Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

O objetivo geral deste procedimento é utilizar orientação por ultrassom para estabelecer um modelo de camundongo de metástase cerebral de câncer de mama que possa então ser monitorado por ressonância magnética. Isso é realizado coletando células de câncer de mama com tropismo encefálico e injetando-as no ventrículo esquerdo. Com a ajuda da orientação por ultrassom, o desenvolvimento tumoral intracraniano é então monitorado.

Utilizando ressonância magnética, as metástases são confirmadas por coloração com hematoxilina e eosina. Em última análise, a injeção guiada por imagem pode aumentar significativamente o sucesso no monitoramento, formação e desenvolvimento de metástases cerebrais de câncer de mama. A ressonância magnética longitudinal permite o monitoramento não invasivo da formação e do desenvolvimento do câncer de mama.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade do Texas em Southwestern. Para este protocolo, prepare células M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P cultivadas em meio DMEM contendo 10%FBS, 1%glutamina e 1%penicilina. Estreptomicina sempre monitore a condição das células e troque o meio a cada dois ou três dias. Quando for obtida confluência de 80%, trypsinize e colete as células.

Primeiro, remova completamente o meio antigo por pipetagem a vácuo. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS para lavar suavemente as células até que todas as células estejam cobertas pelo PBS. Depois, remova a lavagem.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tripsina ao recipiente. Incline suavemente o recipiente para garantir que todas as células fiquem cobertas pela tripsina. Coloque o recipiente novamente no incubador celular a 37 graus Celsius.

Aguarde um minuto e observe as células ao microscópio. Se estiverem arredondadas e flutuando, já se desprendeu. Adicione três mililitros de meio para interromper a digestão e pipete a mistura celular para um tubo de centrífuga.

Centrifugue a mistura a 1.160 ×g por cinco minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o meio utilizando uma pipeta a vácuo. Depois, ressuspenda suavemente as células em cinco mililitros de meio livre de soro usando uma pipeta, até que nenhum pellet celular aparente possa ser visto e a solução pareça homogênea a 50 microlitros da mistura celular.

Adicione 50 microlitros de azul de tripano uma vez completamente misturado. Adicione alíquotas de 10 microlitros a vários lâminas para contagem de células. Em seguida, conte as células com base nos valores do contador de células.

Calcule e utilize a média de todas as contagens por onça. Agora, prepare uma suspensão celular mais precisa. Centrifugue novamente e re-suspenda em 175.000 células por 100 microlitros de meio livre de soro.

Em seguida, armazene as células em gelo para a injeção intracardíaca. Para este protocolo, utilize camundongos fêmeas BC nus, com seis a oito semanas de idade. Faça login no sistema de imagem e inicialize o transdutor.

7 0 4 a 40 megahertz. Inicie um novo estudo e preencha os campos de informação conforme indicado. Em seguida, anestesie o camundongo e administre o anestésico por meio de um cone nasal.

Durante a injeção guiada, ajuste a temperatura da mesa de imagem para 37 graus Celsius e fixe o camundongo na mesa em posição supina. Mantenha o gel de ultrassom a 37 graus Celsius antes da aquisição de imagens e aplique um pouco sobre o tórax do camundongo. Agora, monte o transdutor no suporte e abaixe-o até a profundidade de imagem desejada.

Em seguida, mova a platina até identificar o ventrículo esquerdo com a aorta ascendente como ponto de referência, travando a platina na posição em que a imagem estiver mais nítida. Agora, aspire 100 microlitros da mistura celular gelada em uma seringa de um mililitro com agulha de 22 graus. Fixe a seringa carregada no suporte para seringa.

Em seguida, mova a seringa em direção ao tórax. E antes de penetrar no camundongo, mova-a cuidadosamente para os lados até que a ponta da agulha esteja no campo de visão da imagem. Ajuste a altura e o ângulo da agulha para atingir o ventrículo esquerdo e, quando posicionada corretamente, introduza rapidamente a agulha através das camadas de pele e músculo até o ventrículo esquerdo.

Sob a orientação da imagem de ultrassom, um indicativo de inserção bem-sucedida no ventrículo esquerdo é o refluxo de sangue arterial de cor rosa-avermelhado claro para dentro da seringa. Em seguida, injete lentamente a mistura celular ao finalizar, retire a agulha, levante o transdutor e limpe o gel de ultrassom com gaze umedecida. Depois, solte o animal da fita e transfira-o para uma gaiola limpa com uma placa pré-aquecida.

Observe o camundongo até que ele se recupere completamente e, posteriormente, verifique-o diariamente por alguns dias. Utilizando uma resolução plana de 78 mícrons quadrados, lesões hiperintensas na ressonância magnética podem ser identificadas com diâmetro de 310 mícrons. Como as metástases neste estudo eram muito pequenas e a necrose e o edema eram mínimos, a lesão hiperintensa nas imagens ponderadas em T2 representava verdadeiramente o tumor.

Estudos longitudinais de MRI em massa permitem a avaliação não invasiva in vivo do crescimento tumoral. A ressonância magnética de alta resolução conseguiu detectar várias lesões pequenas três semanas após a injeção intracardíaca; na semana quatro, todas as lesões vistas no exame anterior tornaram-se maiores. Mais lesões novas surgiram nas imagens ponderadas em T2.

A coloração com H e E revelou lesões metastáticas difusas ou a coloração com H e E revelou lesões metastáticas do tipo agregado. Vasos ampliados eram frequentemente observados ao redor do tumor, indicando que estava ocorrendo angiogênese não por brotamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma injeção guiada por imagem de ultrassom no ventrículo esquerdo do coração de um camundongo.