados camundongos menopausa induzida por VCD para estudar o impacto do exercício sobre a adaptação cardíaca em camundongos após a menopausa. Há vários exemplos que sugerem que a associação entre o estrogênio eo exercício roda gaiola em roedores de ambos os sexos 10-13. Depleção de estrogênio por OVX cirúrgico diminui a atividade exercício voluntário em camundongos e ratos 14,15. Dois métodos de exercício foram utilizados neste estudo para testar a capacidade de exercício dos ratinhos menopausa induzidas por VCD. Roda da gaiola de corrida é geralmente considerado como um tipo de exercício voluntário em modelos animais e realizada, provavelmente, em condições menos estressantes. No entanto, a roda de gaiola funcionamento não é indicativo da capacidade de exercício em relação de animais, o que exige que os animais de exerciSE a níveis muito mais elevados. Forçado exercício em esteira foi utilizada para determinar a capacidade de exercício, medida como uma tolerância da intensidade do exercício e resistência. Além disso, já haviam demonstrado que o exercício roda gaiola fornece um estímulo para a hipertrofia cardíaca e este crescimento hipertrófica é dependente do sexo 16. Portanto, nós também mediu adaptação cardíaca ao exercício roda gaiola em ratos menopausa induzida-VCD.

<table><tbody><tr><td>4-Vinilciclohexeno diepóxido (VCD)</td><td>Sigma</td><td>V-3630</td><td></td></tr><tr><td>Roda de 11,5 cm de diâmetro com uma superfície de rolamento de 5,0 cm de largura</td><td>Petsmart</td><td>modelo 6208</td><td></td></tr><tr><td>Contador magnético digital</td><td>Sigma Sport</td><td>modelo BC 600</td><td></td></tr><tr><td>Exercício de passadeira</td><td>Columbus Instruments</td><td>modelo 1055SDRM</td><td></td></tr></tbody></table>

um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em exercício capacidade e cardiac adaptação em ratos

A Method to Study the Impact of Chemically-induced Ovarian Failure on Exercise Capacity and Cardiac Adaptation in Mice

O risco de doença cardiovascular (DCV) aumenta em mulheres na pós-menopausa, no entanto, o papel do exercício, como uma medida preventiva para o risco de doenças cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa não tem sido estudada de forma adequada. Assim, investigamos o impacto do exercício voluntário gaiola rodas e exercício em esteira forçado na adaptação cardíaca em camundongos após a menopausa. O modelo induzida mais comumente usado para imitar a menopausa nas mulheres é a ovariectomia (OVX) roedor. No entanto, o modelo de OVX tem algumas diferenças de menopausa em humanos. Neste estudo, administrado diepóxido 4 vinilciclohexeno (VCD) para ratos fêmeas, o que acelera falência ovariana como um modelo a menopausa alternativa para estudar o impacto do exercício em ratos após a menopausa. VCD acelera seletivamente a perda de folículos primários e primordiais, resultando em um estado endócrino que imita de perto a progressão natural do pré ao peri-pós-menopausa em humanos. Para determinar o impacto do exercício em exercíciocapacidade e adaptação cardíaca em camundongos fêmeas tratadas com VCD, foram utilizados dois métodos. Em primeiro lugar, exposta a um grupo de ratinhos VCD-tratados e não tratados para uma roda de gaiola voluntário. Em segundo lugar, nós usamos ergométrico forçado a determinar a capacidade de exercício em um ratos e tratada tratados com VCD grupos separados medida como uma tolerância da intensidade do exercício e resistência.

Um protocolo experimental típico, como o utilizado no presente estudo, é ilustrada na Figura 1. Após a 20 dias consecutivos de tratamento VCD, citologia vaginal foi usada para determinar a presença ou ausência da ciclicidade nos ratos injectados com VCD; camundongos injetados de veículos também foram monitorados. A fase do ciclo de estro foi determinada pela percentagem de células epiteliais, células epiteliais cornificadas e leucócitos no esfregaço vaginal (Figura 2A). A presença de células epiteliais apenas cornified indicado o rato estava no cio, e, por conseguinte, ainda foi ciclismo. O ciclo do cio em ratinhos dura tipicamente 4 dias, portanto, VCD animais injectados foram considerados acíclico após 15 dias de diestro persistente, em que a citologia vaginal reveladas maioria dos leucócitos (Figura 2A). O ciclo do estro de ratos tratados com VCD tornou-se irregular, e, em seguida, deixado dentro de 2-3 meses após o início das injecções de VCD (Figura 2B) </strong&gt;. Tecido ovariano VCD mostrou atrofia significativa, em comparação aos controles. Em maiores aumentos, vemos um esgotamento completo dos folículos primários e primordiais (Figura 2C). Para testar o efeito de falência ovariana induzida por VCD no desempenho do exercício, nós randomizados 7 meses de idade camundongos tratados com o veículo (duas cepas, C57BL / 6 e B6C3F1) para ambos os grupos de exercício roda sedentários ou gaiola 4-6 semanas seguintes VCD e do cessação de ciclismo (Figura 1). Valores diários de exercício foram registrados para o tempo ea distância para cada animal exercido durante o período de exercício de 4 semanas. As médias semanais de valores de funcionamento diários para a distância, o tempo e velocidade são mostrados na Figura 3 para murganhos C57BL / 6 tratados com veículo ou VCD. Nós não ver diferenças significativas no desempenho do exercício medida pelo tempo médio diário, distância e velocidade na roda gaiola entre-e VCD grupos tratados com o veículo em qualquer C57BL / 6 ou B6C3F1 ratotensão (Figura 4A). As velocidades de execução rodas calculados aumentada gradualmente durante o período de funcionamento de 4 semanas como demonstrado anteriormente 16, mas não foi significativamente diferente entre os grupos experimentais. Esses estudos indicam o impacto da falência ovariana induzida pelo exercício voluntário em VCD roda gaiola transcende pelo menos 2 linhagens de camundongos. Seguindo o período de duração do protocolo voluntário exercício roda gaiola, morfometria corporais foram registados e os corações foram rapidamente excisados ​​e pesados. Nós já haviam demonstrado que o exercício roda gaiola voluntária induz um aumento da massa cardíaca 16. Aqui, nós também mostram hipertrofia cardíaca em resposta ao exercício roda gaiola medida pelo peso do coração absoluto (HW) e HW normalizada no comprimento tibial (TL) (Tabela 1). A massa do coração e da razão absoluta HW / TL foram significativamente maiores em-veículos e camundongos tratados com VCD quando comparados com sedentários. No entanto, não houve measudiferenças comparável em hipertrofia cardíaca entre o controle e os ratos falência ovariana induzida por VCD seguinte voluntária exercício roda gaiola. Em seguida, utilizamos involuntária (forçada) de corrida em esteira para determinar a capacidade de exercício. Nós submetido primeira ratos a um protocolo de alta intensidade que o aumento gradual da velocidade média a cada 10 minutos até a exaustão. Em média, a velocidade máxima do veículo camundongos tratados foi de 26,7 ± 0,95 m / min ea velocidade máxima de VCD camundongos tratados foi de 28 ± 1,4 m / min antes da exaustão. Usamos de menor intensidade rodando a 20 m / min (cerca de 80% do máximo) do ensaio de capacidade de resistência. Como mostrado na Figura 4B, não foi encontrada diferença significativa na capacidade de alta ou baixa intensidade exercício entre veículo e VCD grupo tratado, indicando que a falha ovariana induzida por VCD não teve efeito sobre a capacidade de exercício do mouse. Em conclusão, a menopausa induzida pelo tratamento VCD não tem efeito na r voluntária ou forçada<html> capacidade unning, bem como a resposta adaptativa cardíaca ao exercício. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1.jpg" /> Figura 1. VCD-administração e protocolo experimental. Ratinhos foram administrados VCD (160 mg / kg) ou de óleo de sésamo (controlo do veículo), começando com 2 meses de idade, durante 20 dias consecutivos. Após VCD ou veículos injeções, ciclo estral foram monitorados e cyclicities foram determinados como descrito na seção Métodos. A perda da função do ovário ocorreu dentro de 60-90 dias e foi confirmado por citologia vaginal. Aos 7 meses de idade, os ratos foram expostos ao exercício voluntário roda gaiola durante 4 semanas ou submetido ao protocolo de exercício em esteira. oad/51083/51083fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg &quot;/&gt; Falência ovariana Figura 2 induzida pelo VCD em camundongos A:.. Citologia de um esfregaço vaginal sem mácula de um veículo rato injetado demonstrando os quatro estágios do ciclo estral: 1) proestro, predominantemente constituída por células epiteliais nucleadas 2) estro, caracterizada por un -nucleadas células cornified; 3) metaestro, composto por células epiteliais nucleadas (setas), células epiteliais cornificadas un-nucleadas (setas) e leucócitos; 4) diestro, que consiste principalmente de leucócitos; e B:. Duração média (dias) do ciclo estral de grupos de injeção de VCD veículo-e. Um ciclo é medido a partir do primeiro dia de estro ao primeiro dia do próximo período de estro. Citologia vaginal começou aproximadamente 6 semanas após o início das injeções. Os ciclos estrais de animais com injeção de VCD tornar-se irregular, em comparação com animais com injeção de veículos, e após os ciclos de estro 12, citologia de todos VCD animais injectados não indicado ciclismo C:. HE de tecido do ovário aos 8 meses de idade. Os cortes feitos em espessura 5m para tratados com veículo (painel esquerdo) e (painel direito) camundongos tratados com VCD em 20X (painel superior) e 200X (painel inferior) ampliação. Tecido ovariano com ampliação de 200X mostra um número de folículos em que camundongos tratados com VCD comparação veículos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3.jpg" /> Figura 3. Voluntário desempenho roda gaiola em camundongos fêmeas C57Bl/6J tratados com VCD-veículo ou. Painel esquerdo: Distância média de corrida (km /dia) para cada período de uma semana durante o período de estudo de 4 semanas painel médio: Média de tempo de execução (h / dia) para cada período de uma semana durante o período de estudo de 4 semanas Painel direito:. velocidade média de corrida (km / h) para cada. 1 período semana durante o período de estudo de 4 semanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4.jpg" /> Figura 4. Roda gaiola voluntário e desempenho do tapete rolante em ratos tratados com veículo e VCD. A: (painel superior) C57BL / 6 corrida de longa distância média (km / dia) eo tempo gasto na roda (horas / dia) para cada 24 horas durante o período de estudo de 4 semanas. (Painel Inferior) &amp; #160; B6C3F1 distância média de corrida (km / dia) eo tempo gasto na roda (h / dia) para cada 24 horas durante o período de quatro semanas de estudo B: C57BL / 6 parâmetros de corrida em esteira.. O tempo máximo (painel superior) e velocidade máxima (Painel Botoom) usando protocolos detalhados na seção métodos.

Dois paradigmas de exercício foram testadas em um modelo de rato menopausa induzido quimicamente recém-desenvolvido para examinar o impacto da menopausa na capacidade de exercício e adaptação cardíaca ao exercício.

Um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em Exercício Capacidade e Cardiac Adaptação em Ratos

The risk of cardiovascular disease (CVD) increases in post-menopausal women, yet, the role of exercise, as a preventative measure for CVD risk in ...

O objetivo geral deste procedimento é acelerar o processo natural de atresia folicular nos ovários, resultando assim em falência ovariana, esgotamento do estrogênio e uma fêmea não cíclica, uma condição que imita de perto a menopausa. Isso é realizado primeiramente administrando-se, durante 15 a 20 dias consecutivos, a substância química industrial dióxido de vinilciclo (VCD), que demonstrou especificamente atingir e destruir folículos ovarianos primários e primordiais pequenos ao acelerar seu processo natural de atresia. O segundo passo consiste em determinar o ciclo estral e a ciclicidade ovariana por meio de citologia vaginal, iniciando-se aproximadamente seis semanas após o início das injeções de VCD.Deve-se observar 15 a 20 dias de persistência de dste ou ausência de ciclos por meio de citologia vaginal para confirmar a perda dos ciclos e a falência ovariana. O passo final consiste em implementar uma intervenção que possa ser afetada pela menopausa ou pela transição para a menopausa, como o exercício voluntário em roda de gaiola e a adaptação cardíaca. Em última análise, a atividade voluntária na roda de gaiola e a adaptação cardíaca são utilizadas para verificar se a menopausa reduz a atividade na roda de gaiola.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a ooforectomia, é que a ooforectomia é um procedimento cirúrgico que resulta na depleção súbita de estrogênio, ao contrário da perda progressiva natural de estrogênio que ocorre durante a transição pré a pós-menopausa. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de doenças metabólicas e cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa, pois essas mulheres são particularmente mais suscetíveis à síndrome metabólica e suas comorbidades associadas, incluindo doenças cardiovasculares, em comparação com mulheres pré-menopausadas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos da citologia vaginal são difíceis de aprender, exigindo cuidado na execução da técnica adequada de esfregaço e na identificação do ciclo EST.Quatro, o dióxido de vinilciclina ou VCD é armazenado a menos 20 graus Celsius. Para preparar o VCD para o protocolo de injeção, adicione 0,587 mililitros de VCD a um frasco limpo para dosagem e complete o volume final para 10 mililitros com óleo de gergelim, cubra e feche com parafina, e misture invertendo suavemente. Armazene a quatro graus Celsius por até sete dias.Para iniciar o protocolo de injeção de VCD, pese dois camundongos com dois meses de idade durante 20 dias consecutivos, administrando injeções intraperitoneais diárias de VCD à temperatura ambiente na dose de 160 miligramas por quilograma, utilizando uma agulha de 27 graus durante o período de injeção. Tente alternar os locais de injeção para reduzir as chances de infecção local de maneira semelhante. Injete nos camundongos controle a solução veículo, óleo de gergelim, em um volume de 2,5 mililitros por quilograma após a conclusão do período de injeção.Monitore o ciclo esra diariamente obtendo esfregaços vaginais. Um dos fatores críticos para o sucesso deste estudo é obter esfregaços vaginais de alta qualidade para a determinação citológica. Restrinja os camundongos utilizando o método de segurar a nuca.Insira um conta-gotas com 0,2 mililitros de solução salina estéril na abertura vaginal até uma profundidade de 0,5 centímetros. Misture a solução salina injetada três vezes com o conta-gotas e, em seguida, coloque uma gota em uma lâmina em branco. Avalie imediatamente cada amostra microscopicamente utilizando um microscópio óptico padrão com ampliação de 100 x para confirmar a falência ovariana.Posteriormente, os camundongos menopausados induzidos por VCD são utilizados para os experimentos de exercício. O equipamento de roda de gaiola consiste em uma roda com diâmetro de 11,5 centímetros e superfície de corrida com cinco centímetros de largura, equipada com um contador digital magnético ativado pela rotação da roda. Antes de cada teste de corrida em roda, calibre o equipamento de roda de gaiola de acordo com as orientações do fabricante.Meça o diâmetro interno da roda giratória. Calcule a circunferência e insira esse valor no contador digital como tamanho da roda para montar a roda na gaiola, deslize a roda. Atravesse a grade superior da gaiola do animal.Fixe o suporte da roda à grade da gaiola com clipes de papel. Os clipes devem estar na parte superior da grade, longe do animal. Passe a parte do computador e quaisquer cabos extras através da grade da gaiola.Coloque o computador e o excesso de cabo fora do alcance do animal. Isso pode ser feito colocando um recipiente plástico de médio porte sobre os fios do compartimento para segurar o excesso de cabo do computador. Em seguida, fixe a parte do computador do contador digital magnético no suporte da roda.Usando fita adesiva, prenda o ímã solto do contador magnético digital à barra central no mesmo lado do cabo do ímã que se conecta ao computador. Novamente, utilize fita suficiente para proteger o ímã contra danos por roedura. O ímã deve ser posicionado de modo que cada rotação da roda seja registrada pelo computador, sem qualquer interferência ou resistência ao giro completo da roda.Conecte a roda giratória à roda. Fixe-a inserindo os pinos do suporte da roda nos orifícios de montagem nas barras centrais da roda. Certifique-se de que a roda possa girar livremente.O equipamento deve ser monitorado diariamente quanto a danos por roedura e reparado conforme necessário durante o experimento. Sete camundongos fêmeas, da linhagem consanguínea C57, black six e B6C3F1, com sete meses de idade, provenientes de uma mesma ninhada, são aleatoriamente distribuídos para o regime de exercícios ou para o grupo controle sedentário. Como são mantidos individualmente os animais experimentais? Em gaiolas de 47 por 26 por 14,5 centímetros, com acesso irrestrito a uma roda para corrida, durante 28 dias. Os animais controle são mantidos em grupo em gaiolas sem roda.Forneça água e ração padrão para roedores dura a todos os animais. Adicione lido manualmente e registre diariamente os valores da distância percorrida e do tempo total gasto correndo, fornecidos pelo contador magnético; registre os valores de distância e tempo dentro do mesmo período de uma hora todos os dias, para obter valores precisos e consistentes ao longo dos 28 dias do período de exercício. Após cada registro diário, limpe o contador magnético para garantir leituras precisas no dia seguinte.Após o período específico de exercício, os pesos corporais dos animais eutanasiados são registrados antes da coleta dos tecidos. Para expor o coração, realize uma incisão mediana na face ventral, abra o diafragma e visualize rapidamente o coração. Resseque o coração na base e coloque-o em solução salina tamponada com fosfato gelada para lavar adequadamente o sangue ventricular residual. Remova os tecidos excessivos do coração, pese o órgão inteiro e congele rapidamente em nitrogênio líquido, se desejado.Coletar tecidos excisados adicionais, lavar com uma solução modificada de salina tamponada com fosfato gelada e congelar rapidamente em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Neste estudo, a falência ovariana foi induzida pelo tratamento com VCD e confirmada mediante exame microscópico de esfregaços vaginais. A fase do ciclo estral é determinada pela proporção de células epiteliais, células epiteliais quantificadas e leucócitos em células epiteliais nucleadas PROEs, nas quais predominam as células epiteliais.Aqui, as setas indicam células nucleadas durante o estro, em que predominam células epiteliais escamosas anucleadas quantificadas. O estro caracteriza-se por uma mistura de tipos celulares com predomínio de leucócitos. O diestro é dominado por leucócitos.O ciclo estral em camundongos normalmente dura quatro dias antes da injeção de VCD. Os animais foram considerados acíclicos após 15 dias de diestro persistente. Esta figura mostra o comprimento médio em dias do ciclo estral dos grupos injetados com veículo e com VCD.Um ciclo é medido a partir do primeiro dia do estro até o primeiro dia do próximo período. Na ES, a citologia vaginal começou aproximadamente seis semanas após o início das injeções. Observou-se que os ciclos de estro em animais injetados com VCD tornaram-se irregulares em comparação com os animais injetados com veículo, e após 12 ciclos de estro, a citologia de todos os animais injetados com VCD não indicava mais ciclagem ao final do protocolo de injeção de VCD. A coloração com hematoxilina e eosina (H e E) de cortes transversais do tecido ovariano revelou atrofia significativa no tecido ovariano tratado com VCD em comparação com os controles.Quando analisado com aumento de 20x a 200x, observou-se uma depleção completa de folículos primários e primordiais no tecido tratado com VCD. Em contraste com o tecido tratado com veículo, o efeito da falência ovariana induzida por VCD sobre o desempenho no exercício foi testado em camundongos de sete meses de idade, tratados com VCD ou com veículo, de duas linhagens; os valores diários de exercício em roda de gaiola foram registrados quanto ao tempo e à distância percorrida por cada animal ao longo de um período de quatro semanas de exercício. Esta figura mostra as médias semanais dos valores diários de corrida em relação à distância, tempo e velocidade.Para camundongos C57, black six tratados com veículo ou VCD, não foram observadas diferenças significativas no desempenho físico medido pela distância média diária percorrida e tempo gasto na roda entre os grupos tratados com VCD e com veículo, tanto na linhagem C57, black six quanto na linhagem B6C3F1. Isso indica que o impacto da falência ovariana induzida por VCD sobre o exercício voluntário na roda transcende pelo menos duas linhagens de camundongos após a duração do protocolo de exercício voluntário na gaiola. Os morfométricos corporais foram registrados e os corações foram rapidamente excisados e pesados, em concordância com observações anteriores.Hipertrofia cardíaca em resposta ao exercício na roda de gaiola, medida pelo peso absoluto do coração e pelo peso cardíaco normalizado em relação ao comprimento da tíbia, foi observada. Embora a massa cardíaca absoluta e a relação entre peso cardíaco e comprimento da tíbia fossem significativamente maiores em camundongos tratados com veículo e VCD quando comparados aos seus pares sedentários, não houve diferenças mensuráveis na hipertrofia cardíaca entre o grupo controle e o grupo com falência ovariana induzida por VCD. Após o exercício voluntário na roda de gaiola, finalmente, os camundongos tratados com VCD e com veículo foram submetidos a corrida forçada em esteira para determinar as capacidades de exercício em alta e baixa intensidade.No protocolo de alta intensidade, a velocidade média da esteira foi aumentada progressivamente a cada 10 minutos até que os camundongos apresentassem sinais de exaustão. Em média, a velocidade máxima de camundongos tratados com veículo foi de 26,7 ± 0,95 metros por minuto, e a velocidade máxima de camundongos tratados com VCD foi de 28 ± 1,4 metros por minuto antes da exaustão. A corrida de baixa intensidade a 20 metros por minuto foi utilizada para avaliar a capacidade de resistência.Em média, o tempo máximo dos camundongos tratados com veículo foi de 28,3 mais ou menos 1,3 minutos, e o tempo máximo dos camundongos tratados com VCD foi de 29,7 mais ou menos 1,4 minutos antes da exaustão. Não foram encontradas diferenças significativas na capacidade de exercício de alta ou baixa intensidade entre os grupos tratados com veículo e com VCD, indicando que a falência ovariana induzida por VCD não teve efeito sobre a capacidade de exercício dos camundongos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas das ciências celulares, moleculares e fisiológicas explorarem o papel da menopausa em roedores.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar as injeções adequadas de VCD, executar a citologia vaginal e implementar uma intervenção fisiológica.

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O hormônio folículo-estimulante (FSH) em vários tecidos e órgãos extragonadais está associado à patogênese de múltiplas doenças. O modelo de camundongos ovariectomizados e tratados com FSH (OVF) pode ser usado para explorar as ações extragonadais do FSH.

Explorando os efeitos independentes do hormônio folículo-estimulante in vivo em um modelo de camundongo

Este protocolo introduz uma técnica para induzir modelos de síndrome dos ovários policísticos (SOP) em camundongos por meio da liberação controlada de letrozol usando mini-bombas. Sob anestesia adequada, a minibomba foi implantada por via subcutânea e a SOP foi induzida com sucesso nos camundongos após um certo período de liberação da minibomba.

Uma técnica modificada para induzir a síndrome dos ovários policísticos em camundongos

Este artigo descreve a medição da função ventricular esquerda murina por meio da análise de pressão/volume em diferentes frequências cardíacas.

O cateterismo cardíaco em camundongos para medir o volume Pressão do relacionamento: Investigando o efeito Bowditch

Este trabalho demonstra a viabilidade de uma técnica de espectroscopia de ressonância magnética de fósforo-31 in vivo (31PMRS) para quantificar a capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) no músculo esquelético humano.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir In Vivo Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Aprenda a induzir falência ovariana quimicamente em camundongos usando VCD para estudar capacidade de exercício e adaptação cardíaca. Este método reproduz progressão natural da menopausa para pesquisa cardiovascular.

Um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em Exercício Capacidade e Cardiac Adaptação em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal

Um método para estudar o impacto da falência ovariana quimicamente induzida em Exercício Capacidade e Cardiac Adaptação em Ratos

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