Name: Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprenda a monitorar a saúde de tecidos de barreira usando um transistor eletroquímico orgânico integrado a células vivas. Este método detecta alterações no fluxo iônico, indicando a integridade do epitélio gastrointestinal.

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Os autores deste trabalho não tem quaisquer interesses financeiros concorrentes.

1. PEDOT: PSS Solução Preparação <ol><li> Para 50 ml de PEDOT: PSS, adicionar etileno glicol (aumenta a condutividade) numa proporção em volume de 1:4 (etileno-glicol para PEDOT: PSS), 0,5 mL / mL de ácido dodecilbenzenossulfónico (DBSA) como um surfactante, e de 10 mg / ml de 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GOPS) como um agente de reticulação para melhorar a adesão do polímero condutor para a lâmina de vidro. </li></ol> 2. OECT Fabrication (Figura 3) <ol><li> Definir evaporado termicamente contatos de fonte e dreno de ouro via decolagem litografia: <ol><li> Gire casaco photoresist em uma lâmina de vidro limpa normal, a 3.000 rpm por 30 seg. Dimensões de vidro são 3 em x 1 pol </li><li> Definir padrões por fotolitografia. As dimensões podem ser alteradas, porém as dimensões listadas aqui foram mostrados para causar a sensibilidade ideal. Em seguida, use um desenvolvedor. </li><li> Evaporar 5 nm e 100 nm de cromo e ouro, respectivamente. </li><li> Levante-off o fotorresiste em um acbanho Etone por 1 hora, deixando o substrato com a fonte e dreno só Au área de contatos. </li></ol></li><li> O comprimento desejado do PEDOT: PSS canal é de 1 mm. Isto é conseguido pela padronização usando um parylene-C (Pa-C) técnica peel-off: <ol><li> Coloque 3,5 g de Pa-C na configuração de revestimento. Uniformemente evaporar 2 mM de parileno-C na parte superior do substrato com Au contactos. </li><li> Padrão do canal por fotolitografia: <ol><li> Gire casaco photoresist a 3.000 rpm por 30 seg. </li><li> Use uma máscara para iluminar canal e contato de ouro 20 seg a UV, o fotorresiste exposto vai se tornar solúvel no desenvolvedor. </li><li> Use desenvolvedor para abrir a área de canal no fotorresiste. </li></ol></li><li> Etch do Pa-C na área do canal por um passo de plasma de 15 min (O 2 (50 sccm) e CHF 4 (3 sccm) de plasma a 160 W), a fim de abrir o canal e o contacto de ouro. </li></ol></li><li> Depositar o PEDOT: PSS solução de mistura por spin coating em500 rpm durante 45 segundos. Asse por 30 segundos a 110 ° C. </li><li> Peel-off do Pa-C para revelar o PEDOT: PSS canal do substrato por baixo. Este canal deve sobrepor-se ligeiramente com a UA contatos feitos no protocolo 1. </li><li> Amostras Asse por 1 hora a 140 ° C, sob condições atmosféricas. </li></ol> 3. Montagem de dispositivo <ol><li> Adicione PDMS pela mistura de duas soluções (geralmente fornecidos em conjunto num kit) a uma razão 1:10 de solução numa solução de base de cura. Asse durante 1 hora a 120 ° C. </li><li> Projete bem usando um furador e cortar um quadrado em volta da área desejada. </li><li> Cole um PDMS bem na parte superior do canal, para resultar numa zona do canal de cerca de 6 mm 2. Certifique-se de que os contatos de fonte e dreno não são cobertos. </li><li> Faça um suporte de plástico com um buraco no meio (pode usar o suporte para a inserção de cultura de células) e depois cole-o em cima do PDMS. Deixe-o secar durante a noite. </li><li> Teste o bem para vazando por prefilling com water. </li><li> Solde fios elétricos na fonte e dreno contato com estanho. </li></ol> 4. Cultura de Células <ol><li> Preparar meios de cultura de células como se segue: <ol><li> Em DMEM, adicionar 1% de glutamina, 10% de soro fetal bovino, 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 0,1% de gentamicina. </li><li> Esteriliza-se o meio de cultura de células utilizando um dispositivo de filtração estéril. </li></ol></li><li> Manter a células Caco-2 entre a passagem 49 e 68 a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, em meios de cultura de células. </li><li> Divida as células uma vez por semana usando tripsina e semente de 1,5 x 10 4 células / inserção. </li><li> Alterar os meios de cultura de células, duas vezes por semana durante 3 semanas. </li></ol> 5. Medidas com OECT <ol><li> Ligar um fio de Ag / AgCl a uma SourceMeter para utilização como o eléctrodo de porta. Imergir a ponta em meios de cultura de células, que é usado como electrólito, tal como ilustrado na figura 1a. </li><li> Conecte os fios da fonte e dreno para tele SourceMeter (configuração dual channel). </li><li> Aplicar um pulso de tensão quadrada positiva (V GS) entre o portão ea fonte (usado como eletrodo de referência: terra). Uma tensão constante negativa entre dreno e fonte (V DS) é aplicado e que corresponde corrente (I DS) é medido. </li><li> Use um conjunto de dados do programa em execução PC. Parâmetros OECT inseridos em um programa de aquisição personalizado deve ser a seguinte: V DS = -0,2 V, V GS = 0,3 V, V GS no tempo = 2 s, fora do tempo = 28 seg. </li><li> Leia a corrente fonte-dreno (I DS) e corrente de gate (I GS). Efectuar a medição por alguns minutos para garantir um sinal de linha de base estável. </li></ol> 6. Integrando Células com OECT para Medição Nota: Antes do experimento, a integridade da camada de células pode ser verificada por medição de TER com um dispositivo de espectroscopia de impedância. TER de cada 3 semanas de idade Caco-2 inse celularrt deve ser acima de 400 Ω. cm 2. <ol><li> Durante o tempo fora de medida OECT: Retire o eletrodo de porta do eletrólito, incorporar a inserção de cultura de células, e substituir o eletrodo de porta dentro da inserção de cultura de células. </li><li> Realizar uma medição de linha de base com as células durante vários minutos, para garantir um sinal estável. Esta linha de base será usada para o cálculo do que o valor normalizado que corresponde a uma monocamada intacta (0). </li></ol> 7. Preparação e Apresentação de composto tóxico <ol><li> Prepara-se uma solução de EGTA a 1 M em água desionizada, ajustando primeiro o pH da solução para 7,4 com Tris base. </li><li> Adicionar solução de EGTA no volume apropriado para se obter a concentração desejada (por exemplo, entre 5 mM e 100 mM), tendo em conta o volume. O EGTA deve ser adicionado na câmara basal durante o tempo de desligado. </li><li> Medir continuamente por 90 min como no Protocolo no 5. Se a medida for being realizada à temperatura ambiente, a estabilidade das células não permanecerá constante, após 90 min. </li><li> No final da corrida, arranhar a camada de células para resultar numa destruição completa da camada de barreira e medida durante 15 minutos, este ponto pode ser feito através da remoção do filtro e a imersão do eléctrodo de porta de meios de comunicação. Esta linha de base será usada para o cálculo de como o valor normalizado que corresponde a uma monocamada destruído. </li></ol>

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Este projecto é apoiado pelo FP7-People-2009-RG, Marie Curie Projeto No. 256367 (CELLTOX) ea Proposta Conselho Europeu de Investigação ERC-2010-StG No 258966 (IONOSENSE), bem como uma bolsa conjunta do Conselho Regional de Provence Alpes Côte d&#39;Azur e CDL Pharma para ST. Agradecemos George Malliaras para discussões úteis relativos ao design e função OECT.

Esta técnica proporciona um novo método para integrar um transistor eletroquímico orgânica com células vivas para medir a integridade do tecido de barreira. As principais vantagens desta técnica são a rapidez e sensibilidade, mas também do baixo custo do dispositivo de monitorização dinâmica de tecido de barreira. Como este método usa células vivas, um ponto crítico é ter a certeza de usar uma monocamada, o que representa uma camada de barreira intacta. Os parâmetros da barreira deve ser def...

O epitélio gastrintestinal é um exemplo do tecido de barreira, a qual controla a passagem das moléculas entre os diferentes compartimentos do corpo. O epitélio constituído por células colunares alongadas unidas por complexos de proteínas que proporcionem uma barreira física 1 contra agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de água e os nutrientes necessários para sustentar o organismo. Esta selectividade é devido à polarização das células epiteliais, o que cria dois domínios de membrana diferentes: o lado apical das células expostas à luz, e o lado basal das células ancoradas nos tecidos subjacentes 2,3. Tight junctions (TJ) são complexos de proteínas presentes na porção apical das células epiteliais e são parte de um complexo maior conhecida como a junção apical 4. O fluxo de íons através do tecido de barreira pode ou ir através do transcelular (através do celular) ou via um paracelular (entre duas células adjacentes) via. A somao transporte através de ambas as vias é conhecida como a resistência transepitelial. A junção apical é responsável pela regulação de íons e moléculas que passam através da barreira de 5,6 por meio de uma abertura específica e função de fechamento. Uma disfunção ou perturbação destes complexos de proteína é muitas vezes relacionados com a doença 7-11. Além disso, muitos patógenos entéricos / toxinas são conhecidos por atingir especificamente esse complexo, entrando assim o corpo e levando a diarréia, provavelmente como consequência da desregulação maciça de fluxo de íons / água através da barreira 12-14. Tecido de barreira pode também ser modificado, alterando o microambiente extracelular. Caderina é uma proteína crítica para a adesão célula-célula, e está envolvido na formação da junção apical. O cálcio é necessário para a conformação estrutural correcta da caderina, e uma diminuição no cálcio extracelular foi mostrado para provocar a destruição da junção célula-célula e uma abertura subsequente dovia paracelular entre as células 15. Neste estudo, EGTA (etileno-glicol-bis (beta-amino-etil éter)-N, N, N &#39;, N&#39; ácido acético, tetra-), um quelante de cálcio específico, foi utilizada para induzir a quebra da barreira de tecido, uma vez que possui mostrado ter um efeito drástico sobre a rápida e paracelular de iões fluem 16,17. Esse quelante de cálcio foi utilizado em uma monocamada confluente e diferenciado da linha celular Caco-2. Cultivados em inserções de cultura de células, é conhecido nesta linha de células para o desenvolvimento das características do tracto gastrointestinal e é amplamente utilizado na indústria farmacêutica para testar a absorção de fármacos 18,19. Métodos para monitorar a integridade do tecido barreira são abundantes. Estes métodos são muitas vezes óptico, baseando-se coloração por imunofluorescência de proteínas particulares conhecidos como sendo na junção apical 20, ou baseando-se na quantificação de uma molécula de marcador fluorescente que é normalmente impermeável ao tecido de barreira21,22. No entanto, os métodos de livre-etiqueta (isto é, sem um fluoróforo / cromóforo) são preferíveis, como o uso de um rótulo pode incorrer artefactos, e frequentemente aumenta o custo e tempo de ensaio. Elétrica, monitoramento sem etiqueta de tecido barreira surgiu recentemente como um método de monitoramento dinâmico 23. Por exemplo, os recentes avanços tecnológicos na espectroscopia de impedância eléctrica têm permitido o desenvolvimento de um aparelho de digitalização comercialmente disponíveis 24,25 que pode medir a resistência transepitelial (TER), uma medição da condutância de iões através da camada de células. A eletrônica orgânica criou uma oportunidade única para interagir no mundo da eletrônica e biologia 26,27 28,29 usando polímeros condutores que podem conduzir ambas as companhias eletrônicas e iônicas. Uma nova técnica para detectar falhas no tecido barreira usando o OECT 30-32 foi recentemente introduzido. Este dispositivo foi validado contra as técnicas existentes nosed para avaliar a integridade da barreira de tecido, inclusive de imunofluorescência, ensaios de permeabilidade utilizando Lúcifer amarelo, e espectroscopia de impedância usando o Cellzscope. No caso de todos os componentes tóxicos testados, o OECT foi encontrado a operar com uma sensibilidade igual ou melhor, e com o aumento da resolução temporal, em comparação com as técnicas anteriores. Neste dispositivo, PEDOT: PSS, um polímero condutor que tem sido mostrado para ser estável e biocompatível 33,34, é usado como o material activo no canal de transístor. O OECT é composto por eléctrodos de dreno e fonte de cada lado de um canal de polímero condutor. Este é, então, colocada em contacto com um electrólito, o qual constitui parte integrante do dispositivo. Um eléctrodo de porta é imerso no electrólito (Figura 1), e, quando uma tensão de porta positiva é aplicada à porta, catiões de electrólito é forçado para dentro do canal, dedoping assim o polímero condutor, resultando numa alteração na fonte-dreno corrente. O device é, portanto, extremamente sensível a pequenas mudanças no fluxo iónico devido à amplificação do transistor. A camada de células cultivadas em uma inserção de cultura de células foi colocada entre o eléctrodo de porta e o canal de polímero condutor. A presença de uma camada de células intactas actua como barreira para os catiões de entrar no polímero condutor, por conseguinte, na presença de uma monocamada intacta, as quedas de corrente de drenagem (Figura 2: transição da região A para B). Na presença de um composto tóxico, o tecido de barreira vai perder gradualmente a sua integridade, deixando os catiões introduzir na película de polímero e aumentar a corrente de drenagem (Figura 2: região c). Com esta técnica, a ruptura do tecido de barreira é visto pela modulação da corrente de escoamento, correspondente à modulação do fluxo através da monocamada. Este dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iônico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade em tempo real. Este wil tecnologial ser de interesse no domínio da toxicologia para o teste de drogas, diagnóstico de doenças ou pesquisa básica como o modelo de barreira pode ser facilmente adaptado. Este método também ajudará a reduzir a experimentação animal, uma vez que permite a validação de modelos in vitro para substituir os ensaios in vivo.

<table><tbody><tr><td>Clevios pH 1000</td><td>Heraus Clevios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ9260 resina</td><td>Cipec Specialties</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido dodecilbenzenossulfônico (DBSA)</td><td>Acros Organic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Inserto de Cultura de Células Suspensas Millicell&nbsp; PET 0,4 &mu; m Millipore</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços BD Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GPT PES 0.22 &mu; M</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Marca DMEM Avançada GIBCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3434T</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inact.</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3470C</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3524T</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,05% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3513N</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetracético)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol, anidro, 99,8%,</td> células <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184 ELASTÔMERO</td><td></td>DE SILICONE</tr><tr><td>Au (99,99%)</td><td>NEYCO</td><td>AU3X6</td><td></td></tr><tr><td>Cromo (99,95%)</td><td>NEYCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parylene C</td><td>Sistemas de revestimento</td><td></td><td></td> especiais</tr><tr><td>Ag / AgCl fio</td><td>Harvard Aparelho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistente</td><td>Cipec Especialidades</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sensoriamento de barreira rompimento do tecido com um transistor eletroquímica orgânica

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

O tracto gastrointestinal é um exemplo do tecido de barreira, que proporciona uma barreira física contra o ingresso de agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de iões e moléculas necessárias. A quebra neste barreira pode ser causada por uma redução na concentração de cálcio extracelular. Esta redução na concentração de cálcio provoca uma alteração conformacional nas proteínas envolvidas na vedação da barreira, o que leva a um aumento do fluxo paracelular. Para imitar o efeito do cálcio nos quelantes ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N &#39;, N&#39;-ácido acético tetra (EGTA) foi usado em uma monocamada de células que se sabe ser representativa do tracto gastrointestinal. Já existem métodos para detectar o rompimento do tecido de barreira, tais como os ensaios de imunofluorescência e de permeabilidade. No entanto, estes métodos são demorados e dispendiosos e não é adequado para as medições dinâmicas ou de alto rendimento. Métodos eletrônicos para medir o tecido barreiraintegridade existem também para a medição da resistência transepitelial (TER), no entanto, estes são muitas vezes dispendioso e complexo. O desenvolvimento de métodos rápidos, baratos e sensíveis é urgentemente necessário, pois a integridade do tecido barreira é um parâmetro fundamental na descoberta de medicamentos e diagnósticos patógeno / toxina. O transístor eletroquímico orgânico (OECT) integrado com tecido barreira células formadoras tem sido mostrado como um novo dispositivo capaz de monitorar de forma dinâmica a integridade do tecido de barreira. O dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iónico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, em tempo real, como um indicador da integridade do tecido de barreira. Este novo método é baseado num dispositivo simples que pode ser compatível com aplicações de rastreio de elevada capacidade e fabricada a baixo custo.

Durante a primeira etapa de medição, a corrente de escoamento pode variar um pouco, mas na maioria dos casos, deve manter-se estável (Figura 2, parte a). Se o sinal não é estável, o transistor deve ser descartado e substituído. Esta verificação de estabilidade também garante que quaisquer perdas iniciais na condutividade do dispositivo não afetam a medição subseqüente. Depois de vários minutos de medição, a inserção com células formadoras de tecido de barreira é colocada na parte superior do canal. A co...

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N &#39;, N&#39;-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um diagnóstico sensível, rápido e de baixo custo para monitorar a saúde de tecidos de barreira. Isso é alcançado pela fabricação de um transistor eletroquímico orgânico, que pode monitorar rapidamente e com sensibilidade alterações no fluxo de íons em um eletrólito mediante a medição de mudanças na corrente entre a fonte e o dreno do transistor. Como segundo passo, integra-se uma camada saudável de tecido de barreira cultivada sobre um filtro ao dispositivo OECT, permitindo o monitoramento do fluxo de íons através da camada de tecido de barreira, o qual será parcialmente bloqueado se a camada celular estiver saudável.Se um composto tóxico for adicionado, destruindo ou perturbando a camada de tecido de barreira, o fluxo iônico através da camada celular deixará de ser bloqueado. Os resultados obtidos mostram que o OECT pode detectar com sucesso os efeitos tóxicos de um composto modelo, demonstrando que podemos utilizar as medições do transistor como um diagnóstico para monitorar a saúde do tecido de barreira. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a espectroscopia de impedância, é que dispositivos eletrônicos orgânicos têm o potencial de serem produzidos a baixo custo e, portanto, são adequados para triagem de alto rendimento.Demonstrando o procedimento estarão SHA FIA, uma estudante de pós-graduação, e Mark Hamir, um pós-doutorando em meu laboratório. Este método pode fornecer informações sobre as células do epitélio gastrointestinal, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como a pele, o epitélio renal e a barreira de larga banda. A demonstração visual deste método é fundamental como uma etapa necessária para integrar uma camada celular a um dispositivo.Exige manipulação cuidadosa para definir os contatos de fonte e dreno de ouro depositados por evaporação térmica por meio de litografia com levantamento. Primeiro, aplique uma camada de resistência fotográfica por centrifugação em um vidro limpo normal de três polegadas por uma polegada. Gire a 3000 RPM por 30 segundos e aqueça as amostras por 30 segundos a 110 graus Celsius.Em seguida, defina os padrões por fotolitografia utilizando uma máscara dedicada aos contatos de ouro dentro de uma câmara de evaporação. Deposite cinco nanômetros e 100 nanômetros de cromo e ouro, respectivamente. Após isso, remova a fotoresistência.Resista em um banho de acetona por uma hora, deixando o substrato com as áreas de contato de ouro da fonte e do dreno, de modo que apenas o comprimento desejado do canal de PSS-PDOT seja de um milímetro, o que é obtido por meio de uma técnica de remoção com Lene C. Agora, carregue 3,5 gramas de Lene C no equipamento de revestimento. Evapore uniformemente dois mícrons de paralina C sobre o substrato com o contato de ouro para definir o canal por litografia: aplique uma camada de resistente fotográfico por centrifugação a 3000 RPM durante 30 segundos e aqueça o substrato por dois minutos a 110 graus Celsius.Em seguida, defina os padrões utilizando uma máscara dedicada à área do canal. A parte da resistência fotográfica exposta ao UV tornar-se-á solúvel no revelador posteriormente. Grave a Lene C na área do canal expondo-a ao plasma de oxigênio por 15 minutos na câmara, a fim de abrir o canal e o contato de ouro.Em seguida, deposite a solução da mistura de Pdot PSS por meio de centrifugação a 500 RPM durante 45 segundos e aqueça por 30 segundos a 110 graus Celsius. Posteriormente, remova cuidadosamente o Paraline C para expor o canal de Pdot PSS do substrato subjacente. Esse canal deve sobrepor-se ligeiramente ao contato de ouro.Incube as amostras por uma hora a 140 graus Celsius sob condições atmosféricas. Neste procedimento, prepare o PDMS misturando a solução de cura e a solução base na proporção de um para 10 e incube por uma hora a 120 graus Celsius. Em seguida, projete um poço utilizando um furador e corte um quadrado ao redor da área desejada.Em seguida, cole bem A-P-D-M-S sobre o canal para obter uma área de canal de seis milímetros quadrados. Faça um suporte de plástico com um orifício, cole-o sobre o PDMS e deixe secar durante a noite. Em seguida, teste o poço quanto a vazamentos pré-preenchendo com água.Inicie este procedimento preparando primeiro o meio de cultura celular. Em seguida, esterilize o meio de cultura celular utilizando um dispositivo de filtro estéril. Então, mantenha as células Caco-2 no meio de cultura celular entre as passagens 49 e 68 a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO₂.Dilua as células uma vez por semana usando tripsina e semeie com 1,5 vezes 10 à quarta células por inserto. Ao mesmo tempo, troque o meio de cultura celular duas vezes por semana durante três semanas. Agora conecte um fio de prata, cloreto de prata a um medidor de fonte para ser usado como eletrodo de porta.Em seguida, conecte a fonte e o dreno ao medidor de fonte. Em seguida, imerja a ponta em meio de cultura celular, utilizado como eletrólito. Aplique uma tensão positiva em pulso quadrado entre a porta e a fonte.Em seguida, aplique uma tensão constante negativa entre o dreno e a fonte e meça a corrente correspondente. Insira os parâmetros do OECT em um programa personalizado de aquisição. Leia a corrente entre a fonte e o dreno e a corrente de gatilho e realize a medição por vários minutos para garantir um sinal de linha de base estável para a integração celular durante o tempo desativado da medição do OECT.Remova o eletrodo de gaita do eletrólito, em seguida incorpore o inserto de cultura celular e reposicione o eletrodo de gaita dentro do inserto de cultura celular. A seguir, realize uma medição de linha de base com as células por vários minutos para garantir um sinal estável. Esta linha de base será utilizada para o cálculo do valor normalizado correspondente a uma monocamada íntegra.Neste procedimento, adicione a solução de EGTA no volume apropriado para atingir a concentração desejada na câmara basal durante o período de inatividade e realize a medição continuamente conforme descrito anteriormente, por 90 minutos. Se a medição estiver sendo realizada à temperatura ambiente, a estabilidade das células não permanecerá constante após 90 minutos, ao final da corrida. Risque a camada celular para causar a destruição completa da camada de barreira e meça por mais 15 minutos. Esta linha de base será utilizada para o cálculo do valor normalizado correspondente a uma monocamada destruída.Aqui está a visão geral das duas medições INCI da resposta da corrente de drenagem a pulsos quadrados na porta ao longo do tempo. Esta seção corresponde ao OECT operado antes da integração, garantindo a estabilidade do dispositivo. Esta seção corresponde à integração das células formadoras de tecido de barreira, novamente, assegurando um sinal estável antes de iniciar o teste do composto tóxico.Esta seção corresponde à adição de EGTA às células do tecido de barreira, o que representa a evolução do sinal ao longo do tempo. É mostrada aqui a resposta da corrente de dreno do OECT a um único pulso quadrado. Esta figura mostra a resposta transitória do OECT antes e após a adição de células formadoras de tecido de barreira cultivadas em um filtro, e esta figura mostra a resposta transitória do OECT após a adição de um composto tóxico a um tecido de barreira e sem tecido de barreira.Este gráfico mostra os resultados normalizados típicos obtidos a partir do OECT. As respostas normalizadas do OECT foram medidas ao longo de um período de 50 minutos após a introdução do dispositivo, indicada por uma célula em forma de círculo vazio, a camada de células indicada por uma cruz preta, 5 milimolar de EGTA, indicada por um círculo azul escuro, e 10 milimolar de EGTA, indicada por um círculo ciano. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não imaginar uma camada de células com um eletrodo de porta ou pipetando a solução com muita força dentro do inserto de cultura celular.Não se esqueça de que o trabalho com células vivas exige equipamentos de proteção adequados e que os materiais que entram em contato com células vivas devem ser descartados como resíduo biológico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como integrar uma camada de tecido de barreira com o OECT para monitoramento de toxicologia.

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