Name: Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a criar um modelo de metástase cerebral de cancro de mama em rato utilizando injeção intracardíaca guiada por ecografia e monitorização longitudinal por ressonância magnética de alta resolução.

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Somos gratos aos drs. Diane Palmieri e Patricia Steeg de NCI por nos fornecer as células MDA-MB231Br. Agradecemos ao Dr. Ralph Mason, Sr. Jason Reneau ea Sra. Ramona Lopes para o suporte técnico e colegial. Este trabalho foi financiado em parte pelo IDEA DOD Prêmios W81XWH-08-1-0583 e W81XWH-12-1-0317. Experimentos de ressonância magnética foram realizados no Centro de Pesquisa de Imagem avançada, uma facilidade NIH BTRP # P41-RR02584 e injeção intracardíaca guiada por ultra-som foi realizada com VisualSonics Vevo 770 sob 1S10RR02564801.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care Institucional e uso. 1. Preparação das Células MDA-MB231/Br-GFP <ol><li> Recuperar e cultura das células MDA-MB231/Br-GFP (gentilmente cedidas pelos Drs. Palmieri e Steeg, NCI) em meio DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Observar o estado das células e cor de meio, e substituir meio cada 2-3 dias. </li><li> Tripsinizar e recolher as células, quando 80% de confluência é alcançado como descrito nas etapas 1.3.1-1.3.5: <ol><li> Remover o meio antigo por completo e adicione 5 ml de PBS (1x) para lavar as células suavemente. Remover o PBS a partir do prato. </li><li> Adicionar 1,5 ml de tripsina no prato; inclinar o prato suavemente para assegurar que todas as células são cobertas por tripsina. Coloque o prato de volta na incubadora celular e mantê-la a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Leve o prato de incubadora e observaras células em microscópio óptico para assegurar que as células separar do prato. </li><li> Adicionar 3 ml de meio para parar o efeito de tripsina. Recolhe-se a mistura de células num tubo de centrífuga. Centrifugar a mistura a 2000 rpm durante 5 min. </li><li> Retire cuidadosamente o meio e ressuspender as células em 5 ml de soro meio livre até ficar homogéneo. </li></ol></li><li> Contar o número apropriado de células e ressuspender-los em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1,75 x 10 5 células em 100 uL de volume. <ol><li> Tome 50 mistura de células mL e adicionar 50 ul Trypan Blue. Após a mistura, levar de 10 mL mistura e adicione cuidadosamente para o slide contagem das células. Use várias amostras para garantir a estimativa do número de células precisa. </li><li> Fique no slide contagem de células, uma extremidade de cada vez eo contador de células começa a contar automaticamente. Tome média de todos os resultados de contagem e calcular o número total de células. </li><li> Centrifugar as células novamente e ressuspender-los emo volume apropriado de meio isento de soro para resultar na concentração final de 1,75 x 10 5 células/100 uL de volume. </li></ol></li><li> Colocar as células em gelo antes da injecção intracardíaca. </li></ol> 2. Ecografia-guiada injeção intracardíaca <ol><li> Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semanas de idade. </li><li> Entrar no sistema de imagem. Inicializar o transdutor 704 (40 MHz). </li><li> Iniciar um novo estudo e preencher as informações. </li><li> Anestesiar (3% isoflurane/100% O 2 em uma câmara de indução) e manter os animais com isofluorano (2%) em 100% de O2 (1 dm 3 / min) durante todo o processo por meio de um cone de nariz. A anestesia é confirmado quando há reflexo de retirada é observado com toe pitada. </li><li> Regule a temperatura da tabela de imagem de 37 ° C. Tape o rato anestesiado com a tabela de imagem aquecido em posição supina. </li><li> Manter o gel de ultra-sons a 37 ° C antes de imenvelhecimento. Aplique o gel para o peito do mouse. </li><li> Monte o transdutor no suporte. Diminuir o transdutor até a profundidade da imagem desejada seja atingida. Mover a etapa até que o ventrículo esquerdo é identificado com a aorta ascendente, como o ponto de referência (Figura 1A). Bloquear o estágio em que uma visão clara do ventrículo esquerdo é visualizado. </li><li> Desenhar 100 ul de mistura de células para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 22. Coloque e fixar a seringa na seringa de montagem. </li><li> Mova a seringa para a frente em direção ao peito do mouse e mova-o com cuidado lado para o outro até que a ponta da agulha está no campo de imagem de visão (antes de entrar no mouse). </li><li> Ajuste a altura da agulha e ângulo para apontar para baixo do ventrículo esquerdo. </li><li> Penetrar a agulha da seringa no espaço intercostal prontamente através de camadas da pele e do músculo para o ventrículo esquerdo, sob a orientação de ultra-sonografia. Uma indicação de uma inserção bem sucedida da agulha no interior do ventrículo esquerdocle é o refluxo do sangue arterial fresco (cor-de-rosa, em contraste com o sangue venoso vermelho escuro) com a seringa </li><li> Injectar a mistura de células lentamente (Figura 1B). </li><li> Após a conclusão, retirar a agulha, levante o transdutor, limpe o gel de ultra-som com gaze umedecida e remova a fita. </li><li> Prepare uma gaiola limpa com um bloco pré-aquecido. </li><li> Colocar o animal na almofada e observar o animal até a recuperação total. </li><li> Monitorar o comportamento do animal a cada 24 horas, por dois dias. </li><li> Condições gerais e sinais neurológicos de complicações em ratinhos experimentais são rotineiramente monitorados. </li></ol> 3. Monitoramento MRI de desenvolvimento do tumor intracraniano <ol><li> Use um ímã 9,4 Tesla para monitorar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais. </li><li> Iniciado MRI duas semanas após a implantação do tumor e repita uma vez por semana por até três semanas. </li><li> Sedar os animais com 3% de isoflurano e mantê-los sob geneanestesia geral (1,5% de isoflurano). </li><li> Monitorar e manter a temperatura do corpo do animal e constante da respiração durante todo o experimento. </li><li> Multislice de alta resolução (14 fatias com 1 mm de espessura, sem intervalo) T 1 - T 2 e ponderada imagens coronais, que abrange a região do lobo frontal para a fossa posterior, são adquiridos com os seguintes parâmetros: 1-T imagens ponderadas: girar eco fatia múltipla (SEMS), TR / TE = 400 ms msec/20, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 mM 2. T imagens 2-ponderada: rotação rápida eco fatia múltipla (FSEMS) seqüências, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trens eco, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 ^ M 28,9. Lesões tumorais parecem mais brilhantes do que os tecidos normais do cérebro em t imagens 2-ponderados. </li><li> O tamanho do tumor é determinado em t imagens 2-ponderados por delinear manualmente o acesciamento porção da massa em cada imagem usando programas MATLAB escritos por nós 8. Dado a maior parte do tumor diâmetros são menores do que a espessura da fatia (1 mm), o tamanho do tumor apresenta-se como na área do plano, em vez de o volume. </li></ol> 4. H &amp; E coloração Confirmando as metástases <ol><li> Sacrificar os ratos imediatamente após a última MR varredura, dissecar os cérebros portadores de tumor e incorporá-lo em meio outubro e congelado em -80 ° C. </li><li> Seção de uma série de 10 m de espessura cérebro coronal amostras com criostato. </li><li> Realize H &amp; E coloração nas seções do cérebro. </li></ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).</li>
<li>Lockman, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+blood-tumor+barrier+permeability+determines+drug+efficacy+in+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).</li>
<li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bone-seeking+clone+exhibits+different+biological+properties+from+the+MDA-MB-231+parental+human+breast+cancer+cells+and+a+brain-seeking+clone+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in.</a> 16, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).</li>
<li>Percy, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+changing+blood-tumor+barrier+permeability+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis%3A+a+complementary+magnetic+resonance+imaging+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach.</a> Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+evaluation+of+intracranial+development+and+vascular+characteristics+of+breast+cancer+brain+metastases+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+near-infrared+optical+imaging+of+2-deoxyglucose+uptake+by+intracranial+glioma+of+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Zhang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+brain+metastases+produced+by+human+neoplasms+implanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice.</a> Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).</li>
<li>Mason, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oximetry%3A+comparison+of+19F+MR+EPI+and+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

No presente estudo, demonstramos que a injeção ventricular esquerda guiada por ultra-sonografia garante a precisão de modo que todos os animais do estudo desenvolveram metástases cerebrais e morte do animal não foi observada. A beleza da injeção guiada por imagem é que o caminho da penetração da agulha da pele e, finalmente, para o ventrículo esquerdo pode ser monitorado e ajustado sob a imagem, o que é distinto do procedimento manual que exige rigorosos marcos anatômicos para seguir. Entend...

Metástase cerebral é a doença maligna intracraniana mais comum em adultos. O prognóstico é extremamente pobre, com uma sobrevida média de 4-6 meses, mesmo com o tratamento agressivo. O câncer de mama é um dos três principais tipos de câncer primário com alta morbidade da metástase cerebral 1-3. Várias linhas de câncer de mama cérebro-trópicos são capazes de desenvolver metástases cerebrais após intracardíaca ou injeção intracarotídeo 4. Injeção direta de células tumorais para o ventrículo esquerdo pode ignorar o leito capilar pulmonar e, assim, aumentar a incidência de formação de metástases cerebrais, minimizando metástases viscerais. A linha MDA-MB231Br é uma das linhas de cancro da mama humanas mais utilizados para desenvolver metástase cerebral em modelos de roedores 5,6. Como muitos outros estudos 4,7, temos realizado um procedimento manual de injeção intracardíaca em nossos estudos anteriores. No entanto, apenas 50% taxa de sucesso foi obtido com o manualinjecção e uma fracção de ratinhos morreram devido aos procedimentos invasivos repetidos se os ensaios anteriores falharam. Aqui, estamos introduzindo o uso de um procedimento guiado por imagem para garantir a injeção de células de câncer de mama em busca do cérebro para o ventrículo esquerdo do rato atímico. Longitudinal alta resolução de ressonância magnética é aplicada a acompanhar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais.

<table><tbody><tr><td></td><td>DMEM HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Mediatech</td><td>25-051-C1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador automático de células</td><td>BioRad</td><td>TC10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter International Inc.</td><td>1001936060</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem de Alta Resolução VisualSonics Vevo 770</td><td>Visual Sonics Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ímã de furo horizontal de 9,4 T com um sistema Varian INOVA Unity&nbsp;</td><td>A Agilent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Composto O.C.T</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral seguido por longitudinal mri

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Metástases cerebrais de câncer de mama, que ocorre em 30% dos pacientes com câncer de mama em estágio IV, está associada com alta mortalidade. A sobrevida média é de apenas 6 meses. É crítico para ter modelos animais adequados para imitar a propagação hemodinâmico das células metastáticas no cenário clínico. Aqui, estamos introduzindo o uso de ultra-sonografia pequeno animal para guiar uma injeção precisa do cérebro células de câncer de mama tropical para o ventrículo esquerdo de ratos pelados atímicos. RM longitudinal é usado para avaliar a iniciação intracraniana e crescimento de metástases cerebrais. Injeção intracardíaca de ultra-som-guiada garante não só uma injeção precisa e vem uma taxa de sucesso mais elevada, mas também diminuiu significativamente a taxa de mortalidade, em comparação com o nosso procedimento manual anterior. In vivo alta resolução de ressonância magnética permite a visualização de lesões multifocais hiperintensas, tão pequeno quanto 310 mM de diâmetro em T imagens 2-ponderadas em 3 semanas após a injecção. Follow-se a RM revela crescimento do tumor intracraniano e aumento do número de metástases que distribuem ao longo de todo o cérebro.

Com a elevada resolução espacial de ressonância magnética (78 mM de resolução do plano), lesões de hiper-intensas podem ser identificados tão pequeno quanto 310 um de diâmetro (Figura 2). Desde as metástases neste estudo são muito pequenos e desenvolvimento de necrose e edema é mínima, a lesão hiperintensas em T imagens 2-ponderados realmente representava a massa tumoral. Exames de ressonância magnética permitem longitudinais na avaliação não invasiva <em...

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar orientação por ultrassom para estabelecer um modelo de camundongo de metástase cerebral de câncer de mama que possa então ser monitorado por ressonância magnética. Isso é realizado coletando células de câncer de mama com tropismo encefálico e injetando-as no ventrículo esquerdo. Com a ajuda da orientação por ultrassom, o desenvolvimento tumoral intracraniano é então monitorado.Utilizando ressonância magnética, as metástases são confirmadas por coloração com hematoxilina e eosina. Em última análise, a injeção guiada por imagem pode aumentar significativamente o sucesso no monitoramento, formação e desenvolvimento de metástases cerebrais de câncer de mama. A ressonância magnética longitudinal permite o monitoramento não invasivo da formação e do desenvolvimento do câncer de mama.Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade do Texas em Southwestern. Para este protocolo, prepare células M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P cultivadas em meio DMEM contendo 10%FBS, 1%glutamina e 1%penicilina. Estreptomicina sempre monitore a condição das células e troque o meio

ultrasound-imaging-guided-intracardiac-injection-to-develop-mouse

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Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Na patogénese da metástase óssea, a angiogénese é um processo crucial e, portanto, representa um alvo para imagiologia e terapia. Aqui, apresentamos um modelo do rato de site-specific metástases ósseas de câncer de mama e descrever as estratégias para não-invasiva angiogênese...

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Microbolhas mediada ruptura ultra-som focalizado da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​é uma técnica promissora para não-invasivo de entrega de drogas alvo no...

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

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