Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

O objetivo geral deste procedimento é preparar um microscópio padrão de dois fótons para imageamento intravital de alta resolução. Isso é realizado primeiramente alinhando o microscópio, o que inclui ajustar os lasers. Em seguida, o multiplexador de feixe é alinhado para obter uma forma de feixe perfeita e uma configuração adequada do feixe luminoso.

No caso de varredura multifeixe, as imagens brutas são adquiridas ao escanear a amostra com o padrão de iluminação listrado. Por fim, um algoritmo é aplicado para calcular a imagem final de alta resolução. Em última instância, a microscopia de iluminação listrada é utilizada para mostrar detalhes do comportamento do sistema imunológico dentro dos centros germinativos nos linfonodos de camundongos, anteriormente inacessíveis à microscopia intra-vital.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia por iluminação estruturada ou por localização, é que ela pode ser aplicada em grandes profundidades teciduais em amostras vivas. Não requer qualquer modificação na forma do feixe a laser, mantendo assim o método muito simples e fácil de implementar em qualquer microscópio de dois fótons. A montagem utilizada para a microscopia de iluminação listrada de dois fótons com múltiplos feixes é mostrada aqui para alcançar resolução e qualidade de contraste ideais com o menor nível de fotoesbranquiamento e aquisição mais rápida.

Considere fazer ajustes na configuração conforme descrito no protocolo textual. Após realizar os ajustes, verifique se o feixe retorna ao espelho localizado diretamente acima do espelho de entrada, no final do compressor de pulsos baseado em prisma. Após o trajeto da luz ser definido a partir desse ponto, o feixe é refletido para dentro do multiplexador de feixes.

Se estiver realizando iluminação listrada com múltiplos feixes, use microscopia de múltiplos fótons com o scanner desligado. Alinhe os espelhos no multiplexador de feixe colocando uma amostra homogeneamente fluorescente sobre a platina e focalize o feixe laser dentro da amostra, mas próximo à superfície superior. Próximo à lente frontal da objetiva.

Configure o microscópio no modo de múltiplos feixes e escolha o número de feixes e a polarização. Por exemplo, use P para localizar o feixe a laser ao imaginar o lâmina fluorescente, abra o obturador de P e execute continuamente a câmera CCD enquanto focaliza o feixe, garantindo que ele esteja na posição central. Ao alinhar o feixe P, mude para o modo de 64 feixes e abra o obturador correspondente.

Verifique a posição do feixe. Ajuste os espelhos do primeiro ao quinto multiplexador de feixe, garantindo que os feixes estejam igualmente espaçados. Como os algoritmos de iluminação estriada são baseados nessa suposição, substitua a amostra uniformemente fluorescente por uma com estrutura heterogênea.

Por exemplo, colete uma amostra da raiz da área Conval e faça uma imagem multi-feixe. Verifique se a imagem aparece nítida, uniforme e reta. Substitua a amostra heterogênea pela amostra homogênea.

Inicie o scanner XY para controlar o processo de varredura. Para gerar o padrão de excitação em imagem listrada para a varredura com múltiplos feixes. Mova o espelho do scanner Y perpendicularmente à linha iluminada pelo feixe.

Repita o padrão gerado aqui indicado pelo número de blocos movendo o espelho do scanner X, aqui chamado de deslocamento de bloco, para gerar uma imagem retangular listrada. Recoloque a amostra heterogênea e use o scanner como gatilho mestre. Sincronize a câmera com o scanner para adquirir e salvar automaticamente uma imagem listrada, adquirindo repetidamente imagens listradas.

Mova o espelho do scanner X para diferentes posições escolhendo aqui um número suficiente de etapas de repetição, número de deslocamentos e o comprimento de passo adequado. O passo de deslocamento entre duas imagens listradas subsequentes deve cobrir a distância entre duas larguras consecutivas do feixe. Ajuste o deslocamento em X para um valor abaixo do limite de resolução lateral no comprimento de onda de excitação fornecido.

Por exemplo, utilizar 10 passos do espelho do scanner X por deslocamento e 12 ou 13 deslocamentos proporciona a melhor resolução espacial. Ajuste esses dois valores até que a imagem da área conval fique a mais nítida possível. Utilize a ferramenta de perfil de linha nas imagens CCD convencionais e nas imagens calculadas de iluminação em faixas.

Compare a largura dos perfis de linha, que neste exemplo corresponde ao sinal fluorescente das paredes celulares de conval. Adquira cada imagem crua listrada sincronizada com o movimento do scanner e salve-a separadamente, por exemplo, em arquivos TIFF ou binários. Para gerar uma matriz bidimensional da imagem de iluminação listrada de alta resolução, abra um conjunto completo de imagens crua listradas como matrizes na rotina de avaliação.

Utilize o algoritmo de máximo mínimo ou um algoritmo baseado em transformada de Fourier, conforme descrito anteriormente em detalhes, para realizar microscopia multiphoton com iluminação em faixas, múltiplos feixes e em tecidos profundos. Em organismos vivos, adquira imagens em faixas em diferentes profundidades teciduais ao longo do tempo e avalie-as conforme descrito anteriormente, para gerar um filme tridimensional de alta resolução da interação dinâmica entre centro germinativo, células B e células dendríticas foliculares. As dimensões da função de espalhamento pontual efetiva correspondem à resolução espacial de um microscópio.

Medimos essa função tridimensional adquirindo either o sinal de geração de segundo harmônico das fibras de colágeno ou o sinal fluorescente de microesferas de poliestireno de 100 nanômetros emitindo em 515 nanômetros em linfonodos mion. Utilizando nossa microscopia de varredura a laser T-P-L-S-M com iluminação em faixas múltiplas em comparação com técnicas estabelecidas de microscopia de varredura a laser de dois fótons, como a detecção de campo T-P-L-S-M por meio de câmeras CCD e a detecção pontual T-P-L-S-M. A partir dessas medições, torna-se evidente que na superfície do espécime, tanto a resolução lateral quanto a axial correspondem aos valores esperados previstos pela teoria da difração.

No entanto, com o aumento da profundidade de imagem, e consequentemente com o aumento do caminho óptico tanto da radiação de excitação quanto da emissão através de um meio com índices de refração altamente variáveis, a resolução espacial deteriora consideravelmente, independentemente da configuração utilizada. Utilizando a M-B-S-I-T-P-L-S-M independentemente da profundidade de imagem, alcançamos aproximadamente 20% de resolução lateral melhor e 220% de resolução axial melhor. Em comparação com as abordagens padrão de T-P-L-S-M.

A seleção clonal de linfócitos B durante a resposta imune nos órgãos linfoides secundários de camundongos adultos é a primeira etapa do seu caminho para se diferenciarem em linfócitos B de memória ou em plasmócitos. Nesse processo, acredita-se que a interação altamente dinâmica entre células dendríticas foliculares e linfócitos B, ao nível das estruturas de complexos imunes nos centros germinativos, desempenhe um papel central. Somente com o uso de uma tecnologia de microscopia intravital de alta resolução é possível analisar essa comunicação celular e suas implicações para a resposta imune, observada aqui por marcação com anti-CD21/35 FAB ATO590 em células dendríticas foliculares.

O M-B-S-I-T-P-L-S-M oferece, pela primeira vez, a possibilidade de visualizar e quantificar in vivo as dimensões dos aglomerados de depósitos de complexos imunes em profundidades de até 120 mícrons nos centros germinativos de linfonodos poplíteos. Essas imagens mostram a comparação direta entre as imagens de fluorescência tridimensionais dos depósitos de complexos imunes em um centro germinativo, obtidas por meio de PMT convencional e pelo M-B-S-I-T-P-L-S-M. Além disso, as interações dos depósitos de complexos imunes com linfócitos B do centro germinativo puderam ser altamente resolvidas e agora podem ser investigadas em combinação com sondas funcionais intravital para proliferação, diferenciação ou apoptose.

Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que, com uma técnica baseada em detecção por câmera, a velocidade de aquisição é aproximadamente oito vezes maior, enquanto a profundidade máxima de imagem é cerca de 25% menor do que a obtida com um microscópio padrão de múltiplos fótons baseado em fotomultiplicador. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar seu microscópio multifotônico para funcionar com o método de iluminação estriada, incluindo o ajuste do trajeto óptico do microscópio, o alinhamento das grades de feixe, o cálculo dos parâmetros de varredura e as formas de calcular a imagem final de alta resolução. Para experimentos intravitais em tecidos profundos.