Visualização do imunológica Synapse por Dual Color Time-fechado Emissão Estimulada Exaustão (STED) Nanoscopia

O objetivo geral deste procedimento é visualizar estruturas como a actina F na sinapse lítica das células NK usando microscopia TED. Isso é feito primeiro recapitulando a sinapse no vidro usando anticorpo ativador. A segunda etapa do procedimento é fixar permanentemente e corar as células para estruturas de interesse.

Em seguida, as lâminas são visualizadas por microscopia confocal de varredura a laser, seguida pela aplicação de depleção de stead para aumentar a resolução da imagem. A etapa final é processar as imagens usando um algoritmo de deconvolução. Em última análise, os resultados podem mostrar uma resolução inferior a 100 nanômetros das estruturas celulares, graças à estabilidade de duas cores e à endoscopia.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como a relação entre o citoesqueleto e a exocitose. Em nosso caso, estamos interessados na secreção de lisossomos especializados denominados grânulos líticos por células assassinas naturais. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque existem várias variáveis que podem ser ajustadas na aplicação do laser de depleção TED.

Uma aplicação inadequada do feixe de depleção resultará em uma piora em vez de melhoria na resolução Na preparação, aqueça 30 mililitros de mídia RPMI com 10% FCS e separadamente. Um mililitro de BD CY afeta o permanente do cyop a 37 graus Celsius. Em seguida, inicie o processo de revestimento das lamínulas com anticorpos.

Pegue as lamínulas número 1.5 e use uma caneta PAP. Faça quadrados do tamanho de uma moeda de dez centavos nas lamínulas. Prepare um quadrado para cada condição testada.

Carregue cada círculo com 200 microlitros de anticorpo a cinco microgramas por mililitro em PBS. Para ativação de células NK 92, use anticorpos anti CD 18 e anti NK P 30. Incube as lamínulas carregadas a 37 graus Celsius por meia hora e, em seguida, lave-as com um mergulho na temperatura ambiente PBS prossiga imediatamente com a adição das células para cada condição testada, 500.000 células devem estar prontas para uso.

Lave as células em 10 mililitros do meio pré-aquecido e depois ressuspenda-as no mesmo meio aquecido. A 2,5 milhões de células por mililitro com as células totalmente em suspensão, decantar 200 microlitros em cada quadrado de anticorpo na tampa As lamínulas incubam as lamínulas com células a 37 graus Celsius com 5% de CO2 neste caso. 20 minutos é tempo suficiente para polarizar os grânulos nas células NK após a lavagem da incubação, a tampa desliza suavemente em PBS à temperatura ambiente.

Comece adicionando um microlitro de TRITTON X 100 a um mililitro de solução quente de cyto perm de efeitos BD CY. Então vórtice. Aplique 200 microlitros desta solução em cada quadrado de condição nas lamínulas.

Em seguida, coloque as células no escuro em temperatura ambiente e aguarde 10 minutos. Quando a incubação terminar, lave suavemente as lamínulas no tampão de coloração. Em seguida, seque as bordas das regiões cercadas com um cotonete.

Em seguida, adicione 200 microlitros do anticorpo primário no tampão de coloração nas regiões cercadas e deixe as lamínulas incubarem no escuro por meia hora. Alguns bons anticorpos secundários para imagens de stead incluem Alexa floor 4 88 Pacific orange e Horizon V 500. Cada um deles funciona bem em uma diluição de um a 200.

Após a lavagem da incubação, a tampa desliza na coloração, tampona e seca. Como antes, aplique 200 microlitros do anticorpo secundário em cada quadrado de condição. Em seguida, deixe-os descansar no escuro por mais 30 minutos.

Neste ponto, é possível adicionar anticorpos adicionais após lavagens adicionais. Por exemplo, Phin pode ser aplicado em um a 200 para detectar f actina. Para um meio de montagem, escolha prolongar sobre a blindagem vetorial, que não é compatível com o stead.

Se a coloração de phin for usada, evite usar dois dois thio etanol, enquanto, no entanto, está tudo bem, agora aplique 10 a 20 microlitros de meio de montagem em uma lâmina. Com a lamínula invertida, abaixe-a suavemente no meio, evitando bolhas de ar. Em seguida, incube a lâmina por 24 horas.

Com a capa, deslize no dia seguinte, sele a lamínula com esmalte e prossiga com a imagem. Inicie os lasers e o software. O laser de depleção de stead deve aquecer a 100% de potência e estar alinhado.

Usando a ocular, concentre-se na amostra e, em seguida, recorra ao software. Examine o primeiro canal, aquele com o comprimento de onda mais longo. Piso quatro, otimize a potência do laser, a posição do feixe de excitação e o alcance do detector.

Evite definir acima de 100. Em seguida, capture uma imagem confocal e verifique se há pixels. A saturação, a linha e a média do quadro melhorarão a resolução de pixels.

O objetivo é ficar abaixo de 30 nanômetros por pixel. Alguma saturação é aceitável para o lugar. Em seguida, aplique o feixe de esgotamento de posição a 50% de potência e capture uma imagem.

Se a resolução melhorar, mais potência pode ser aplicada. Além disso, ajustar a potência do laser de excitação ou a média da linha ou o ganho também pode melhorar a resolução. Para reduzir o plano de fundo, aplique 0,3 nanossegundos de controle de tempo e ajuste para cima.

A nova resolução deve ser estimada usando um cálculo máximo de meia largura total. Quando estiver satisfeito, repita essas etapas com o segundo canal quando todos os canais forem ajustados. Verifique se há sobreposição espectral por meio de imagens de controles de coloração única com todas as sequências de varredura.

A sobreposição leve pode ser corrigida com a separação espectral pelo software, mas é melhor evitar ou reduzir ao mínimo. Agora, adquira imagens para imagens quantitativas. Obter pelo menos 20 imagens por condição de acordo com as condições experimentais.

Para devolver as imagens salvas, abra os arquivos no software apropriado. Verifique os parâmetros de cada canal, especificamente os espectros de excitação e admissão, a emissão de depleção do estábulo e a direção da imagem. Em seguida, aplique os cálculos de deconvolução do software.

As configurações padrão geralmente são suficientes, mas o sinal para o ruído varia entre a força do piso, de modo que o parâmetro precisa ser definido manualmente para o experimento. Existem algumas armadilhas comuns que podem levar a uma resolução abaixo do ideal com o lugar. Um está sob amostragem.

Isso leva à granulação e à perda de informações de pixel, como nesses filamentos de actina. Aumentar a média da linha ou do quadro geralmente corrige esse problema. Outro problema é o branqueamento ou sobreamostragem causado por pixels longos.

O tempo de permanência, geralmente devido à média excessiva da linha antes da aquisição da imagem, também pode ser o culpado e pode ser corrigido usando uma varredura menor antes de adquirir imagens ou usando uma velocidade de varredura mais alta. Reduzir a potência do laser também pode ajudar em tudo o que funciona. A imagem melhorará drasticamente.

A deconvolução melhorará ainda mais a imagem. Tanto quantitativa quanto qualitativamente. A resolução abaixo de 100 nanômetros deve ser obtida rotineiramente ao tentar este procedimento.

É importante lembrar de realizar o alinhamento do feixe de fixação antes de cada experimento e aproximadamente uma vez por hora depois disso após este procedimento. Outros métodos, como a análise quantitativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre colocalização, localização subcelular e interações moleculares.