Name: Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a usar ensaios de dois híbridos em levedura para identificar interações entre o receptor nuclear PXR e o inibidor cetoconazol. Este método revela mutações que conferem resistência ao fármaco.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants CA127231 e pelo Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (para S.M). Gostaríamos de agradecer ao professor Zdenek Dvorak, da Universidade Palacky de Olomouc, República Tcheca, por seus insights úteis sobre a discussão da portabilidade dessa técnica para sua instituição e padronização do protocolo.

1. Construção de fusões PXR e SRC-1 em vetores de levedura
<ol>
	<li>Amplificação por PCR de PXR LBD humano (107-434 aminoácidos) e comprimento total do SRC-1 humano (1-1401 aminoácidos).
	<ol>
		<li>Use o plasmídeo pSG5-hPXR8 como modelo PXR LBD, use o plasmídeo pCMX-SRC1 como modelos SRC-1.</li>
		<li>Descongele o PCR SuperMix, os modelos de DNA e os primers (consulte Materiais), mantenha-os no gelo.</li>
		<li>Adicione 0,25 μg/μl de molde de DNA 1 μl, pares de primers de 10 mM 2 μl cada, PCR SuperMix 45 μl e adicione H2O para elevar o volume total a 50 μl.</li>
		<li>Defina a PCR em um ciclo de 94 °C por 2 min, 20 ciclos de 94 °C por 30 seg, 55 °C por 30 seg e 72 °C por 2 min e, em seguida, um ciclo de 72 °C por 10 min para extensão. Verifique os produtos de PCR executando o gel de agarose a 1%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Clonagem de produtos de PCR em vetores Y2H.
	<ol>
		<li>Purifique os produtos de PCR a partir de gel de agarose a 1%. Digerir o vetor pSH2-1 PXR, LBD, PCR e Y2H com BamHI e SalI; digerir SRC-1 PCR e vetor Y2H pGADNOT com NotΙ e SalΙ. Para fazer isso, adicione 1 μg de DNA, 3 μl de tampão de reação 10x, 1 μl de enzimas de restrição e, finalmente, H2O para trazer o volume total para 30 μl.</li>
		<li>Coloque as amostras de digestão em banho-maria a 37 °C por 1 hora. Verifique a digestão executando em gel de agarose a 1%.</li>
		<li>Purifique amostras de digestão de gel de agarose a 1%, lige produtos de PCR digeridos e vetores Y2H e transforme em células competentes para DH5α.</li>
		<li>Escolha as colônias e isole o DNA do plasmídeo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifique o DNA do plasmídeo pSH2-1-PXR por digestão BamHI / SalI, identifique o DNA do plasmídeo pGADNOT-SRC-1 por digestão NotI / SalI. Verifique todo o DNA plasmidial positivo por sequenciamento.</li>
</ol>
2. Ensaios de dois híbridos de levedura
<ol>
	<li>Inocular a estirpe de levedura em 5 ml de YPAD e incubar durante a noite por agitação constante (220 rpm a 30 °C). Nota: A cepa de Saccharomyces cerevisiae foi CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ) que contém um gene GAL1-lacZ integrado com operador lexA 10. Para obter células de levedura viáveis resistentes ao cetoconazol, mas aquelas que não carregavam alterações no transportador como causa de resistência aos azóis18-20, novas cepas de levedura CTY10-5d foram obtidas primeiro excluindo ERG3 (erg3Δ) e, em seguida, introduzindo deleção adicional nos genes ERG11 (erg3Δ / erg11Δ) por recombinação homóloga. Os detalhes da construção foram descritos em um manuscrito publicado anteriormente6.</li>
	<li>No dia seguinte (de manhã), inocular a levedura (1:20) em 5 ml de YAPD e incubar para obter uma DO600 ~0,2 por agitação constante (220 rpm a 30 °C).</li>
	<li>Pulverize as células a 2.000 rpm em uma microcentrífuga por 2 min e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com água autoclavada e uma vez com LiAc 0,1 M.</li>
	<li>Após a lavagem final, rejeitar o sobrenadante e adicionar os seguintes reagentes ao sedimento celular: 240 μl PEG 3500 50% p/v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml de esperma de salmão cozido ssDNA, H2O 34 μl. Vórtice para misturar, adicionar 1 μg de pSH-PXR e 1 μg de ADN pGADNOT-SRC-1 e misturar.</li>
	<li>Transferir a mistura para um tubo de poliestireno de fundo redondo, agitar a transformação, misturar (220 rpm a 30 °C) durante 30 min. Mover o tubo para um banho-maria a 42 °C e incubar durante mais 30 min.</li>
	<li>Centrifugue o tubo a 2.000 rpm por 2 min e remova o sobrenadante. Lave o pellet uma vez com água autoclavada.</li>
	<li>Pipete 100 μl de água estéril para o tubo, ressuspenda as células batendo suavemente com os dedos e pipetando, depois coloque em placas de meio de gota de -His/-Leu (formulação por meio de gota de -His/-Leu: 20 g de dextrose, 1,7 g de YNB, 0,67 g de CSM-His/-Leu, 5 g de sulfato de amônio, ágar 1,5%) e incube a 30 ° C por 3-4 dias para isolar os transformantes.</li>
</ol>
3. Ensaio de filtro X-gal
<ol>
	<li>Corte a membrana de nitrocelulose no tamanho de uma placa de Petri. Rotule a membrana de nitrocelulose para marcar a orientação.</li>
	<li>Coloque a membrana de nitrocelulose pré-marcada nas colônias de leveduras, certifique-se de que a membrana esteja em contato com a superfície do meio da placa.</li>
	<li>Retirar a membrana, colocá-la com o lado da colónia virado para cima sobre um papel de filtro de 3 mm e colocar a membrana e o papel de filtro a -80 °C durante 15 min.</li>
	<li>Faça uma solução X-gal. Adicionar 50 μl de 20 mg/ml de X-gal e 15 μl de β-mercaptoetanol a 5 ml de tampão Z (1 l de tampão contém 16,1 g de Na,2HPO,4, 7H,2O, 5,5 g de NaH,2PO,4 H,2O, 0,75 g de KCl, 0,25 g de MgSO,4•7H,2O). Se o tampão Z tiver sido mantido a 4 °C, leve-o à temperatura ambiente antes de adicionar esses reagentes.</li>
	<li>Colocar dois círculos de papel de filtro de 3 mm numa placa de Petri e mergulhá-los com 5 ml de solução X-gal. Drene o excesso de tampão da placa de Petri e coloque a membrana de nitrocelulose com a colônia voltada para cima.</li>
	<li>Feche a tampa, certifique-se de que a membrana esteja em contato completo com o papel de filtro e que esteja completamente molhada. Embrulhe a placa de Petri em papel alumínio e incube a 37 ° C por 30 minutos durante a noite.</li>
</ol>
4. Ensaio de β Líquido
<ol>
	<li>Cultive levedura em meio líquido -His/-Leu Dropout para OD600 0,7.</li>
	<li>Transfira 1 ml de meio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugue a 3.000 rpm por 2 min. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de tampão Z para ressuspender o pellet, centrifugar novamente a 3.000 rpm durante 2 min. Rejeitar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 150 μl de tampão Z com 2ME para ressuspender o pellet celular, misture e adicione 50 μl de clorofórmio e 20 μl de SDS a 0,1%. Vortex vigorosamente a amostra por 15 segundos.</li>
	<li>Adicionar 700 μl de solução ONPG (1 mg/ml em tampão Z). Regular o temporizador, incubar a 30 °C durante tempo suficiente para permitir a formação da cor amarela e registar o tempo total de reacção.</li>
	<li>Adicionar 500 μl de 1 M Na2CO3 para interromper a reacção e determinar a absorvância a 420 nm. O branco é 700 μl de solução ONPG mais 500 μl 1 M Na2CO3.</li>
</ol>
Calcule as Unidades de Miller da seguinte forma: Unidades de Miller = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)
Å420: unidades de absorbância a 420 nanômetros; Å600: unidades de absorbância a 600 nanômetros; min: o tempo de reação em minutos; ml: o volume de reação em ml

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
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<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
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<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em nosso ensaio Y2H modificado, identificamos resíduos importantes para interações de cetoconazol em PXR6. Como o SRC-1 é um coativador (e foi clonado no vetor pGADNot), também testamos se o SRC-1 poderia ativar a expressão de lacZ quando clonado no sistema de vetores pSH e se isso mudaria o perfil de ativação e/ou afetaria o vazamento do ensaio de dois híbridos de levedura. Usando nossos plasmídeos redesenhados, realizamos dois ensaios híbridos em levedura erg3Δ / erg11Δ. Como antes, mostram...

A levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio é utilizado para descobrir as interacções proteína-proteína e, mais recentemente, para a descoberta de novas moléculas pequenas que perturbem complexos proteína-proteína de interacção 7, 8, 9, 10, 11. No entanto, as abordagens convencionais deste ensaio, usado para a descoberta de medicamentos ou &quot;hits&quot;, não permitem a detecção de resíduos de interação de compostos químicos alostéricos dentro superfícies proteína-proteína, que, quando alterados ainda interagir e permitir o interrogatório dos resíduos alterados 11 . Com efeito, um tal método (s), se possível desenvolver, permitiria um sistema de levedura tratável para avaliação de alto rendimento de resíduos de interacção alostéricos críticos para a interacção proteína-proteína ruptura. No contexto da descoberta da droga, a maneira mais direta de estabelecer a interação de compostos com proteínas envolveria determinação estrutural (por exemplo, cristalização do complexo proteína-inibidor). Estes métodos são cumbersome, utilizar os recursos elaborados e não é tecnicamente viável a realização de estudos estruturais em cada proteína. Sistemas de rastreio de drogas genética tratável foram estabelecidas em bactérias 1, 2 e outros sistemas modelo como mamíferos de dois híbridos. No entanto, esses sistemas precisam de otimização e sistemas alternativos como Y2H ainda são os mais testados na descoberta de medicamentos. Há limitações que incluem pouca sensibilidade e confiabilidade das interações usando métodos singulares 13, no entanto, um ensaio Y2H único pode ser modificada para responder a perguntas específicas sobre resíduos de interação. No campo da investigação de receptores nucleares, Y2H foi usado para definir as proteínas que interagem 14, no entanto, estas interacções proteína raramente foram utilizados para definir a natureza, em que os ligandos / antagonistas do receptor interajam com complexos proteicos nucleares. Assim, o nosso laboratório concentrado esforços na definição de um método, especialmente para as proteínas receptoras que não sejamprontamente passíveis de proteômica métodos baseados, que desenterrar novela ligante / antagonista interagindo resíduos utilizando uma plataforma baseada Y2H descoberta inversa. Com base em nossa constatação anterior que o cetoconazol interrompe PXR e seu ativador SRC-1, foi desenvolvido um novo sistema de reverter Y2H que nos permitirá definir e interrogar cetoconazol interagir resíduos em PXR 6. O nosso método baseia-se nas propriedades da proteína GAL4 de levedura, que consiste em domínios separáveis ​​responsáveis ​​pela activação de ligação a ADN e transcricional. A proteína PXR LBD é expressa como uma fusão com o domínio de ligação de LexA de ADN (DNA-BD), enquanto que as de comprimento total de co-activadores de SRC-1 (coactivator do receptor de esteróides 1) as proteínas são expressas como fusões com o domínio de activação de GAL4 (AD ). Interacção entre PXR e SRC-1 As proteínas de fusão conduz à activação da transcrição de GAL4, sítios de ligação que contêm genes repórter β-Lac Z, que é integrado no genom levedurae. Cetoconazol, um antagonista de PXR, interrompe PXR e SRC-1 interacção 15, 16, 17 e que pode detectar a interacção de PXR e SRC-1 na presença ou ausência de cetoconazol após coloração colónias em filtros para a actividade de X-gal. O princípio de Y2H é ilustrada na Figura 1 e o procedimento experimental é resumido na Figura 2.

<table><tbody><tr><td>Cepa de levedura CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Nossa</td><td>levedura CTY10-5d de laboratório foi duplamente eliminada ERG3 e ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) genes6 .</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento YPD</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Mistura Completa de Suplementos MP</td><td>Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-Nitrofenil &Beta;-D-Galactopiranosídeo).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>DNA de Esperma de Salmão Sonicado fervido (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Cetoconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 solução, esterilizada por filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulose</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATGATCATGTCC-3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD primer dianteiro para pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD primer reverso para pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 primer dianteiro para pGADNOT</td></tr><tr><td>5 ' - Gcggtcgacttattcagtca GTAGCTG -3 '</td><td>our laboratório</td><td></td><td>SRC-1 a primeira demão reversa para o PCR Supermix</td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td>da<td>platina</td></tr> de pGADNOT <tr><td></td><td>nosso laboratório</td><td>R0136</td> SalI nosso laboratório R0138 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>nosso laboratório</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

reverter levedura sistema de dois híbridos para identificar mamíferos receptor nuclear resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Como um regulador fundamental no metabolismo de drogas e inflamação, Pregnane X Receptor (PXR), desempenha um papel importante na patofisiologia da doença ligando metabolismo e inflamação (por exemplo, a esteatose hepática) 1,2. Tem havido muito progresso na identificação de ligantes agonistas para PXR, no entanto, há descrições limitadas de antagonistas droga-como e seus sítios de ligação PXR 3,4,5. Uma barreira crítica tem sido a incapacidade de purificar de forma eficiente a proteína de comprimento completo para estudos estruturais com antagonistas, apesar do facto de PXR foi clonado e caracterizado em 1998. O nosso laboratório desenvolveu uma nova levedura de alto rendimento com base ensaio de dois híbridos para definir um antagonista, de cetoconazol, os resíduos de ligação em PXR 6. O nosso método envolve a criação de bibliotecas de mutações que seriam resgatar o efeito das mutações individuais em FA-2 superfície de PXR o esperado para interagir com cetoconazol. Resgate ou &quot;ganho de função&quot; secomutações nd pode ser feita de tal forma que conclusões a respeito da interação genética de cetoconazol e do resíduo (s) de superfície em PXR são viáveis. Assim, foi desenvolvido um alto rendimento de dois híbridos tela levedura de mutantes PXR interagindo com sua coactivator, SRC-1. Usando esta abordagem, em que a levedura foi modificado para acomodar o estudo da droga antifúngica, cetoconazol, conseguimos demonstrar mutações específicas em PXR enriquecidas em clones incapazes de se ligar ao cetoconazol. Pela lógica inversa, podemos concluir que os resíduos originais são resíduos diretos de interação com cetoconazol. Este ensaio representa um romance, ensaio genético tratável para a tela por sítios de ligação do antagonista do receptor nuclear em superfícies. Este ensaio pode ser aplicado a qualquer medicamento, independentemente do seu potencial citotóxico de levedura, bem como a proteína (s) celular, que não pode ser estudado usando biologia estrutural padrão ou métodos proteomic base. Armadilhas potenciais incluem interpretação de dados (métodos complementares útil), reliance em método único Y2H, experiência em lidar com fermento ou levedura realizando ensaios de dois híbridos e otimização do ensaio.

Realizamos um ensaio para verificar se poderíamos detectar uma leitura colorimétrica da associação entre PXR e o coativador-1 do receptor de esteroides (SRC-1). Como o levedo possui produção significativa de esteróis, já foi demonstrado anteriormente que a expressão de lacZ em levedo pode ser induzida sem a necessidade de ligante exógeno adicional. Descobrimos que a expressão de lacZ (colônias azuis) também é induzida na linhagem de levedo transformada com PXR e SRC-1; no entanto, não há indução da expressão de LacZ (col...

O cetoconazol se liga e antagoniza a ativação do receptor X do pregnano (PXR). Telas de alto rendimento de leveduras de mutantes PXR definem uma região única para a ligação ao cetoconazol. Este método genético baseado em levedura descobre novas interações de receptores nucleares com ligantes que se associam a locais de ligação de superfície.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever um ensaio de duplo híbrido em levedura de alto rendimento que revela interações entre o receptor X pregnano, ou PXR, e o inibidor de molécula pequena cetoconazol. Isso é realizado primeiramente pela construção dos plasmídeos de duplo híbrido em levedura, um expressando o domínio de ligação ao ligante do PXR humano e o outro expressando o coativador do receptor esteroide um ou SRC um. A presença de cetoconazol interrompe a interação do PXR humano com o SRC um, conforme revelado por ensaios líquidos de beta-galactosidase.Juntamente com a triagem colorimétrica de colônias em um filtro, a triagem de mutantes do PXR na presença de cetoconazol permite identificar mutações que tornam o receptor imune à ação do fármaco, possibilitando em última instância a detecção da expressão por inspeção visual e os resultados dos ensaios líquidos de beta-galactosidase. Ensaios SASE são utilizados para demonstrar alterações na ativação do PXR na presença de cetoconazol, o que permite a identificação de resíduos originais envolvidos na interação. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método no laboratório da Dra. Manny, onde sou pesquisador associado.Quando nos deparamos com dados estruturais incompletos sobre o PXR, as técnicas bioquímicas não nos permitiam realizar a identificação, especialmente para interações de tamanho muito pequeno e não facilmente modificáveis. Para a caracterização estrutural. Com base no princípio de detecção de mutantes de PXR resistentes à kitona, desenvolvemos um método que será tratável, viável e poderá ser realizado em poucos dias de maneira de alto rendimento.Embora este método possa fornecer informações sobre a força farmacológica de ligação de moléculas pequenas a proteínas receptoras, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como qualquer proteína que tenha um papel patogênico em doenças, particularmente aquelas com limitações nas abordagens de biologia estrutural antes da identificação preliminar de resíduos envolvidos na ligação, a fim de compreender e projetar melhor interagentes moleculares pequenos direcionados. Para começar, amplifique o domínio de ligação de ligante do PXR humano e o SRC humano completo conforme descrito no protocolo do texto. Verifique os produtos da PCR realizando eletroforese em gel de agarose a 1%.Em seguida, purifique os produtos de PCR a partir do gel de agarose. Digeste os produtos de PCR em dois vetores híbridos conforme descrito no protocolo textual e coloque as amostras de digestão em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora. Purifique as amostras digeridas a partir de um gel de agarose a 1%, depois ligue os produtos de PCR digeridos e purificados aos dois vetores híbridos antes de transformar em células competentes DH cinco alfa, seguido de incubação noturna a 37 graus Celsius.Escolha as colônias e isole o DNA plasmidial; utilize digestão com enzima de restrição para confirmar a presença do vetor e do inserto, e verifique todo o DNA plasmidial positivo por sequenciamento. Inocule a linhagem de levedura em cinco mililitros de YAPD e incube durante a noite com agitação constante a 220 rpm e 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, inocule a levedura na proporção de 1 para 20 em cinco mililitros de YAPD e incube até obter uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,2 com agitação constante.Centrifugue as células a 2000 RPM em uma microcentrífuga durante dois minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com água autoclavada e uma vez com acetato de lítio 0,1 molar. Após descartar o sobrenadante da última lavagem, adicione os reagentes de transformação listados no protocolo do texto ao pellet celular e vortexie para homogeneizar.Em seguida, adicione os vetores preparados contendo PXR e contendo SRC antes de misturar. Novamente, pipete a mistura de transformação para um tubo de fundo redondo de poliestireno e agite por 30 minutos. Transfira o tubo para um banho-maria a 42 graus Celsius e incube por mais 30 minutos.Em seguida, centrifugue o tubo a 2000 RPM durante dois minutos após a remoção do sobrenadante. Lave o pellet uma vez com água de autoclave, pipetando 100 microlitros de água estéril para dentro do tubo e ressuspenda as células por meio de leves batidas com o dedo e pipetagem. Em seguida, plaque as células em meio de eliminação sem histidina e leucina e incube a 30 graus Celsius por três a quatro dias para isolamento dos transformantes.Para iniciar o ensaio com filtro Xga, recorte um triângulo de uma membrana de nitrocelulose para que se encaixe em uma porção de 10 milímetros de uma placa de Petri. Rotule a membrana de nitrocelulose para marcar a orientação. Coloque a membrana de nitrocelulose pré-marcada sobre as colônias de levedura, garantindo que a membrana esteja em contato com a superfície do meio da placa.Remova a membrana. Coloque-a com o lado das colônias voltado para cima sobre um papel-filtro de três milímetros e coloque a membrana junto com o papel-filtro a menos 80 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, coloque dois círculos de papel-filtro de três milímetros em uma placa de Petri e umedeça-os com cinco mililitros de solução xal.Remova o excesso de tampão da placa de Petri e coloque a membrana de nitrocelulose na placa com o lado das colônias voltado para cima. Feche a tampa, garantindo que a membrana esteja em contato completo com o papel filtro e totalmente umedecida. Envolva a placa com papel alumínio e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos até a noite para cultivar levedura e remover o meio líquido sem histidina e leucina até uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,7.Transfira um mililitro de meio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a 3000 RPM durante dois minutos. Após descartar o sobrenadante, adicione um mililitro de tampão Z ao pellet e centrifugue. Como anteriormente, adicione 150 microlitros de tampão Z com mercaptoetanol ao pellet celular para ressuspendê-lo.Em seguida, adicione 50 microlitros de clorofórmio e 20 microlitros de SDS 0,1% vigorosamente. Agite a amostra em vórtex por 15 segundos. A seguir, adicione 700 microlitros de solução de ONPG, acerte o temporizador e incube a 30 graus Celsius por tempo suficiente para que a cor amarela se desenvolva.Após o desenvolvimento da cor, anote o tempo total de reação. Adicione 500 microlitros de carbonato de sódio um molar para interromper a reação. Em seguida, determine a absorbância em 420 nanômetros.Como etapa final, calcule as unidades Miller conforme descrito no protocolo do texto. Como a levedura apresenta produção significativa de esteróis, a expressão de laxy em levedura pode ser induzida sem a necessidade de ligante exógeno adicional. O ensaio xal lift revelou que a expressão de laxy, visualizada pelas colônias azuis, é induzida na linhagem de levedura transformada com PXR e SRC um.Isso também é demonstrado no ensaio líquido de beta-galactosidase. No entanto, não há indução da expressão de laxy em leveduras transformadas com vetores vazios, PXR isolado ou SRC1 isolado. O cetoconazol interrompe as interações entre PXR e SRC1 na levedura, já que todas as colônias provenientes do filtro de replica eram brancas, o que também foi demonstrado pela atividade significativamente reduzida da beta-galactosidase em ensaios enzimáticos líquidos.Quando as transformações em levedura foram realizadas com S rrc um no mutante duplo P XR, revelou-se que as colônias expostas à cetoconazol ainda retêm a expressão laxy. Isso é semelhante a estudos anteriores deste laboratório que mostraram que o mesmo PXR pode ser ativado por um ligante forte, mas é imune aos efeitos antagônicos da cetoconazol em ensaios mamíferos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um cuidadoso e em que lugar poderia ser feito o híbrido AC e as modificações necessárias exigidas para o estudo de resíduos de dobramento molecular pequeno em proteínas.É importante lembrar, ao tentar este procedimento, obter uma biblioteca altamente diversificada de mutantes do seu receptor, alcançar uma eficiência de transformação elevada em cada uma das mais de 200 amostras, desenvolver réplicas quase idênticas do filtro montado com ou sem drogas e, finalmente, realizar uma inspeção visual e química precisa para detecção de nase. Após seguir este procedimento, outros métodos, como ácidos nucleicos, proteínas, ácidos pro e modelos de docking homólogos iCal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, por exemplo, ao menos a aplicabilidade de dobramento em células humanas. E, caso afirmativo, se um modelo pode ser criado que defina esses resíduos como um fármaco.

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Biologia

MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.

Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de repórter que pode ser usado para identificar e quantificar as interações ligante-receptor.

Um sistema BW repórter para estudar interações ligante-Receptor

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

O design de proteínas envolve a construção de sequências de aminoácidos e a incorporação de motivos específicos para criar variantes funcionais. Essa abordagem é fundamental para o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos (AMPs) para combater patógenos resistentes a antibióticos. Este artigo apresenta um procedimento para construção de proteínas usando várias ferramentas de bioinformática.

Aplicação de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK e HEX loria para design de proteínas De Novo e In Silico

Aprenda a usar ensaios de dois híbridos em levedura para identificar interações entre o receptor nuclear PXR e o inibidor cetoconazol. Este método revela mutações que conferem resistência ao fármaco.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas (Vídeo) | JoVE Journal

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

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